Sunteți pe pagina 1din 168

Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor

infectioase, subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu,
aparut la Editura Medicala, Bucuresti, 2018.

1. INTRODUCERE

Virusurile reprezintã o clasã heterogenã de agenți infectioși, care paraziteazã omul,


animalele, plantele și bacteriile (bacteriofagi).
Caracteristici comune (1, 2):
1. parazitism strict intracelular- virusurile nu au sisteme proprii de furnizare/stocare de
energie, sunt dependente de aparatul enzimatic celular și de sursele de energie celularã pentru
multiplicare.
2. dimensiuni reduse (de ordinul nanometrilor), motiv pentru care virusurile sunt ultrafiltrabile
si vizibile doar in microscopie electronica.
Singura exceptie este reprezentata de mai nou descoperitele virusuri gigant, cu talie
foarte mare si structura extrem de complexa, ce include si adevarate uzine de sinteza proteica
proprie). Acestea virusuri ADN sunt incadrate in noul ordin Megavirales, (nucleocytoplasmic
large DNA viruses), cu mai multe genuri distincte: Mimivirus (mimiking microbe), Mollivirus,
Marseillevirus, Pandoravirus, Pithovirus, Faustovirus (3). Majoritatea infecteaza protozoare
din genul Acanthamoeba, fiind izolate din diferite medii acvatice și sedimente. Nu este clar in
ce masura aceste virusuri gigant sunt patogene pentru om (4), desi initial au fost identificate
intr-un episod epidemic de pneumonii in Anglia (5).

3. structura simpla- virusurile sunt alcatuite din genom-reprezentat de un o singura specie de


acid nucleic- fie ADN (dezoxiribovirusuri), fie ARN (ribovirusuri)- și mai multe învelișuri
proteice (obligatoriu capsida, facultativ anvelopa si o serie de inveliuri pericapsidare).
Genomul este suportul infectivitatii virusurilor, iar proteinele virale sunt suportul antigenicitatii
acestora (2).
Capsida este un invelis viral obligatoriu, de natura strict proteica, alcatuit din mai multe
subunitati identice- capsomere (proteine codificate de acidul nucleic viral), asamblate dupa
regulile simetriei (helicoidale sau icosaedrice). Capsida este codificata integral de genomul
viral.
Anvelopa este un invelis viral facultativ (exista virusuri anvelopate si virusuri
neanvelopate), de natura glico-lipido-proteica. Anvelopa include atat structuri codificate de
genomul viral, cat si portiuni lipidice preluate din membrana celulei infectate, în cursul
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor
infectioase, subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu,
aparut la Editura Medicala, Bucuresti, 2018.

eliberãrii virionilor. Virusurile neanvelopate, datorita structurii externe exclusiv proteice, sunt
mult mai stabile in mediul extern comparativ cu virusurile anvelopate, fiind rezistente la variatii
mari de temperatura, la pH acid si la actiunea enzimelor proteolitice si a detergentilor.

2. REPLICAREA VIRUSURILOR
Replicarea virusurilor este un proces complex și diferit în funcție de sistemul virus – celulã
gazdã. O singura particulã initiala, numita virion parental, da nastere, in urma replicarii, unui
numar urias (pana la cateva zeci- sute de mii) de particule infectante noi, numite virioni
progeni. Schematic ciclul replicativ viral poate fi impartit in 3 etape distincte (1, 2, 6):
1.Eclipsa cuprinde: (a) adsorbtia virionului parental la receptori celulari specifici-proteine
situate pe membrana celulei gazdă; (b) internalizarea in celula gazda si (c) decapsidarea-
separarea acidului nucleic viral de invelisurile proteice.
Tropismul viral este rezultatul cuplării receptorilor celulari de către proteine virale existente
pe capsida sau anvelopa virală. Fiecare virus utilizeaza receptori specifici: ex: virusul rabic –
receptorii pentru acetilcolina, virusul HIV- moleculele CD4, virusul gripal -receptori pentru
acid sialic. Adsorbția inițialã a virionilor la receptorii celulei gazdã determinã modificãri
conformaționale ale proteinelor virale, care expun noi domenii, capabile sa cupleze alte
molecule de pe membrana celulei, numite coreceptori.
Susceptibilitatea la infecții este dependentă de densitatea receptorilor. Unele virusuri sunt
pantrope – pot infecta celule sau țesuturi de la specii animale diverse – altele sunt patogene
numai pentru om (uneori și pentru maimuțe hominoide). In general receptorii sunt specifici
fiecarei specii, insa, în urma contactului repetat al omului cu animale infectate, se poate realiza
depășirea barierei de specie. Astfel s-au adaptat la om tulpini de virusuri gripale aviare sau
suine, precum si coronavirusrurile zoonotice SARS CoV, MERS CoV si SARS CoV-2.
Internalizarea se realizeaza fie prin endocitoza, in cazul virusurilor neavelopate (in acest
caz, cel mai frecvent se produce o redistribuire a receptorilor membranari, iar celula gazda
transporta virionul intr-o vezicula endocitara catre lizozomii intracitoplasmatici, la acest nivel
avand loc degradarea invelisurilor proteice virale), fie prin fuziune, in cazul virusurilor
anvelopate (acestea au proteine transmembranare specializate- factori de fuziune -ce amesteca
lipidele mebranare cu cele din anvelopa virala, creind o punte de legatura intre virion si celula,
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor
infectioase, subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu,
aparut la Editura Medicala, Bucuresti, 2018.

prin care acidul nucleic viral patrunde in interiorul celulei, iar invelisurile proteice raman in
exterior, fiind degradate).
Decapsidarea este separarea fizica a acizilor nucleici virali de invelisurile proteice. In
citoplasma celulei gazda ramâne doar genomul viral parental, servind ca matrițã pentru faza de
crestere logaritmica.

Etapa de crestere logaritmica are drept scop sinteza de noi acizi nucleici virali si de noi
proteine virale.
Virusurile ADN se replicã de regulã în nucleu (cu exceptia poxvirusurilor); iar virusurile ARN
în citoplasma (cu exceptia orthomixovirusurilor).
In cazul virusurilor cu genom ADN, sinteza noilor acizi nucleici virali se face sub actiunea
unor ADN polimeraze care provin cel mai frecvent din celula gazda, exista insa si ADN
polimeraze virale- este cazul herpesvirusurilor si al poxvirusurilor. Virusurile ADN sunt
dependente de stadiul ciclului celular pentru acces la polimerazele gazdei; cu toate acestea
exista si virusuri capabile de replicare in celule in repaus sau in stadii de diferentiere terminala
(ex: unele herpesvirusuri se replica in neuroni). Alte virusuri codifica proteine timpurii capabile
sa inhibe genele celulare responsabile de controlul ciclului celular- acestea au capacitate
oncogena (ex: papilomavirusurile). Virusurile ARN isi codifica propriile ARN polimeraze
care vor sintetiza noii acizi nucleici virali. ARN polimerazele virale fac numeroase erori in
timpul copierii acidului nucleic viral, si nu au mecanisme de corectie a acestor incorporari
gresite de nucleotide, astfel incat replicarea virusurilor ARN este caracterizata de variabilitate.
Fidelitatea replicãrii este mult mai mare la virusurile ADN, care sunt mult mai stabile din punct
de vedere antigenic.
Indiferent de tipul de genom, virusurile trebuie sa sintetizeze un ARNm care serveste drept
matrita pentru sinteza proteinelor virale. Exista doua tipuri de proteine virale sintetizate la
nivelul ribozomilor celulari (2,6):
- proteine timpurii, cu rol enzimatic, ce inhiba procesele celulare si faciliteaza sinteza
componentelor virale, participand si la formarea incluziilor virale- centrii ai replicarii virale in
interiorul citoplasmei sau nucleului celular, utilizate in diagnosticul microscopic al infectiei
virale in cursul izolarii pe culturi de celule sau in biopsii din tesuturile afectate.
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor
infectioase, subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu,
aparut la Editura Medicala, Bucuresti, 2018.

-proteine tardive, structurale ce vor intra in componenta invelisurilor proteice ale noilor
virioni –capsida, respectiv anvelopa.
In functie de stategia utilizata pentru sinteza ARNm sunt definite 7 clase de virusuri (8):
I. ADNds (ex: adeno, herpes, poxvirusuri), care utilizeaza o enzima celulara, ARN pol
II pentru sinteza de ARNm
II. ADNss (ex: parvovirusuri), care utilizeaza ADN polimeraza celulara pentru sinteza
unui ADNds, si, ulterior, ARN pol celulara pentru sinteza de ARNm
III. ARNds (ex: reovirusuri) care sintetizeaza o ARN polimeraza ARN dependenta, ce
va determina sinteza de ARNm si va conduce replicarea genomului
IV. ARNss (+) -virusuri ARN monocatenare cu polaritate pozitiva- ex: Picorna,
Flavi, Calicivirusuri), la care genomul parental serveste direct ca ARN mesager, iar
replicarea incepe direct cu traducerea proteinelor virale nonstructurale, cu rol
enzimatic, intre care si o ARN-polimeraza virus-codificata, ce va conduce replicarea
acidului nucleic.
V. ARNss(-) virusuri ARN monocatenare cu polaritate negativa (ex: Ortho si
Paramixovirusuri)-care au o enzima virala preformata, introdusa in celula gazda
impreuna genomul parental: transcriptaza (replicaza) virala . Aceasta transcriptaza
determina sinteza unei copii complementare a genomului, care serveste ca ARNm
si este matrita pentru traducerea proteinelor nucleocapsidare. Acestea vor acoperi
genomul parental, ancorand ARN polimeraza virala si declansand sinteza de noi
acizi nucleici virali.
VI. Virusuri ARNss+ care se replica printr-un intermediar ADN (Retrovirusuri).
Aceste virusuri codifica o reverstranscriptaza, enzima ce sintetizeaza un ADN
proviral pe matrita genomului parental. ADN proviral este translocat in nucleul
celulei tinta si se va integra, sub actiunea altei enzime virale -integraza, in genomul
celular. Activarea sa, cu initierea transcrierii, in urma careia rezulta mai multe specii
de ARNm- una care reprezinta noul genom progen, celelalte traduse in proteine
virale, se face sub actiunea concertata a unor factori celulari si virali, codificati de
gene reglatorii.
VII. Virusuri ADNds care se replica printr-un intermediar de tip ARN
(Hepadnavirusurile). Aceste virusuri prezinta o polimeraza virala extrem de
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor
infectioase, subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu,
aparut la Editura Medicala, Bucuresti, 2018.

complexa, multifunctionala care serveste si ca reverstranscriptaza. Aceasta replicare


este caracteristica virusului hepatitic B (VHB)

3. Faza de platou cuprinde (a) maturarea proteinelor structurale pentru alcatuirea invelisurilor
noilor virioni, (b) asamblarea acidului nucleic viral cu invelisurile proteice si (c) eliberarea
virionilor progeni (prin citoliza, in cazul virusurilor neavelopate, sau prin inmugurire, in cazul
celor anvelopate).

Bibliografie

1. Knipe DM, Howley PM (editors in chief)-Fields Virology, 6th edition, 2013, Editura Wolters Kluwer
|Lippincott Williams Wilkins.
2. Cernescu C. Virusologie Medicala, 2012, Editura Medicala, 2012.
3. Colson P, La Scola B, Levasseur A, Caetano-Anollés G, Raoult D. Mimivirus:leading the way in the
discovery of giant viruses of amoebae. Nat Rev Microbiol. 2017;15(4):243-254.
4. Vanspauwen MJ, Schnabel RM, Bruggeman CA, et al. Mimivirus is not a frequent cause of ventilator-
associated pneumonia in critically ill patients. J Med Virol. 2013;85(10):1836-41.
5. Raoult D, La Scola B, Birtles R. The discovery and characterization of Mimivirus, the largest known
virus and putative pneumonia agent. Clin Infect Dis.2007;45(1):95-102.
6. Cernescu C, Ruta S. Curs Concis de Virusologie, 2002, Editura Universitatii Carol Davila.
7. Bush S, Tebit DM. HIV-1 Group O Origin, Evolution, Pathogenesis, and Treatment: Unraveling the
Complexity of an Outlier 25 Years Later. AIDS Rev. 2015;17(3):147-58.
8. Baltimore D. Expression of animal virus genomes. Bacteriological Reviews. 1971;35(3):235-241.

2. Imunitatea ntivirala- Mecanismele rezistentei la viroze

Mecanismele apararii antivirale se bazeaza pe efectori ai rezistentei nespecifice (innascute,


care opereazã similar indiferent de tipul de microorganism) și efectori ai rezistentei specifice
(dobandite, indreptate specific impotriva unui anumit patogen), care actioneaza sinergic (1,2).
Rezistenta nespecifica in viroze este asigurata in principal de sinteza de interferoni (o familie
de glicoproteine cu rol antiviral, imunomodulator si anticelular) si de actiunea celulelor NK
(natural killer), care asigura liza celulelor infectate viral.
Recunoasterea patternurilor moleculare specifice patogenilor- PAMPs (pathogen-associated
molecular patterns) de catre receptorii specifici PRR (Pattern recognition receptors- in cazul
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor
infectioase, subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu,
aparut la Editura Medicala, Bucuresti, 2018.

virusurilor- receptori membranari TLR (Toll-like) sau citoplasmatici- RIG-I (retinoic acid-
inducible gene 1 protein)- o ARN helicaza- implicata in alterarea structurii secundare a
ARNm), initiaza o cascada de semnalizare, ce va duce la activarea unui factor de transcriere-
IRF-3 (interferon regulatory factor-3) sub influenta caruia se exprima genele pentru interferoni.
Odata sintetizati, interferonii se leaga la receptori specifici si activeaza calea de semnalizare
Jak (Janus kinase)- STAT (signal transducer and activator of transcription), care duce la
expresia genelor stimulate de interferon (ISG- interferon stimulated genes- ex: 2′–5′
oligoadenilat sintetaza, proteinkinaza dependent de ARNds, proteinele Mx). Aceastea mediaza
actiunea antivirala si anticelulara a interferonului, inducand o stare de rezistenta la replicarea
virala in celulele invecinate, prin facilitarea degradarii ARNm si inhibarea sintezei proteice (3).
Interferonul recombinant, utilizat in clinica, are acelasi mecanism de actiune ca al interferonului
endogen, dar atinge concentratii mult mai mari in vivo, ceea ce creste eficacitatea actiunii
antivirale.

Rezistenta specifica este mediata de:


- sinteza anticorpilor antivirali de catre limfocitele B transformate in plasmocite
- actiunea limfocitelor T helper (CD4 pozitive) si T citotoxice (CD8 pozitive).

Imunitatea celulara joaca rolul cel mai important in cursul infectiilor virale. Existã unele
anomalii congenitale ale rãspunsului imun care se traduc fie prin lipsa sintezei anticorpilor
(agamaglobulinemie), fie prin lipsa unor celule imunocompetente. Copiii cu
agamaglobulinemie pot vindeca virozele, in conditiile in care se pãstreazã acțiunea celulelor
imunocompetente, pe cand cei cu deficiențe ale rãspunsului imun celular fac forme severe,
chair letale ale infecțiilor virale, în ciuda sintezei de anticorpi antivirali.

Recunoasterea antigenelor virale se realizeaza diferit pentru fiecare tip de limfocit: receptorul
limfocitelor B (BCR- B cell receptor) recunoaste epitopi conformationali- prezenti pe capsida
sau anvelopa virala; in timp ce receptorul limfocitelor T (TCR- T cell receptor) recunoaste
doar epitopi liniari (secvente scurte de aminoacizi), obtinuti prin procesarea proteinelor virale
si prezentarea acestora, asociate moleculelor CMH, de catre celulele prezentatoare de antigen
(celule dendritice, macrofage) (1,2).
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor
infectioase, subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu,
aparut la Editura Medicala, Bucuresti, 2018.

Limfocitele T citotoxice (LTc, CD8+) recunosc antigene virale prezentate in contextul CMH
clasa I. Odata activate, induc fie citoliza (prin distructie mediata de perforine si granzime), fie
apoptoza celulei infectate viral (activata prin molecule FasL, prezente pe suprafata limfocitelor
activate).
Limfocitele T helper (LTh, CD4+) recunosc antigene virale prezentate in contextul CMH
clasa a IIa. Rolul lor este de a sintetiza citokine activatoare ale raspunului imun celular (IL2 si
IFN gama -sintetizate de subsetul Th1) sau ale raspunsului imun umoral (IL4, 5, 6, 10-
sintetizate de subsetul Th2) .

Anticorpii se lega de epitopi conformationali de pe suprafata anvelopei sau capsidei virale,


blocand adsorbtia sau decapsidarea virala si neutralizand astfel infectivitatea virionilor ce
disemineaza prin sange. Un mecanism important de aparare antivirala este reprezentat si de
citotoxicitatea dependenta de anticorpi, un mecanism prin care anticorpii legati de antigene
virale prezente pe suprafata unor celule infectate sunt recunoscuti de celule imune (limfocite
NK, macrofage, neutrofile, eosinofile) prin receptorii pentru fractiunea Fc a imunoglobulinelor,
ceea ce declanseaza liza celulei tinta .

Patogenia infectiilor virale


1. Infectia virala litica, productiva decurge in celule permisive, ce sustin replicarea virala
completa cu formarea si eliberarea virionilor progeni. Acest tip de infectie poate fi
simptomatica sau clinic inaparenta, dar insotita de excretie virala asimptomatica. Infectiile
inaparente produc cantitãti limitate de virus, fara sa genereze modificãri functionale sau
morfologice ale celulei gazdã. In conditii de imunosupresie sau in prezenta unor coinfectii
infectiile inaparente se pot transforma în infectii productive.

2. Infectia virala persistenta se stabileste in celule cu permisivitate limitata, care genereaza


selectarea unor tulpini virale cu multiplicare lentã sau cu persistenta genomului viral sub forma
episomala. La nivelul tesutului infectat se realizeaza un echilibru între replicarea viralã si
diviziunea celulara, iar o serie de factori extracelulari (interferon, ARN interferent, anticorpi
nonneutralizanti etc) protejeazã celulele încã neinfectate si contribuie la instalarea persistentei
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor
infectioase, subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu,
aparut la Editura Medicala, Bucuresti, 2018.

virale (2,8). Situatia extremã este cea în care virusul nu se replicã - infectie abortiva, dar
genomul viral se integreaza in genomul celular, putand genera transformarea celulara si
initierea carcinogenezei viral- induse. (ex: papilomavirusuri umane) (9).
3. Infectiile virale latente sunt rezultatul opririi ciclului replicativ viral în fazele timpurii.
Unele celule nu pot asigura asamblarea virionilor progeni sau eliberarea lor, dar sustin sinteza
proteinelor virale nonstructurale. Latenta este un fenomen caracteristic herpesvirusurilor care
pot rãmâne în o stare dormanta în anumite celule înalt specializate si, sub influenta unor factori
declansatori variati isi pot relua replicarea completa, generand reactivari asimptomatice sau
clinic aparente.
Bibliografie
1. Louten J. Essential Human Virology 2016, Elsevier Inc.
2. Cernescu C. Virusologie Medicala, 2012, Editura Medicala, 2012
3. Chung RT, Gale M, Polyak SJ, et al. Mechanisms of Action of Interferon and Ribavirin in Chronic
Hepatitis C: Summary of a Workshop. Hepatology (Baltimore, Md). 2008;47(1):306-320.
doi:10.1002/hep.22070
4. Sironi M, Peri AM, Cagliani R, et al. TLR3 Mutations in Adult Patients With Herpes Simplex Virus and
Varicella-Zoster Virus Encephalitis. J Infect Dis. 2017;215(9):1430-1434.
5. Stättermayer AF, Ferenci P. Effect of IL28B genotype on hepatitis B and C virus infection. Curr Opin
Virol. 2015 Oct;14:50-5.
6. Zhang X, De Paiva CS, Su Z, et al. Topical interferon-gamma neutralization prevents conjunctival goblet
cell loss in experimental murine dry eye. Exp Eye Res. 2014 Jan;118:117-24.
7. Ortiz MA, Espino-Paisan L, Nunez C, et al. New life to an old treatment: pegylated Interferon beta 1a in
the management of multiple sclerosis. Curr Med Chem. 2018 doi:
10.2174/0929867325666180226105612.
8. Flint J, Racaniello VR; Rall GF; Skalka AM, Enquist LW. Principles of Virology. Third Edition, 2015,
Editura ASM Press
9. Knipe DM, Howley PM (editors in chief)-Fields Virology, 6th edition, 2013, Editura Wolters Kluwer
|Lippincott Williams Wilkins.
10. Umbach JL, Kramer MF, Jurak I, Karnowski HW, Coen DM, Cullen BR. MicroRNAs expressed by herpes
simplex virus 1 during latent infection regulate viral mRNAs. Nature. 2008; 454 (7205):780-3.
11. Wilson AC, Mohr I. A cultured affair: HSV latency and reactivation in neurons. Trends in microbiology.
2012; 20 (12): 604-611.
12. Sheehy A. M., Gaddis N. C., Choi J. D., Malim M. H. (2002) Isolation of a human gene that inhibits HIV-
1 infection and is suppressed by the viral Vif protein. Nature 418, 646-50
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor
infectioase, subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu,
aparut la Editura Medicala, Bucuresti, 2018.

13. Mok BW, Liu H, Chen P, et al. The role of nuclear NS1 protei in highly pathogenic H5N1 influenza
viruses. Microbes Infect. 2017;19(12):587-596.
14. Lundgren O, Svensson L. Pathogenesis of Rotavirus diarrhea. Microbes Infect. 2001;
3:1145–1156.
15. Samson M, Libert F, Doranz BJ, Rucker J, Liesnard C, Farber CM, et al. Resistance to
HIV-1 infection in Caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5
chemokine receptor gene. Nature (1996) 382:722–5.
16. Ghimire D, Rai M, Gaur R. Novel host restriction factors implicated in HIV-1
replication. J Gen Virol. 2018 Feb 19. doi: 10.1099/jgv.0.001026.
17. Hütter G, Nowak D, Mossner M, Ganepola S, Müssig A, Allers K, et al. Long-term control of HIV by
CCR5 Delta32/Delta32 stem-cell transplantation. N Engl J Med, 2009,360:692–
8.10.1056/NEJMoa0802905
18. Haworth KG, Peterson CW, Kiem HP. CCR5-edited gene therapies for HIV cure: closing the door to viral
entry. Cytotherapy (2017) 19(11):1325–38.10.1016/j.jcyt.2017.05.013
19. Deeks SG, Walker BD. Human immunodeficiency virus controllers: mechanisms of durable virus control
in the absence of antiretroviral therapy. Immunity. 2007Sep;27(3):406-16. Review. PubMed PMID:
17892849.
20. Noyan K, Nguyen S, Betts MR, et al. Human Immunodeficiency Virus Type-1 Elite Controllers Maintain
Low Co-Expression of Inhibitory Receptors on CD4+ T Cells. Front Immunol. 2018;9:19. doi:
10.3389/fimmu.2018.00019.
21. Leng J, Ho HP, Buzon MJ, et al. A cell-intrinsic inhibitor of HIV-1 reverse transcription in CD4(+) T cells
from elite controllers. Cell Host Microbe. 2014;15(6):717-728. doi:10.1016/j.chom.2014.05.011.
22. Jopling CL, Yi M, Lancaster AM, Lemon SM, Sarnow P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance
by a liver-specific microRNA. Science2005;309:1577-81
23. Janssen HL, Reesink HW, Lawitz EJ, et al. Treatment of HCV infection by targeting microRNA. N Engl
J Med.2013;368(18):1685-94.
24. Looker KJ, Elmes JAR, Gottlieb SL, et al.Effect of HSV-2 infection on subsequent HIV acquisition: an
updated systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 2017 17 (12):1303-1316.
25. Ogawa Y, Kawamura T, Matsuzawa T, et al. Antimicrobial peptide LL-37 produced by HSV-2-infected
keratinocytes enhances HIV infection of Langerhans cells. Cell Host Microbe. 2013;13(1):77-86.
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

VACCINURI VIRALE

Vaccinurile clasice sunt:

1. Vaccinuri inactivate (VI) , obtinute prin inactivarea virusului izolat in laborator, prin
procedee chimice (tratare cu formol sau beta-propriolactona) ce pastreaza imunogenitatea
nealterata.

VI induc un rãspuns imun semnificativ (ca titru individual de anticorpi, proportie de


primitori cu seroconversie si persistentã a anticorpilor) numai dupã scheme complete de imunizare
care presupun administrarea de doze multiple si rapeluri corect distantate. Imunitatea consecutivã
V.I. este limitatã numai la unele antigene etalate la exteriorul virionului, care pot fi uneori
modificate de procedeele de inactivaresi care reprezinta de obicei tinta variabilitatii virale.

VI sunt utilizate in mod curent pentru preventia poliomielitei, gripei, rabiei si hepatitei A.

2. Vaccinuri vii atenuate (VVA) obtinute prin atenuarea infectivitatii virale, cel mai frecvent
sub actiunea unor factori fizici (selectia unor tulpini reci ce sunt cultivate in laborator la
temperaturi suboptimale).

Avantajele VVA:

- pastreaza capacitatea de replicare activa a virusului si mimeaza practic o infectie naturala


asimptomatica, cu stimularea atat a imunitatii sistemice (umorale si celulare), cat si a celei locale,
la nivelul portii de intrare a virusului,

- prin eliminarea activa a virusului atenuat se realizeaza in oarecare masura si inlocuirea treptata a
virusului salbatic din circulatie, cu imunizarea pasiva a contactilor celor vaccinati.

- in general necesita mai putine rapeluri comparativ cu cele inactivate, la care antigenicitatea poate
suferi modificari in urma proceselor chimice si nu necesita adjuvanti.

Dezavantajele VVA

-riscul generarii unor simptome severe la persoanele imunosupresate,


Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

-stabilitatea la transport si la stocaj depinde de mentinerea corespunzatoare a lantului de frig.

- riscul reversiei la virulenta, cu aparitia unor revertanti patogeni, desi in practica acest fenomen
nu s-a produs decat in cazul vaccinului polio viu atenuat

- interferarea lor de alte virusuri cu care împart acelaºi habitat în organism (polio/enterovirusuri);

VVA sunt utilizate in mod curent pentru preventia rujeolei, rubeolei, oreionului (vaccin trivalent
MMR- measles mumps, rubella sau ROR rujeola, oreion, rubeola); a poliomielitei (in Romania
incepand cu 2008, administratea acestuia a fost inlocuita cu cea a vaccinului inactivat), precum si
a gripei, varicelei sau febrei galbene.

Un vacin viu atenuat a servit si pentru eradicarea variolei (smallpox). Virusul vaccinal (Vaccinia)
reprezinta un virus nepatogen pentru om (la care determina o infectie localizata la nivelul
falangelor, cunoscuta sub numele de nodulii laptarilor), dar antigenic înrudit cu agentul etiologic
al variolei umane, impotriva careia determina a o imunizare puternica, de lunga durata.

In ultimele decade au aparut vaccinuri bazate pe tehnologia ADN recombinant pentru


producerea unor vaccinuri cu eficienta si siguranta sporita, astfel de vaccinuri sunt utilizate in
practica pentru preventia hepatitei B si a infectiei cu cele mai raspandite papilomavirusuri umane,
inclusiv cele cu risc oncogen crescut.

In calendarul national de imunizari din Romania sunt incluse vaccinul polio (inactivat, injectabil),
vaccinul trivalent anti rujeola, oreion, rubeola (viu atenuat, injectabil) si vaccinul anti hepatita B,
produs prin tehnologia ADN recombinant (injectabil). O serie de alte vaccinuri virale (anti
rotavirusuri, anti varicela, anti papilomavirusuri) sunt recomandate, dar neincluse in calendarul
national.

Vaccinarea in poliomielita

Pe plan mondial se utilizeaza atat un vaccin viu atenuat, cu administrare orala (Sabin), cat si
un vaccin inactivat, cu administrare injectabila (Salk). Ambele au fost formulate ca vaccinuri
trivalente, eficiente impotriva tuturor celor 3 tipuri antigenice de virusuri poliomielitice izolate.
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Poliomielita

Boala caracterizata prin aparitia unor paralizii flasce acute, asimetrice , ca urmare a leziunilor
neuronilor motori din coarnele anterioare ale maduvei spinarii (cu neuronoliza, neuronofagie si
infiltrat inflamator perineuronal important) ce se pot vinca complet sau pot genera sechele
neurologice severe.

Raportul intre infectiile inaparente si cele simptomatice, paralitice este de 200:1.

Este produsa de cele 3 tipuri de virusuri poliomielitice (intre care nu exista cross reactivitate
antigenica) , din grupul Enterovirusurilor, familia Picornaviridae. Sunt virusuri cu genom ARNss
cu polaritate pozitiva, neanvelopate, termostabile si extrem de rezistente la actiunea pH-ului
acid, a enzimelor proteolitice si a sarurilor biliare.

Omul este singurul rezervor natural al acestor virusuri.Transmiterea este preponderent fecal
orala, raspandirea virusurilor de la poarta de intrare catre SNC se realizeaza majoritar
hematologic, limfatic, virusurile polio au eliminare prelungita prin materiile fecale, chiar in cazul
infectiilor asimptomatice.

Izolarea virusurilor poliomielitice din probe de materii fecale sau din exudat faringian , urmata
de secventiere pentru diferentierea formelor salbatice de cele atenuate (din vaccinul viu cu
administrare orala) sau de revertantii virusului vaccinal, este obligatorie pentru orice caz de
paralizie acuta flasca.

Din 2002 poliomielita a fost eradicata in Europa, insa ramane riscul aparitiei unor cazuri de
import din zonele endemice.

Vaccinul antipolio inactivat (VPI), cu administrare injectabila, a fost creat de Jonas Salk si
introdus in SUA in 1952- in urma unei epidemii majore de poliomielita cu 300,000 cazuri si
58,000 decese. Vaccinul este produs prin inactivarea cu formaldehida a viusurilor polio izolate pe
culturi de celule Vero (celule renale provenite de la maimuta verde africana). Vaccinul are
imunogenitate excelenta (peste 90% din persoanele vaccinate dezvoltand anticorpi impotriva
tuturor celor trei tipuri antigenice dupa 2 doze, respectiv peste 99% dupa 3 doze).
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Vaccinul antipolio viu atenuat, cu administrare orala (VPO) a fost creat de Albert Sabin in
1962. Contine tulpini virale corespunzatoare celor 3 serotipuri virale (in raport de 10:1:3), atenuate
prin pasaje seriale la temperaturi suboptimale. Desi baza moleculara a atenuarii este distincta
pentru fiecare serotip, tulpinile atenuate difera de serotipul natural virulent printr-un numar mic de
mutatii, care survin insa intr-o regiune esentiala pentru replicarea virala- IRES 5’ NT, determinand
destabilizarea structurii secundare a ARN si defecte in traducerea proteinelor virale VP1.

Avantajele utilizarii acestui vaccin sunt legate de capacitatea virusului atenuat de a disemina de
la vaccinati la contactii acestora, ceea ce conduce la eliminarea virusului din colectivitate, precum
si de administrarea orala cu cresterea greadului de acceptabilitate la nivel populational. Vaccinul
are imunogenitatea crescuta dupa prima administrare si asigura imunitate durabila.

Dezavantajul major al acestui vaccin este posibilitatea reversiei la virulenta, cu aparitia


poliomielitei paralitice asociata vaccinãrii (PPAV). Desi riscul este minor (1 la 2-3 milioane de
doze administrate), odata cu obtinerea statusului de polio-free multe tari (inclusiv Romania din
2008) au trecut la administrarea exclusiva a vaccinului inactivat. Alte dezavantaje sunt
imposibilitatea administrarii la persoane imunosupresate si necesitatea mentinerii lantului de frig
la stocare si transport.

Strategia actuala de eradicare a poliomielitei prevede :


- mentinerea unui nivel crescut de imunizare de rutina;
- organizarea unor zile nationale de imunizare (in 2012, a fost organizata
saptamana mondiala de imunizare), cu vaccinarea tuturor copiilor <5 ani intr-un
interval foarte scurt, in sezonul de circulatie a virusurilor poliomielitice);
- supravegherea tuturor cazurilor de paralizii flasce acute
- imunizarea selectiva, tintita a comunitatilor care raman rezervoare de virus in
tarile in care primele 3 elemente au redus semnificativ numar cazuri polio
(‘mopping out” activities).
Pe termen lung, chiar in perioada post-eradicare se preconizeaza incorporarea unui vaccin
inactivat in programul extins de imunizari al OMS.

Vaccinarea anti rujeola, oreion, rubeola (ROR; in engleza MMR- measles, mumps,
rubella) se realizeaza cu un vacin trivalent continand tulpinile vii atenuate ale virusurilor rujeolos,
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

urlian, rubeolos, autorizat in SUA in 1971. Se administreaza in doua doze, prima incepand cu
varsta de 12 luni, iar a 2-a la 4-6 ani. Reactiile adverse post vaccinare MMR sunt minore
(febra 5%-15% cazuri, rash 5% cazuri, artralgii,) rar, pot sa apara trombocitopenie <1/30,000
doze sau encefalopatie- <1/1,000,000 doze). Vaccinul ROR este imunogen in >98% din cazuri,
daca administrarea se face dupa varsta de 12 luni, iar imunitatea persista pe toata durata vietii. In
situatii speciale (in special in focare epidemice) se poate recurge la vaccinarea timpurie, aceasta
nu este insa recomandata insa înainte de varsta de 6 luni.

Rujeola este o bola febrila eruptiva a copilariei. Clinic debuteaza cu febra si triplu catar
(conjunctivita, rinoree, tuse) si eventual tulburari gastro-intestinale (diaree), dupa care apare
eruptia tipica: exantem si enantem maculo-papular, cu tendinta la confluenta. Transmiterea este
aerogena si contagiozitatea extrem de ridicata. Complicatiile frecvente sunt otita medie (7%
cazuri), pneumonie cu celule gigante mutinucleate (6% cazuri), encefalita (0.1%). Evolutia este
mai severa la imunosupresati, malnutriti, in special la cei cu deficit de vitamina A. O complicatie
tardiva severa este PESS (panencefalita sclerozanta subacuta), asociata in special infectiilor
achizitionate inainte de varsta de 1 an. PESS este o boala lent degenerativa, ce apare la distanta (1-
15 ani) de la infectia acuta cu virus rujeolos. Clinic se manifesta prin disfunctii cognitive cu
agravare progresiva, disfunctii motorii, ataxie, mioclonii, convulsii si progresie invariabila catre
deces. Incidenta sa a scazut dramatic dupa introducerea de rutina a vaccinarii antirujeoloase.
Agentul etiologic al rujeolei este virusul rujeolos din familia Paramixoviridae, genul
Morbillivirus, un virus cu genom ARNss cu polaritate negativa, nesegmentat, stabil din punct de
vedere antigenic, cu timp de supravietuire limitat in mediul extern si rapid inactivat de caldura,
lumina, pH acid, enzime proteolitice.
Rubeola este o boala febrila insotita de eruptie maculopapulara discreta si limfadenopatii, frecvent
retroauriculare. Virusul rubeolos (din familia Togaviridae) se transmite respirator, si in cazul
infectiei femeii gravide in primul trimestru de sarcina poate traversa placenta, determinand o
infectie persistentã a fãtului ce duce la avort, nasteri premature, moartea fatului in utero sau la
malformatii congenitale severe (sindromul rubeolos congenital-cataracta/glaucom
congenital/retinopatie pigmentara, surditate, boala cardiaca congenitala). Copiii cu sindrom
rubeolos congenital prezinta excretie virala continua >1 an dupa nastere.
Oreionul (parotidita epidemica) este o infectie cu transmitere respiratorie, determinata de
virusul urlian (familia Paramixoviridae, genul Parainfluenza), cu genom ARNss cu polaritate
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

negativa, nesegment, stabil antigenic, instabil in mediul extern. Virusul infecteaza multiple
tesuturi, replicandu-se la nivelul meningelui, glandelor salivare, pancreasului, testiculelor si
ovarelor. Meningita aseptica si orhita sunt complicatiile cele mai frecvente ale parotiditei urliene.
Vaccinul anti urlian este un vaccin viu atenuat (tulpina Jeryl Lynn ) cu eficienta de peste 95%, care
genereaza imunitate durabila pe tot parcursul vietii.

Rotavirusurile (familia REOviride -virusuri Respiratorii Enterice Orfane), sunt virusuri cu


genom ARNds, segmentat, si capsida dublã, ce contine epitopi implicati in seroneutralizare. Sunt
printre agentii etiologici frecvent implicati in gastroenteritele virale- boli diareice acute, aparute
mai ales la sugari si copii mici (intre 3 luni si 5 ani), cu incubatie scurtã (1-3 zile) si o duratã de
pânã la 6 zile. Evolutia este favorabila, in conditiile evitarii deshidratãrii si a tulburarilor hidro-
electrolitice asociate; cu toate acestea, vindecarea nu este acompaniata de imunitate de durata.
Datorita existentei mai multor serotipuri, intre care nu exista cross reactivitate, reinfectiile, care
pot aparea la orice varsta, sunt relativ frecvente, insa au simptomatologie mai blanda.

Vaccinurile anti rotavirale sunt vaccinuri vii atenuate administrabile oral, dupã vârsta de 2 luni.
La ora actula sunt disponibila 2 vaccinuri antirotavirale:

• RV5 (RotaTeq, Merck) care contine 5 reasortanti atenuati proveniti din tulpini umane si

bovine, administrabil oral, incepand cu varsta de 2 luni , in 3 doze , separate de un


interval de 1-2 luni, pana la varsta maxima de 32 saptamani.

• RV1 (Rotarix, GlaxoSmithKline), ce contine o tulpina atenuata de rotavirus uman,

administrabil oral, in 2 doze , incepand cu varsta de 2 luni, si apoi la interval de 1-2 luni,
pana la varsta maxima de 24 saptamani.

• Ambele vaccinuri sunt eficiente in proportie de 74%-87% impotriva aparitiei


gastroenteritelor si in proportie de 85%-98% impotriva formelor severe.

Studiile clinice realizate dupa aprobarea vaccinurilor antirotavirale nu au generat rezultate


omogene in ceea ce priveste existenta unui risc crescut de ocluzie postvaccinare. Tinand cont de
datele existente, in Octombrie 2011 s-a adaugat existenta unui un istoric de ocluzie drept
contraindicatie pentru administrarea vaccinului antirotaviral.
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Bibliografie selectiva
1. American Academy of Pediatrics. Rotavirus infections. In:Pickering LK, Baker CJ, Long
SS, eds. RedBook: 2009 Report of the Committee on Infectious Diseases. 28th ed. Elk
Grove Village, IL: American Academy of Pediatrics, 2009:576–9.
2. CDC. Prevention of rotavirus gastroenteritis among infants and children.
Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR
2009;58(No. RR-2):1–24.
3. CDC. Addition of severe combined immunodeficiency as a contraindication for
administration of rotavirus vaccine. MMWR 2010;59(No. 22):687–8.
4. CDC. Addition of History of Intussusception as a Contraindication for Rotavirus
Vaccination. MMWR 2010;59(No. 22);687-8.
5. Fischer TK, Viboud C, Parashar U, et al. Hospitalizations and deaths from diarrhea and
rotavirus among children <5 years of age in the United States, 1993-2003. J Infect Dis
2007;195:1117–25.
6. Murphy TV, Gargiullo PM, Massoudi MS, et al. Intussusception among infants given an
oral rotavirus vaccine. N Engl J Med 2001;344:564–72.
7. Parashar UD, Hummelman EG, Bresee JS, et al. Global illness and deaths caused by
rotavirus disease in children. Emerg Infect Dis 2003;9:565–72.
8. Tate J, Mutue J, Panozzo C, et al. Sustained decline in rotavirus detections in the United
States following the introduction of rotavirus vaccine in 2006. Pediatric Inf Dis 2011,
30:530–4.
9. Vesikari T, Matson DO, Dennehy P, et al. Safety and efficacy of a pentavalent human–
bovine (WC3) reassortant rotavirus vaccine. N Engl J Med 2006;354:23–33.
10. Vesikari T, Karvonen A, Prymula R, et al. Efficacy of human rotavirus vaccine against
rotavirus gastroenteritis during the first 2 years of life in European infants: randomized,
double-blind controlled study. Lancet 2007;370:1757-63.

11. O'Ryan, M. L., Matson, D. O., Davidson, B. L., Keusch, G. T., Cash, R. A. (1998). A
Quadrivalent Rotavirus Vaccine. N Engl J Med 338: 620-622
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

12. Chen, S. C., Jones, D. H., Fynan, E. F., Farrar, G. H., Clegg, J. C. S., Greenberg, H. B.,
Herrmann, J. E. (1998). Protective Immunity Induced by Oral Immunization with a
Rotavirus DNA Vaccine Encapsulated in Microparticles. J. Virol. 72: 5757-5761
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

INFECTII RESPIRATORII – GRIPA

Virusurile gripale fac parte din familia Orthomixoviridae, denumita astfel dupa tropismul
pentru arborele respirator (din grecește myxa- mucus).

Exista trei tipuri de virusuri gripale:

1. virusuri gripale A care infecteaza atat omul, cat si specii variate de pasari si mamifere;
2. virusuri gripale B care infecteaza numai omul;
3. virusuri gripale C care infecteaza numai omul, au patogenitate minima

Virusurile gripale A sunt anvelopate si au genom ARNss cu polaritate negativa (antimesaj),


segmentat, alcatuit din opt minigene cu replicarea independenta, ce codifica proteinele virale
structurale și nonstructurale. La suprafata anvelopei se gasesc două glicoproteine de interes
major:

- hemaglutinina (HA)- initiaza replicarea virala, prin atașarea virionilor la receptorii celulari,
reprezentati de reziduuri de acid sialic, si contine epitopi imunodominanti impotriva carora se
sintetizeaza anticorpii protectori. Este principala proteina continuta in vaccinul antigripal
inactivat, subunitar.

- neuraminidaza (NA) faciliteaza eliberarea virionilor din celula gazda și digera inhibitorii
nespecifici, mucoproteici de la nivelul tractului respirator, facilitand diseminarea virionilor
progeni. Inhibitorii de neuraminidaza sunt principalele medicamente utilizate în terapia și
profilaxia gripei.

Ciclul replicativ

1. Eclipsa.

- Adsorbtia mediata de legarea HA virale la receptorii celulari. Receptorii au conformatie


diferita la fiecare specie infectata. Astfel, tulpinile de virusuri gripale umane recunosc
preferential conformatia acid sialic 2,6-beta galactoza (caracteristica celulelor epiteliale din
tractul respirator superior), in timp ce tulpinile de virusuri gripale aviare recunosc preferntial
conformatia acid sialic 2,3-beta galactoza (receptori situati pe celulele tractului gastro-intestinal
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

la pasare si prezenti la om cu densitate mica pe celule din brosiole si alveole pulmonare).


Aceasta particularitate previne traversarea barierei de specie si infectia cu alte tulpini gripale,
in afara celor proprii speciei respective. Totusi, suinele prezinta ambele tipuri de receptori si
pot fi infectate atat cu tulpini gripale umane, cat si aviare, pe langa tulpinile gripale proprii.
Infectia simultana cu tulpini virale provenind de la specii diferite genereaza posibilitatea
aparitiei unor reasortanti, prin schimb de minigene- fenomen ce sta la baza variabilitatii majore
a virusurilor gripale, cunoscuta sub denumirea de shift antigenic.

- Internalizarea se face prin endocitoza mediata de clatrina, virusurile gripale, desi sunt
anvelopate nu au factori de fuziune

- Decapsidarea este facilitata de proteina virala M2, care determina formarea unui canal ionic,
permitand patrundrea protonilor si distrugerea invelisurilor proteice, cu eliberarea si transportul
genomului viral in nucleu.

2. Crestere logaritmica- Virusurile gripale sunt singurele virusuri ARN care se replica in
nucleu. Genomul vira, ARNss cu polaritatea negativa, este asociat cu o ARN polimeraza (rdRp)
alcatuita din 3 subunitati functionale (PA, PB1, PB2) care conduc sinteza ARNm viral si sinteza
noilor acizi nucleici virali

ARNm viral este sintetizat de ARN polimeraza virala (transcriptaza, RdRp) utilizand primeri
scurti derivati din transcripte celulare printr-un mecanism unic , numit “cap-snatching'.
Practic:
- subunitatea PB2 din polimeraza virala se leaga de portiunea cap a ARNm celular
- subunitatea PA (endonucleaza) cliveaza ARNm celular secvente scurte
- subunitatea PB1 utilizeaza aceste secvente scurte derivate din ARNm celular ca primer pt
sinteza ARNm viral
Recent a fost aprobat un nou antiviral - Baloxavir marboxil (Xofluzaä), un inhibitor
selectiv al endonucleazei cap- dependente.
Pe matrita ARNmastfel generat are loc sinteza proteinelor virale, proces obligatoriu inainte
de initierea replicarii genomului, acestea se ataseaza de genomul parental, alcatuind un
complex ribonucleoproteic, de care se ancoreaza polimeraza virala pentru a sintetiza noul
genom progen - ARNss cu polaritate negativa.
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

3.Faza de platou – maturarea proteinelor virale, asamblarea virionilor si eliberarea acestora.


Eliberarea virionilor progeni care este dependenta de neuraminidaza (NA) ce cliveaza
reziduuri de acid sialic de pe suprafata celulelor infectate.

Variabilitatea genetica a virusurilor gripale


Unul dintre cele mai importante aspecte ale biologiei virusurilor gripale este variabilitatea
genetica, care determina modificari continue la nivelul antigenelor situate la suprafata
virionului (HA si NA). Variabilitatea apare ca urmarea a:
-modificarilor minore de antigenicitate (alunecare antigenica – antigenic drift),
produse in urma unor mutatii punctiforme in genele ce codifica HA si NA, datorita erorilor
frecvente ale polimerazei virale RdRp
- modificarilor majore ale antigenicitații (comutare antigenica – antigenic shift)
produsa prin:
- reasortarea minigenelor între tulpini gripale provenite de la specii diferite (porcul poate fi
infectat simultan cu tulpini aviare sau umane constituind gazda intermediara cel mai frecvent
implicata in generarea unor tulpini reasortante cu potențial epidemic uman)
- transferul direct al unor tulpini gripale de la animal la om- fenomen ce necesita aparitia unor
modificari conformationale in structura hemaglutininei.
- re-emergenta unui virus ce a determinat epidemii cu ani inainte

Fata de aceaste variante nou aparute în urma schimbarilor genomice, imunitatea anterioara nu
mai ofera protecție. Ca urmare a driftului antigenic apar epidemii locale, frecventa, iar ca
urmare a shiftului antigenic sunt introdise noi tulpini virale in circulatie, ce pot genera
pandemii (epidemii exinse la cel putin 3 continente). Toate cele trei tipuri de virusuri gripale
au capacitate de drift antigenic, însa numai tipul A poseda și capacitatea de shift antigenic

Rezervorul natural al virusurilor gripale este reprezentat de pasarile salbatice acvatice (rațe,
gâște). La aceste specii virusul gripal nu determina simptomatologie, dar se replica și se elimina
in titruri înalte, perpetuând potențialul epizootic și epidemic. Ciclul natural al virusurilor gripale
favorizează apariția recombinanților între tulpinile aviare (păsări sălbatice și domestice),
porcine și umane. Virusurile Gripale aviare pot fi cu patogenitate scazuta (LPAI- low
pathogenic avian influenza) sau cu patogenitate inalta (HPAI- High pathogenic avian
influenza), acestea din urma pot traversa bariera de specie si se transmit la alte specii
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

susceptibile, inclus la om.

Manifestari clinice. Gripa este cea mai frecventa infecție acuta a cailor respiratorii. Se
estimeaza ca în fiecare sezon de trecere cald-rece (noiembrie- aprilie), între 10-20% din
populație face un episod gripal.Copiii sunt de 2-3 ori mai susceptibili decât adulții. Important,
in gripa, simptomele generale (febra inalta, frisoane, dureri musculare, articulare, cefalee, tuse
seaca) sunt mai marcate comparativ cu simptomele respiratorii (rinoree, stranut, nas înfundat
etc). Complicatii frecvente :

• Pneumonie virala/bacteriana
• Sinuzita bacteriana
• Miozita, miocardita, pericardita
• Encefalita gripala
• Sindrom Guillian-Barre (polineuropatie inflamatorie acuta demielinizanta declansata
de un proces infectios acut, frecventarelativ scazuta 2 la 100 000 persoane, datorat
procesului de mimetism antigenic (anticorpi antivirali ataca teaca de mielina)
• Sindrom Reye’s (encefalopatie acuta noninflamatorie si degenerescenta grasoasa a
ficatului). Probabil datorat unor leziuni mitocondriale precipitate de consumul de acid
acetil salicilic, ce inhiba fosforilarea oxidativa si oxidarea acizilor grasi in cursul unei
infectii virale.

Patogenie. Virulenta nu este conditionata de o singura gena virala, ci de o constelație de


segmente din genomul viral. Reasortarea minigenelor și chiar mutații punctiforme în anumite
gene modifica virulența. HA și NA sunt principalii factori de virulența care contribuie la
largirea tropismului tisular și la declanșarea raspunsului inflamator. O componenta importanta
a imunitații în gripa este reprezentata de efectorii imunitații nespecifice (interferoni și alte
citokine). Virusurile gripale sunt inductori eficienți de interferon atât în secrețiile respiratorii
cât și în ser. Interferonul se detecteaza dupa prima zi de gripa și atinge vârful în ziua 4-a. Exista
o corelație pozitiva între titrul viral, raspunsul febril și concentrația de interferon. Efectorii
imuni cei mai importanți pentru vindecare sunt însa anticorpii neutralizanți anti hemaglutinina
(HA). Numai acești anticorpi sunt asociați cu protecția indusa de boala sau vaccinare.
Persistența anticorpilor protectori, în absența boosterului (reinfecției), este estimata la 5-6 luni.
Infecțiile repetate sau vaccinarile repetate cresc titrul și persistența anticorpilor.
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Diagnosticul virusologic in gripa se realizeaza optim prin Rt-PCR, care ofera un rezultat rapid
si permite orientarea terapeutica. In prezent, s-au dezvoltat și metode rapide de identificare
antigenelor virusurilor gripale utilizate in camerele de garda si în ambulator, însa acestea nu
au sensibilitatea metodelor clasice de diagnostic. Pentru caracterizarea tulpinilor virale
circulante virale (necesara pentru stabiliea compozitiei vaccinului gripal) este necesara izolarea
(în culturi de celule sau pe ou de gaina embrionat) si identificarea subtipului viral prin
hemaglutinoinhibare

Vaccinarea antigripala. Exista doua opțiuni în vaccinarea antigripala: vaccinuri


inactivate si vaccinuri vii atenuate, fiecare cu avantaje si limite, si cu recomandari pentru
anumite grupe de varsta. Toate vaccinurile gripale sunt reînoite anual în functie de tulpinile
gripale circulante ( A/H1N1, A/H3N2 și B prevalente) din cauza driftului antigenic. OMS
recomanda anual tulpinile utilizate în producția vaccinului gripal. Vaccinarea antigripala se face
optim în intervalul octombrie-noiembrie. In pandemii vaccinul poate fi monovalent, preparat
numai cu tulpina pandemica.

Vaccinul inactivat (injectabil) este cel mai frecvent subunitar, continand numai hemaglutinina
virala purificata. Este tri sau tetravalent, continand 3 sau 4 tulpini virale (A/H1N1, A/H3N2 și
una sau doua tulpini B, din cele 2 linii genetice Victoria si Yamagata), circulante in sezonul
respectiv.

Vaccinul viu atenuat (administrabil intranazal) conține tuplini virale “reci” (a) adaptate pentru
replicare la temperaturi scazute, de 22 C, (b) sensibile la temperatura corpului uman >36 C şi
(c) atenuate (at). Ca urmare, acestea se multiplică la nivelul nasofaringelui şi induc imunitate
protectoare. In Europa, acest vaccin este recomandat numai pentru profilaxia gripei la persoane
cu vârsta cuprinsă între 24 de luni şi mai puţin de 18 ani.

Este foarte importanta vaccinarea celor ding rupe de risc pentru complicatii severe ale bolii:
• Copiii intre 6 luni-4 ani (59 luni);
• Persoanele ≥ 50 ani;
• Femeile insarcinate;
• Persoanele cu obezitate morbida (BMI ≥40);
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

• Persoanele cu boli pulmonare cronice (inclusiv astm), cardiovasculare (cu exceptia


hipertensiunii), renale, hepatice, neurologice, hematologice sau metabolice (inclusiv diabet
zaharat);
• Persoanele imunocompromise (datorita unei medicatii sau HIV);
• Copiii intre 6 luni si 18 ani care sunt tratati cronic cu aspirina si care pot dezvolta
sindromul Reye post-infectie;
• Persoanele care locuiesc in azile de batrani;
• Personalul medical
• Persoanele care ingrijesc sau locuiesc cu copii mai mici de 5 ani (in particular copii
mai mici de 6 luni) si adulti in varsta de peste 50 ani,
• Persoanele care ingrijesc sau locuiesc cu pacienti ce prezinta anumite comorbiditati
care-i fac sa aiba un risc crescut de complicatii severe in cadrul infectiei gripale.

Tratament.

Antiviralele ocupa un loc important în tratamentul gripei sezoniere, mai ales la


persoanele cu risc de complicatii sau în situații în care beneficiul este evident superior costului.
Fara a fi un substitut al vaccinarii antigripale aceste medicamente ofera protecție în cazul lipsei
vaccinarii sau nepotrivirii antigenice între tulpinile vaccinante și circulante. Medicamentele
folosite sunt:

• Inhibitorii neuraminidazei (oseltamvir și zanamivir), activi în fazele tardive ale ciclului


replicativ viral, impiedicand eliberarea virionilor progeni si diseminarea acestora.
• Inhibitorii decapsidarii- AMANTADINA SI RIMANTADINA (inhiba Proteina M2-
care formeaza canalul ionic, cu transportul genom viral in nucleu). La ora actuala
majoritatea tulpinilor circulante sunt rezistente la aceste medicamente.
• Inhibitor selectiv al endonucleazei cap dependente: BALOXAVIR marboxil (Xofluza)

In practica, tratamentul gripei cu antivirale trebuie sa înceapa în primele 24-36 ore de la


debutul simptomelor. Testele rapide au contribuit la diferențierea gripei de alte viroze
respiratorii acute sporind proporția celor ce beneficiaza de un tratament specific.

Tratamentul cu antibiotice al infectiilor repiratorii virale, inclusiv al gripei, este


Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

irelevant, nu influențează evoluția bolii și este dăunător pentru comunitate favorizând aparția
tulpinilor bacteriene rezistente.
Herpesvirusuri umane

Herpesvirusurile umane determina infecții extrem de raspândite, de gravitate


variabila, funcție de tipul virusului, vârsta și imunocompetența subiectului.
Caracteristica lor comuna este latenta. În cursul infecției acute (simptomatice sau
asimptomatice), herpesvirusurile disemineaza de la locul infecției inițiale si stabilesc
infecţii latente in alte sedii celulare, in care ciclul replicativ viral este suspendat la
nivelul sintezei proteinelor virale timpurii. Latența este un mecanism eficient de
evadare de sub raspunsul imun al gazdei.

În funcție de sediul latenței herpesvirusurile au fost clasificate în 3 subfamilii:


A. Alfa-herpesvirinae -latenta in neuroni senzitivi din ganglionii rădăcinii
posterioare a nervilor spinali și nucleii senzitivi ai nervilor cranieni-
- Herpes simplex 1 (HSV1- facial)
- Herpes simplex 2 (HSV2-genital)
- Virus varicelo-zosterian (VZV)

B. Beta-herpesvirinae-latenta in limfocitul T, monocite, organe solide (plamâni,


rinichi)
- Virus citomegalic (CMV)
- Virus Herpetic uman 6 - HHV6
- Virus Herpetic uman 7 – HHV7

C. Gama-herpesvirinae-latenta in limfocitul B, endoteliu capilar


- Virus Epstein Barr (EBV)
- Virus Herpetic uman 8- HHV8 (asociat sarcomului Kaposi)

Structura virionului și organizarea genomică sunt similare pentru toate cele 8 herpes
virusuri umane. Virionul cu dimensiuni cuprinse între 180-200 nm este alcătuit de la
exterior spre interior din :
- anvelopa cu proiecții glicoproteice, cu ajutorul cărora virusurile se
atașează la receptorii celulari și care conțin epitopi recunoscuti de
răspunsul imun;
 tegument - o regiune electronodensa în microscopie electronică, alcatuita
din proteine virale ce joaca rol important in initierea replicarii virale
 capsida cu simetrie icosaedrică;
 genom ADNds, liniar, asamblat ca un toroid și asociat cu o ADN
polimerază. Pe fiecare spiră ADN există o regiune unică lungă (UL) și una
scurtă (US) mărginite de secvențe repetate inverse (IR), ce permit
rearanjarea regiunilor, astfel încât genomul viral poate exista în mai multe
forme izomere. Multe proprietăți biologice ale herpesvirusurilor (inclusiv
latența) sunt deteminate de dispunerea secvențiala al genelor virale

A. ALFA HERPESVIRINAELE se caracterizează prin :


- tropism primar pentru piele și mucoase,
- replicarea rapidă intranucleară
- neurotropism și neuroinvazivitate,
- reactivări frecvente declanșate de variați factori virali și celulari
(modificari hormonale, expuneri la soare/frig/ radiații uv; iritații
sau traumatisme, tratamente imunosupresoare, coinfecții virale sau
bacteriene).
Replicarea
Replicarea alfaherpesvirusurilor este intranucleară, ADN-ul viral servind în 3 runde
succesive pentru sinteza de ARNm ce codifica 3 specii de proteine: alfa (imediat
timpurii) și beta (timpurii), ambele cu funcții reglatorii, enzimatice și gama (tardive) -
proteine structurale. Expresia proteinelor este coordonată într-un lanț în cascadă.
Gene alfa (imediat timpurii) au rol transactivator pentru toate genele asociate cu
infectia litica. La nivelul lor se regasesc secvente consens ce servesc ca loc de legare
pentru factori de transcriere : virali (VP16, alfa TIF-din tegument) si celulari (HCF-
host cell factor 1 - citoplasmatic si oct1-octamer transcription factor).
Genele beta (timpurii) intervin in codificarea enzimelor importante in replicarea
genomului viral ADN (ADN polimeraza virala, timidinkinaza virala), proces ce se
desfasoara dupa principiul rolling-circle, ce da nastere unor concatemeri (molecule
lungi continue de ADN ce contin copii multiple ale acelorasi secvente legate in serie),
clivati in monomeri in cursul asamblarii nucleocapsidei, de un complex viral
(terminaza UL56/UL 86) .
Genele gama (tardive) codifica majoritar proteine structurale din capsida si anvelopa

Latenta. Secventele repetitive din ADN-ul viral codifica molecule de ARN


noncodant denumite LATs (Latency Associated Transcript), exprimate doar in
cursul infectiei latente, care nu vor fi traduse in proteine.
Expresia LAT inhiba replicarea virala productiva prin :
-modificari ale histonelor ce convertesc portiuni din ADN viral in forme
neproductive, determinand asamblarea unei arhitecturii cromatiniene restrictive.
-procesare LATs in miRNAs ce pot inhiba traducerea ARNm pentru promoterii
genelor imediat timpurii. Mutaţiile în regiunea de codificare a LATs pot sa afecteze
intrarea sau ieşirea din starea de latenţă.
Expresia diferentiata a unor proteinelor celulare contribuie, de asemenea, la
instalarea latentei. Mecanisme posibile sunt:
• Fixarea unor proteine celulare cu actiune represoare, la nivelul
secventelor din ADN-ul viral care controleaza expresia genelor α,
imediat timpurii ce initiaza replicarea virala

• Reducerea sau absenta expresiei proteinelor celulare necesare activarii


genelor α

• Prezenta unor de proteine care inhiba activitatea factorului viral care


initiaza replicarea - alfa-TIF.

HSV1 se transmite prin contact direct si este in mod obișnuit asociat leziunilor
periorale (infectie primara: gingivostomatita herpetică, poate fi si asimptomatica sau
cu simptomatologie blanda, reactivari: obisnuit herpes labial, posibil si alte localizari,
sau leziuni multiple, obisnuit prin autoinoculare). Complicațiile de temut ale
infecțiilor cu virusuri herpes simplex 1 sunt keratoconjunctivita herpetica- cu
frecvente ulcerații corneene și encefalita herpetica-cu mortalitate peste 70%, ambele
aparute in cursul reactivarilor virusului latent, la adulti cu imunospresie.

HSV 2 determina herpesul genital, o boala cu transmitere sexuala. Transmiterea


virusului se poate realiza și în absența leziunilor aparente, datorită excreției virale
asimptomatice. În transmitere materno- fetala, HSV 2 determina herpesul neonatal, cu
afectare multiviscerala severa (hepatita necrozanta cu/fara trombocitopenie,
coagulopatie diseminata intravasculara și encefalita a nou nascutului) .

VIRUSUL VARICELO-ZOSTERIAN (VZV) se transmite pe cale aerogena, determinând


in primo-infectie varicela, viroza eruptiva a copilariei, deosebit de contagioasa.
Reactivarile virusului latent apar dupa mai multe decade, sub forma zonei zoster,
erupție herpetiformă pe teritoriul cutanat aferent nervilor spinali sau cranieni la
nivelul carora există virusul latent, cu nevralgii severe. Nevralgia post zona zoster
persistă 4-5 luni de la dispariția leziunilor, punând probleme speciale legate de
tratamentul antialgic. Recurențe severe ale infecțiilor cu alfaherpesvirusuri apar la
pacienții imunocompromiși (de exemplu: HIV pozitivi sau transplantați și
imunosupresati farmacologic).

Pentru preventia infectiei cu VZV este disponibil un vaccin viu atenuat anti-varicela
(Varivax®), obținut prin treceri repetate ale virusului pe culturi de fibroblaste diploide
umane. Vaccinul se administreaza copiilor între 19-35 luni, cu o doza rapel la vârsta
de 6-7 ani și confera protecție semnificativa pentru o perioada semnificativa de timp.
Vaccinul poate fi administrat simultan cu trivaccinul MMR (anti rujeolos-rubeolos-
urlian).
Pentru preventia reactivarilor VZV latent exista 2 vaccinuri:
- Zostavax® (produs de Merk), este un vaccin viu atenuat, ce contine aceeasi tulpina
ca si vaccinul antivaricelos, dar cu titru viral de cca 14 ori mai ridicat comparativ cu
acesta. Vaccinul scade incidenta zonei zoster cu cca 50% si diminueaza frecventa si
severitatea nevralgiei post-zona zoster. Este recomandat persoanelor cu varste peste
60 ani, care au avut varicela in antecedente, pentru prevenirea zonei zoster.
- Shingrix ® ( produs de GSK) este un vaccin recombinant indicat pentru
prevenirea zonei zoster şi a nevralgiei post-zona zoster, la adulţi cu vârsta de peste 50
de ani. Siguranta si eficienta sa sunt superioare celor associate vaccinului viu
atenuat, acest vaccin este recomandat preferential in prezent. Se administreaza 2 doze
separate de un interval de 2-6 luni, care asigura protectie in >85% cazuri, pentru cel
putin 4 ani.

Tratamentul infectiilor cu alfaherpesvirusuri: analogi nucleozidici ce inhiba


elongarea ADN viral.
Acyclovir (ACV) un analog nucleozidic purinic, derivat din guanina, de care difera
structural prin prezenţa unei catene laterale aciclice. Medicamentul u este activ ca
atare, trebuie convertit intracelular în acyclovir trifosfat, forma in care
competitioneaza cu nucleozidele intracelulare pentru incorporarea in ADN viral
progen. Acyclovirul este convertit în acyclovir monofosfat sub acțiunea timidin-
kinazei virus codificate; apoi monofosfatul trece în difosfat și trifosfat sub acțiunea
unor kinaze celulare. Tratamentul cu Acyclovir a diminuat marcat severitatea
simptomatologiei infecțiilor herpetice și a contribuit la scaderea frecvenței și gravitații
recurențelor. Alaturi de acyclovir, se utilizeaza derivați ai sai cu biodisponibilitate
orala superioara, de tipul valacyclovir și famciclovir. Sunt preferate in tratamentul
zonei zoster, pentru tratamentul şi supresia recidivelor herpesului genital si infecţiilor
oculare cu herpes simplex.
In stare latenta, virusul nu se replica activ și ca urmare nu este susceptibil la
acțiunea antivirala a compusilor mentionati mai sus. Aceste medicamente sunt
incapabile sa elimine o infecție latentă stabilita.
La persoanele cu recurente frecvente se poate incerca un tratatment
supresiv, cu doze mici de Acyclovir, Valaciclovir sau Famciclovir administrate
zilnic, timp de minim 1 an. Dozele zilnice se adapteaza individual, la concentraţia
cea mai mica necesara prevenirii recurenţelor.

B. BETAHERPESVIRINAE: Cel mai raspândit betaherpesvirus este virusul


citomegalic – CMV care se caracterizeaza prin:
- replicare lentă,
- citopatogenicitate redusa,
- latența prelungita,
- dependența replicării de stadiul mitotic al celulei gazdă,
- capacitatea de a traversa placenta și de a produce malformații la fat.
CMV are sedii de latenţă multiple - limfocitul T, monocite, celule endoteliale
si organe solide (plamâni, rinichi), iar reactivările sunt legate în particular de scăderea
imunităţii gazdei. Infecția cu CMV este în majoritatea cazurilor asimptomatica, dar
poate îmbraca forme severe la persoanele imunocompromise. Astfel:
- post transplant de organ au celule stem hematopoietice -
pneumonie severa, cu letalitate ridicata (> 75% din cazuri),
- infectie HIV std avansate- retinita și encefalite,
- post-transfuzii frecvente- infecție mononucleosis-like.

Transmiterea materno-fetala a CMV poate surveni:


 Prenatal - este teratogen – determina malformații congenitale severe
(microcefalie, retard mental, chorioretinita, anomalii osoase);
 Perinatal - determina boala cu incluzii citomegalice a nou nascutului
(hepatosplenomegalie, icter, anemie hemolitica, trombocitopenie,
sechele de tip surditate neuro-senzoriala);
 Postnatal – infecție asimptomatica sau asemănătoare mononucleozei

Diagnostic de laborator
Serologic : ac anti CMV IgM (optim pt diagnosticarea primoinfecției și a
infecției congenitale), seroconversie sau cresterea semnificativa a titrului de ac
specifici IgG + aviditate.
Infectie activa : optim detectie ADN CMV sau detectia Agpp65 prin
imunofluorescenta
Izolare- CMV este excretat asimptomatic pentru perioade lungi, astfel încât
un rezultat pozitiv la izolarea pe culturi este greu de interpretat. Acest lucru este
important pentru diagnosticul infecției congenitale pentru că un astfel de copil
continuă excreția de virus ani de zile. O metodă sensibilă de diagnostic este cultura
rapidă a virusului pe lamele individuale care sunt centrifugate la viteză mică după
inocularea produsului patologic, ceea ce faciliteaza adsorbția virusului și evidențierea
antigenelor timpurii prin imunofluorescență cu anticorpi monoclonali, după numai 2-4
zile. Tehnica se numeste shell vial/spin-enhanced culture.
Tratament. Un medicament înrudit structural și farmacologic cu acyclovirul -
ganciclovir, administrat intravenos și un derivat al său valganciclovir, administrat
per os, precum și alți doi agenți anti CMV - cidofovir (indicat în retinita citomegalică
la pacienții cu infectie HIV avansata) și foscarnet, sunt activi în infecția cu CMV.
Acestia pot fi administrati si profilactic recipientilor tranplantelor de organe.
Virusul herpetic uman 6 (HHV6) este un patogen semnificativ în pediatrie,
determinând boala a 6-a eruptivă febrilă a copilului mic, cunoscută sub numele de
roseola infantum sau exantem subit. Este o erupție maculo - papulară nepruriginoasă
cu durata de 2-3 zile, precedată și urmată de un sindrom febril.
N.B. Restul bolilor febrile eruptive ale copilariei sunt:rujeola; scarlatina;
rubeola; varicela, eritemul infecțios (cauzat de parvovirusul B19).
Virusul herpetic uman 7 (HHV7) a fost descoperit în 1990 la adulți sănătoși. Poate
determina roseola infantum sau exantem subit, infecții respiratorii la pacienții
imunosupresați și pare a acționa ca un cofactor în sindroamele induse de HHV6.
HHV6 si HHV 7 au fost descoperite initial la pacienti HIV pozitivi, au tropism pentru
limfocitele T CD4+, celule țintă în infecția HIV, și latență în glandele salivare.

C. GAMAHERPESVIRINAELE au capacitate transformanta in vitro și oncogena in


vivo: virusul Epstein Barr (EBV) și virusul Herpetic uman 8 (HHV8),
cunoscut și sub numele de virusul asociat sarcomului Kaposi.
EBV are un spectru îngust de gazda, infectând numai anumite subseturi celulare
specializate funcțional:
 epiteliul orofarinxului la nivelul căruia determină o infecție productiva, dar
pasagera - mononucleoza infecțioasa,
 limfocitele B, unde infecția este neproductiva, dar conduce la latența,
stimulare policlonala și, uneori, la transformare celulara.
Mononucleoza infecțioasă apare la adolescenți și se manifestă prin febră, faringită,
adenopatii importante, splenomegalie, și modificări caracteristice ale frotiului
sangvin. Aceiași simptomatologie caracterizează și infecțiile post-transfuzionale cu
CMV si cateodata, infectia primara HIV.
Infecția EBV latentă determină activarea policlonală a limfocitelor B cu
proliferare si potential transformant. In infecția HIV, EBV este frecvent reactivat,
fiind implicat în etiologia unei stomatite hiperplazice cu aspect particular -
leucoplazia viloasă a limbii. Apariția cancerelor post infecție EBV reprezinta un
eveniment rar. Urmatoarele cancere sunt asociate reactivarii infectiei latente:
1. Limfomul Burkitt (caracterizat prin proliferarea limfocitelor B transformate, ce
invadeaza țesuturile moi). Este caracteristica hiperexpresia antigenelor virale asociate
EBNA - Epstein Barr nuclear antigens. Limfomul Burkitt este asociat cu anomalii
cromozomiale caracteristice (cel mai frecvent translocația 8/14, între cromozomul 8
ce conține o oncogenă celulară: c-myc și cromozomul 14 – ce conține o genă care
codifică lanțul greu al imunoglobulinelor). Limfomul are caracter endemic în zonele
afectate de malarie. Se pare că anemia indusă de malarie determină o hiperactivitate
compensatorie a celulelor măduvei osoase hematogene, favorizând translocații
cromozomiale ce duc la activarea virusului EBV.
2. Carcinomul nazofaringian (endemic în Sud Estul Asiei), cu hiperexpresia unor
antigene asociate latentei (latency tumoral antigens),
3. Boala limfoproliferativă post transplant, cu cu hiperexpresia unor antigene
asociate LMP (latent membrane proteins).

In carcinogeneză intervin și alți cofactori; o mare parte din populație are


anticorpi anti EBV, fără să dezvolte ulterior tumori.

Herpesvirusul uman 8 - HHV 8 este implicat in aparitia sarcomului Kaposi, un


cancer al celulelor endoteliale, caracterizat prin proliferarea anormala, haotica a
celulei imature pluripotente endoteliale, cu angiogeneza și neoformare de
conglomerate vasculare atipice. Apar zone hipercrome, indolore, dar extrem de
friabile, ce determina hemoragii masive. Exista mai multe forme de sarcom Kaposi:
 Clasic cu incidenta mare la adultii virstnici de sex masculin, cu descendenta
mediteraneana, cu manifestari cutanate, mai ales pe membrele infecrioare.
 Asociat infecției HIV (este o afecțiune indicatoare pentru SIDA), cu
manifestari cutanate si/sau intra-viscerale, ce dau nastere unor hemoragii
masive pulmonare și gastro-intestinale. Răspunde bine la tratamentul
intralezional cu interferon.
INFECTII VIRALE ALE SISTEMULUI NERVOS CENTRAL (NEUROVIROZE)

A. MENINIGITE VIRALE implica inflamatia meningelor si iritatie meningeana +


hipertensiune intracraniana
B. ENCEFALITE VIRALE implica afectarea parenchimului cerebral = Febra, cefalee,
alterarea status mental->Agitatie psihomotorie, crize convulsive, tulburari sfincteriene,
paralizii, pareze de nervi cranieni/ somnolenta, obnubilare, dezorientare temporospatiala,
coma

A. Meningite virale
produse de virusuri din genul Enterovirusuri, Familia Picornaviridae

Picornavirusurile sunt virusuri neanvelopate, cu genom ARNss cu polaritate pozitiva.


Numele familiei este dat de dimensiunile foarte mici ale virusurilor (pico - 10ˉ¹²). Virusurile au
forma sferica si diametrul de aproximativ 30 nm si sunt rezistente la solventi organici, detergenti
neionici. Enterovirusurile sunt stabile in mediul acid (pH sub 3); aceste virusuri pot rezista zile,
saptamani in apa si apa menajera. Picornavirusurile sunt inactivate de temperaturi peste 56 de
grade Celsius, lumina UV, formaldehida si prin clorinare.
Clasificare. Enterovirusurile cuprind: poliovirusurile (agentul etiologic al poliomielitei si
prototipul Fam. Picornaviridae), virusurile Coxsackie grup A si grup B si virusurile ECHO
(Enteric Cytopatogeic Human Orphans) - tabel 2.
Transmiterea fecal orala este frecventa la copii in sezonul cald, prin contact direct, interpersonal.
Incidenta acestor infectii scade cu varsta. Enterovirusurile reprezinta cei mai frecventi agenti
etiologici ai meningitelor virale, producand aproximativ 90% din cazurile de meningita.

Enterovirus Specie Boala frecvent Forme clinice rare


asociata
Polio 1, 2, 3 Poliomielita Meningita
Coxsackie A1-A24 Meningita,miocardita, Infecții respiratorii,
herpangina, faringita, diaree de vară
conjunctivita,exantem

B1-B6 Boala Bornholm, Miocardita, enterita,


meningita, exantem hepatita, pancreatita,
moarte subita a nou-
nascuților
ECHO ECHO 1-33 Infecții respiratorii Exanteme
Neclasificate Entero 68-71 Encefalite, Conjunctivite
mieloradiculonevrite, (Entero-70)
infectii respiratorii

Tabel 2. Clasificarea Enterovirusurilor

Poliovirusurile reprezinta prototipul Genului Enterovirus. Acestea se transmit pe cale


fecal – orala si mai rar prin aerosoli. Replicarea virala are loc in nazo-faringe si se raspandeste
prin limfaticele tractului respirator superior. Poliovirusurile pot fi izolate si din tesutul tonsilar al
persoanelor infectate.

Stabilitatea virusurilor la pH acid permit acestora trecerea prin stomac spre tubul digestiv
inferior, unde se vor replica din nou la nivelul placilor Peyer. Dupa replicare apare o viremie
scazuta cu infectarea altor organe : SNC, ficat, pancreas, inima. Replicarea in aceste organe
determina o viremie secundra asociata cu semne si simptome ale infectiei.

Pentru poliovirusuri sunt descrise 3 serotipuri : PV1, PV2 si PV3.

Musculatura inervata de neuronii afectati sufera paralizii, urmate de atrofii secundare.


Aproximativ 90-95% din infectiile cu poliovirusuri sunt asimptomatice, iar 4% din infectii
determina manifestari minore sau forme abortive de poliomielita, cu simptomatologie
asemanatoare gripei, pentru 2-3 zile. Doar 1-2% din infectiile din timpul epidemiilor determina
paralizii flasce. Paralizia este frecvent precedata de mialgii, mai ales la adulti. Hiperestezia si
parestezia pot fi observate la grupele musculare afectate. Paralizia este de obicei asimetrica,
afecteaza mai mult musculatura proximala decat cea distala si membrele inferioare, mai mult decat
membrele superioare. Cel mai frecvent este afectat un singur membru, dar poate fi intalnita si
tetraplegia. Paralizia musculaturii diafragmului determina insuficienta respiratorie.

Afectarea nervilor cranieni este cunoscuta ca paralizie bulbara. Centrii medulari ce


controleaza respiratia si functiile vasomotorii pot fi afectate, ducand la deces.

Infectia poate avea manifestari variabile: de la pareze tranzitorii cu recuperare completa,


la paralizii rapid progresive, permanente si complete.

Prognosticul pe termen lung al infectiei poate fi evaluat in primele 6 luni de la infectie.


Daca nu se observa imbunatatiri in aceasta perioada, se va instala paralizia permanenta, cu
atrofia si deformarea membrului afectat.

Mortalitatea globala in poliomielita spinala este de aproximativ 5%, iar in poliomielita


bulbara de 50% sau mai mult.
Este descris si un sindrom postpolio la 20-40% din persoanele infectate cu poliovirusuri
si care s-au vindecat, la 25-30 de ani de la infectia initiala, caracterizat prin atrofii musculare,
durere, slabiciune musculara, ducand rar la disfunctia totala a zonei afectate.

Virusurile Coxsackie, ECHO și celelalte enterovirusuri neclasificate au fost puse în


evidențã în cursul supravegherii epidemiologice a poliomielitei. La subiecții sanatoși se izolau
frecvent enterovirusuri, ulterior clasificate in genurile de mai sus. Transmiterea lor este digestiva,
replicarea initiala la niveul portii de intrare cu viremie primara la nivelul tesutului limfatic asociat
tractului gastro-intestinal si viremie secundara cu afectarea multor organe interne.

Virusurile Coxsakie si ECHO produc infectii blande. Calea de transmitere consta in


contaminarea alimentelor si a apei cu materii fecale. Cele mai frecvente cazuri sunt la copiii sub
10 ani. Virusurile Coxsackie produc o serie de boli la om: sindroame asemanatoare racelii
comune, miocardita, meningita aseptica si paralizie. Cea mai cunoscuta boala produsa de
Coxackie A este boala mana – picior – gura , o boala a copilariei, produsa adesea de catre
Coxackie A16. Virusurile Coxsackie B produc simptome gastro-intestinale minore, paralizii,
miocardite, malformatii fetale. Cele mai multe infectii cu Coxsackie B sunt blande sau subclinice.

Miocarditele acute de etiologie virală au fost mult timp atribuite infectiei cu virusuri
Coxsackie B, dar in prezent prin biopsia endomiocardului si tehnici de diagnostic molecular au
fost frecvent evidentiate si infectii cu adenovirusuri, parvovirusuri, herpesvirusuri (EBV, HHV6).
In prima fază a infecțiior viremia este urmată de liza cardiomiocitelor, consecință directă a
replicării virale. Totodată are loc activarea răspunsului inflamator. Mulți pacienți se pot vindeca
fără sechele. Puțini însă produc anticorpi care recunosc epitopi virali și epitopi ai cardiomiocitelor
modificate de infecția virală. Urmarea este insuficiența cardiacă determinată de distrugeri ample
ale țesutului cardiac.

Virusurile ECHO nu au fost asociate initial cu manifestari clinice, fiind considerate


nepatogene pentru om. Aceste virusuri insa produc 2/3 din meningitele virale la copii si
adolescenti. Meningita aseptica este frecvent cauzata de virusurile ECHO, dar si de virusurile
Coxsakie. Virusul Coxsakie B este cel mai frecvent asociat cu meningita la varste mai mici de 3
luni. Simptomatologia consta in : febra 38-39 grade Celsius, cu aspect bifazic, cefalee insotita de
fotofobie, redoare de ceafa (apare la varste peste 1-2 ani), mialgii. De obicei aceste manifestari
sunt autolimitate. Examenul citochimic al LCR arata monocitoza usoara, cu nivel normal sau usor
scazut al glucozei, proteine normale sau usor crescute. ECHO 11 este cel mai frecvent serotip ce
determina meningite cronice, la pacientii cu deficit de anticorpi.
Diagnostic:
Enterovirusurile pot fi gasite aproximativ doua saptamani in nazofaringe si mai multe
saptamani-luni in fecale. John Enders si colaboratorii Weller si Robbins au primit premiul Nobel
pentru medicina in 1954 pentru izolarea virusurilor Polio pe culturi de celule de embrion uman.
Izolarea enterovirusurilor pe culturi de celule reprezinta metoda de electie pentru
diagnostic. Susceptibilitatea culturilor de celule la enterovirusuri este variabila. Liniile celulare
din rinichi de maimuta au o sensibiliatate buna pentru poliovirusuri, CoxB si ECHO, in timp ce
liniile celulare din fibroblaste umane diploide si fibroblaste pulmonare din embrion uman sunt
folosite pentru CoxA. Celulele RD, derivate din rabdomiosarcom uman sunt cele mai sensibile
pentru CoxA. Timpul necesar izolarii este de 4-8 zile, dar folosirea culturilor shell vials scade
acest timp la 2-3 zile.

Izolarea virusurilor Cox A pe soarece nou-nascut este cea mai sensibila metoda de izolare,
dar este dificila din punct de vedere tehnic. Virusurile Coxsakie sunt patogene pentru șoarecele
nou-nascut (spre deosebire de ECHO și de polio). Cele din grupul A produc la soarecele inoculat
sub 2 zile de la nastere miozite difuze și pareze flasce, cele din grupul B produc miozite focale și
pareze spastice, miocardite, pancreatite.

Tehnicile moleculare vizeaza amplificarea acizilor nucleici prin RT-PCR si NASBA.


Aceste tehnici sunt indrepate spre regiuni inalt conservate ale enterovirusurilor : 5ˈNCR. Acest
diagnostic este rapid, specific si sensibil. Real-time RT-PCR are avantajul detectiei simultane a
ampliconului, fiind o metoda mai rapida comparativ cu RT-PCR. Produsele patologice folosite
pentru diagnostic sunt : LCR, fecale, sange, exsudat nazo-faringian.

Diagnostic serologic : metodele imuno-enzimatice au rol limitat in diagnosticul infectiei


cu enterovirusuri din cauza marii varietati de serotipuri si din cauza neidentificarii unui singur
antigen comun al enterovirusurilor. Dezavantajul acestor metode este dat si de o sensibilitate
scazuta si reactii incrucisate cu alte genuri ale familiei Picornaviridae. Acest tip de diagnostic
poate furniza informatii epidemiologice, daca un serotip specific este cunoscut sau suspectat intr-
o epidemie. Folosirea serurilor pereche, recoltate in perioada acuta, respectiv in convalescenta, si
cresterea de cel putin 4 ori a titrului de anticorpi in cea dea doua proba, sustin infectia cu
enterovirusuri. Diagnosticul serologic nu este o optiune practica pentru diagnosticul de faza acuta.

Identificarea specifica a serotipului de enterovirus se face prin Reactie de


seroneutralizare cu folosirea de amestecuri de antiser ecvin (metoda Line si Benyesh-Melnick).
Metoda are unele limite: identifica doar 40 dintre serotipurile de enterovirusuri cunoscute,
niciunul dinte enterovirusurile noi si este o metoda laborioasa si necesita timp indelungat. In
prezent se folosesc si anticorpi monoclonali anti-enterovirusuri, serotip specifici. Reactia de
seroneutralizare este metoda standard de a distinge virusurile Polio intre ele si a de le diferentia
de celelalte enterovirusuri si implica neutralizarea izolatelor virale cu un antiser specific.

Profilaxie si tratament:

Vaccinarea este disponibila doar pentru poliovirusuri, iar aceasta nu protejeaza


impotriva serotipurilor de enterovirusuri nonpolio. Pentru a preveni putinele cazuri de
poliomielita asociata vaccinului viu atenuat, administrat oral (Albert Sabin), aceasta vaccinare pe
cale orala a fost abandonata. In prezent se foloseste doar vaccin inactivat, administrat injectabil
(Jonas Salk).

B. Encefalite produse de virusuri

ARBOVIRUSURI

Arbovirusurile (virusuri transmise prin insecte vectoare-arthropode-borne) sunt virusuri


cu genom ARNss, anvelopate. Exista peste 400 de specii, din care numai o parte sunt clasificate
în patru familii distincte: toga-, flavi-, bunya- și arena-viridae. Primele două familii au genom
ARN cu polaritate pozitiva (toga și flavi), celelalte două au genom ARN, segmentat, cu polaritate
negativa (bunya și arena).

Ciclul de viața al arbovirusurilor trebuie urmarit în trei tipuri de gazde:

- rezervorul de virus (pasari și mamifere, salbatice sau domestice)


- insecta vectoare sau, pentru altele, rozatoare- vector (robovirusuri), la care se realizeaza
"incubatia extrinseca" (perioada de timp necesara pentru ca replicarea sa asigure un titru
suficient pentru infectia vertebratelor).
- gazda terminala (dead-end) -omul- la care viremia este insuficienta pentru a favoriza
transmisia interumană în lipsa vectorilor.
Infecțiile arbovirale sunt zoonoze și prevenirea lor este legata de controlul vectorilor.

Studiile de seroprevalența indica raspândirea arbovirusurilor cu preponderența în zonele tropicale


și subtropicale. Arbovirusurile pot provoca însa, focare epidemice și în alte areale. In Romania,
transportul virusurilor și al vectorilor de catre pasarile migratoare explica incidența mai mare a
arbovirozelor în Delta Dunarii și în regiunile limitrofe. Adesea, transportul vectorilor este legat
și de activitatea umană. De exemplu, comerțul transcontinental de fructe poate vehicula insecte
vectoare, explicand apariția unor arboviroze în zone urbane. De asemenea, sanitația precară,
spațiile inundate din subsoluri sunt locuri în care țânțarii pot hiberna, perpetuând rezervorul de
virus de la un an la altul.

Patogenia bolii la om. Dupa mușcatura insectelor vectoare (numai femelele sunt hematofage),
virusul se replica în endoteliul capilar și disemineaza sistemic. Simptomatologia este fie
neurologica (meningo-encefalite), fie numai cutanata (febre hemoragice) sau vizând alte organe
(ficat, articulații etc.). Exista vaccinuri aplicate în arealele endemice (ex. impotriva febrei
galbene, impotriva encefalitei japoneze).

Replicarea arbovirusurilor difera la cele cu genom ARN cu polaritate pozitiva (toga și flavi) de
cele cu genom ARN, segmentat, cu polaritate negativa (bunya și arena).
La primele, genomul funcționeaza ca ARNm care este tradus în proteine structurale și
nestructurale. Asamblarea virionilor maturi se face prin înmugurire la nivelul membranei
celulare.
ARBOVIRUSURI IMPORTANTE PENTRU PATOLOGIA UMANA ÎN EUROPA CENTRALA ȘI DE EST

Specia Familia Vector

V. Encefalitei de capușe Flaviviridae Capușe

V. West Nile Flaviviridae Tânțari

V. Febrei hemoragice Congo- Bunyaviridae Tânțari


Crimeia

V. Tahynia (Lumbo) Bunyaviridae Tânțari

Familia Flaviviridae

Flavivirusurile se replica în insecte vectoare (țânțari) sau la pasari care ramân asimptomatice.
Spectrul bolilor produse la mamifere și om este variat: meningo-encefalite, febre hemoragice,
hepatite, afecțiuni articulare cu rash etc. Nu sunt rare nici infecțiile asimptomatice. Formele
neurologice sunt mai frecvente la batrâni, unde letalitatea poate ajunge la 10% (în România în
cursul epidemiei de meningo-encefalită West Nile din vara 1996 mortalitatea a atins 8%). Alte
flavivirusuri importante sunt virusul febrei galbene (boală pentru care se cere certificat
internațional de vaccinare) și virusul febrei denga (broken- bones disease).

Meningo-encefalita West Nile. Meningo-encefalitele virale sunt mai frecvente decât cele
bacteriene. Examenul biochimic și citologic al LCR oferă o primă indicație asupra etiologiei:
lichidul clar cu valori mici ale celularitatii și proteinorahiei este caracteristic meningo-
encefalitelor virale. Meningo-encefalita West Nile este o infecție sistemică, adesea pauci-
simptomatică, dar cu posibilitatea afectarii SNC într-o proporție semnificativă, în cazul unor
epidemii favorizate de condiții socio-climatice precum secetă, lipsă de sanitație, contact apropiat
cu insectele vectoare etc.

Diagnosticul meningo-encefalitei West Nile se bazează pe evidențierea anticorpilor anti virus


West-Nile de tip IgM (imunoenzimatic). Aceștia pot persista peste 6 luni după infecția acută, dar
reacționează adesea încrucișat cu anticorpi împotriva altor Flavivirusuri (Denga, encefalita
Saint-Louis). Ideal este compararea probelor de ser recoltate la debut și după 3-4 săptămâni,
pentu evidentierea seroconversiei sau a crsterii semnificative a titrului anticorpilor specifici de
tip IgG. In formele neurologice, ambele categorii de anticorpi specifici sunt prezenți în LCR.
Prezența anticorpilor în SNC traduce permeabilizarea barierei hematoencefalice sau/și sinteza
intratecală de imunoglobuline. Detecția genomului viral prin RT-PCR este dificilă, din cauza
titrurilor virale mici. Diagnosticul arbovirozelor este rezervat laboratoarelor cu nivel de
biosecuritate peste 3.

Epidemia meningoencefalita West Nile Romania 1996

• Frecventa cazurilor confirmate 7,2 la 100 000 de locuitori.


• Raport al infectiilor aparente/inaparente 1:325
• Populatie naiva din punct de vedere imunologic
• Au fost izolate doua tulpini virale (una de la tântari capturati în focare epidemice
din Romania;a doua dintr-o proba de LCR recoltata timpuriu în cursul bolii-
confirmare prin virus-neutralizare cu anticorpi din seruri recoltate in
convalescenta si prin RT-PCR)
Evolutie ulterioara- Cazuri izolate fara epidemii recurente

3900 pacienti testati intre 1997-2012 (medie/an 290±197) – doar in 2.3% infectii acute
neurologice WNV, 82.5% confirmate; 59% in mediu urban, 5 decese,

cele mai numeroase 2010 - 47 cazuri confirmate intre iulie- septembrie inclusiv in judete din
centrul si nordul tarii

Epidemie meningoencefalita West Nile 1999- Statele Unite ( Bronx si Queens, NY) –debut ca
epizootie cu mortalitate mare la specii aviare (ciori si pasari exotice din gradina zoologica din
Bronx), asociata cu epidemie de encefalita virala la om ,

– aceiasi tulpina virala si acelasi vector ca si în Romania


– tulpina Kunjin a virusului West Nile, transmis prin tãntari din specia Culex

Evolutie ulterioara - WNV- endemic, epidemii periodice, totalizand peste 37000 infectii
WNV;45% infectii neurologice; peste 1500 decese (4%) si epizootii la cai (15 000 de cazuri
de infectii ecvine în 2002)

Au fost documentate noi cãi de transmitere pe lângã cea mediatã de vectori artropozi: - materno-
fetal (perinatal si prin alãptare); transfuzii de sânge, plasma, masa eritrocitara; transplant de
organe

In 2013 in Europa - 226 cazuri umane in UE si 557 cazuri in tari invecinate: Serbia 302; Rusia
177; Italia 69 ; Israel 63; Romania 24

Virusul Zika (ZIKV) face parte tot din familia Flaviviridae, cu genom ARNss pozitiv
nesegmentat, anvelopat si a devenit o problema de sanitate publica după ce s-au observat o serie
de cazuri de microcefalie apărute la copii născuţi din mame infectate in cursul sarcinii. ZIKV
infecteaza progenitori neurali, determinand crestere anormala si moarte celulara. Consecinţele
microcefaliei la copil sunt afectarea dezvoltării intelectuale şi perturbări ale funcţiilor motorii.
Acestea pot varia de la forme blânde până la forme severe şi vor dura întreaga viaţă, deoarece
pentru microcefalie nu există niciun tratament curativ, doar tratamente simptomatice.

Cele mai frecvente simptome ale infecţiei cu virusul Zika la adult apar cam la 2-7 zile după
înţepătura de ţânţar:
• Febră
• Durere articulară
• Conjuctivită
Diagnosticul diferential se face cu febra Denga si Chikungunya (tabel)

Zika Denga Chikungunya

Febra ++ +++ +++

Rash +++ + ++

Conjunctivita ++ - -

Artralgii ++ + +++

Adenomegalie ++ - -

Mialgii + +++ ++

Cefalee + +++ ++

Petesii - ++ -

Boala la adult este caracterizată de o formă uşoară, care apare numai la 20% dintre pacienti şi
durează de la câteva zile până la câteva săptămâni. Principalele zone geografice afectate au fost
ţări din America de Sud şi America Centrală: Brazilia, Bolivia, Columbia, Costa Rica, Panama,
Mexic şi Venezuela.
România a raportat faptul ca 2016 au aparut cazuri de import de infectie Zika, dar nu exista inca
cazuri indigene; totusi, infectia trebuie supravegheata deoarece virusul Zika este transmis in
principal prin intermediul intepaturilor de tantarilor Aedes aegypti si Aedes albopictus, iar Aedes
albopictus (gasit de obicei in Africa /Asia de Sud) este prezent si in Romania din 2014.

Familia Togaviridae

Familia Togaviridae cuprinde ca patogeni transmisi prin artropode virusurile din genul
Alphavirus – exemplu: Virusul Encefalitei Eqvine de Est

Boli asociate: encefalite umane, mai multe vaccinuri inactivate testate

Rabia

Virusul rabic (gen lyssavirus; lyssa,gr-nebunie) face parte din familia Rhabdoviridae –
virusuri cu genom ARNss nesegmentat, cu polaritate negativa , cu nucleocapsida helicoidala, si
anvelopa ce prezeinta pe suprafata priectii glicoproteice (proteina G -cu rol in atasarea la receptori,
inalt conservata intre diferitele specii, mai putin la liliac, contine determinanti antigeni importanti
in neutralizarea infectivitatii). In aceeiasi familie, dar intr-un gen separat (veziculovirus) este
incadrat si virusul stomatitei veziculare. Morfologia virionului rabic implica virion în forma de
glonț, cu capsida și anvelopa cu proiecții glicoproteice.

Virusul rabic este inalt neurotrop, cu afinitate pentru receptorul acetilcolinic si replicare la nivelul
jonctiunii neuro-musculare. Patogenia este dominata de diseminarea septinevritica a virusului,
initial centripeta (de la nivelul placii neuromusculare periferice de la locul muscaturii catre SNC)
, ulterior centrifuga (din SNC pe calea filetelor nervoase senzitive catre glande salivare, cornee,
glande lacrimale). Interesant, în celulele glandelor salivare virusul se replica și se elibereaza prin
înmugurire la nivelul membranei celulare, ceea ce reprezinta o adaptare eficienta pentru
propagarea infecției la o noua gazda. Incubatia in rabie variaza intre 10 zile si peste 6 luni (in
medie 30-90 zile), in functie de caracterele plagii muscate si specia animalului rabid. Incubatia
lunga permite vaccinarea imediat dupa contactul infectant

Clinic, rabia se manifesta ca o encefalomielita; boala debuteaza cu:

• prodrom (2-10 zile) cu febra moderata, inapetenta, greata, varsaturi, anxietate, fotofobie,
cefalee, tuse, hiperestezie in jurul ranii,
• sindromul neurologic acut (6-12 zile): hiperexcitabilitate a simpaticului (hipersalivatie,
lacrimare, transpiratii), anxietate, agitatie, disfagie, hidrofobie, aerofobie, paralizii,
episoade de delir
• Coma (2-7 zile) care conduce inevitabil catre deces a prin stop cardiac sau dupa o perioada
paralitica prin insuficienta respiratorie
La nivelul SNC virusul se replica exclusiv intraneuronal, cu predilectii in neuronii din cornul
Ammon din hipocamp și în celulele Purkinje din cerebel. Replicarea virala este evidentiata prin
aparitia leziunilor patognomonice: incluzii intracitoplasmatice acidofile, numite corpii Babeș
Negri.

Virusul rabic salbatic este numit "de strada" și are o incubație variabila; pasaje
intracerebrale repetate la aceiași specie stabilizeaza și scurteaza incubația, tulpinile fiind etichetate
ca "virus rabic fix". Leziunile citopatice sunt exclusiv intracitoplasmatice și au aspectul unor
incluzii granulare. Tulpinile de virus fix dau incluzii mici. Corpii Babeș Negri predomina în
neuronii din Aceste leziuni corespund situsurilor replicarii virale. În afara neuronilor și celulelor
glandelor salivare, antigenul rabic mai poate fi evidențiat în cornee, piele, mucoasa bucala -
elemente care au valoare diagnostica.

Rezervorul de infecție în Europa este “silvatic” – la animalele salbatice (vulpi, urși în


special). În alte țari rezervorul este reprezentat de șacali, lupi, raccooni sau lilieci-vampiri. De la
aceștia din urma rabia se poate propaga și prin aerosoli.

Au fost documentate cazuride rabie transmisa prin tranplant de organ: cornee (cel mai
frecvent), dar si 4 cazuri de encefalita letala la primitori de rinichi, ficat, segment de artera iliaca
de la un donator infectat, decedat cu hemoragie intraarahnoidina de cauza initail necunoscuta
(Arjun Srinivasan et al, Transmission of Rabies Virus from an Organ Donor to Four
Transplant Recipients, N Engl J Med 2005; 352:1103-11 Transmission of Rabies Virus from an
Organ donor to Four Transplant Recipients)

Diagnosticul de laborator în rabie este o urgența. El se refera, în primul rând, la


diagnosticul bolii la animalul banuit a fi rabid. Diagnosticul se face prin:

- examinarea creierului pentru incluziile patognomonice Babeș Negri (diagnostic în câteva ore);

- inocularea animalelor de laborator (diagnostic în 4-21 zile)- Soarecele sugar este animalul cel
mai susceptibil;

- diagnostic rapid prin imunofluorescența pentru identificarea antigenelor rabice.

Confirmarea serologica a diagnosticului la animal trebuie facuta, pentru ca animalele pot


muri cu infecții intercurente sau ca urmare a multiplicarii altor virusuri din specimenul de
diagnostic. De asemenea, exista alte incluzii care pot mima corpii Babes Negri.

La câine sau pisica se urmarește comportamentul animalului izolat în cușca – daca


supraviețuiește fara simptome peste 8 zile se exclude diagnosticul de rabie. Daca animalul a fost
sacrificat se urmaresc leziunile din hipocamp si prezenta antigenelor prin imunofluorescența.
La om diagnosticul este dificil și în caz de suspiciune de infectie cu virus rabic se recurge
imediat la vaccinare și seroprofilaxie. Diagnosticul pus dupa apariția simptomelor clinice
echivaleaza cu o condamnare la moarte.

Produsele patologice recoltate sunt:

- saliva recoltata prin aspirare sau cu tampoane, amprente de cornee, biopsii de tegument,
sange, LCR
- Post-mortem: tesut cerebral (segmente de maduva, trunchi cerebral, cerebel,
hipocamp), fragmente de tegument

În biopsiile din jurul plagii sau pe amprente corneene se poate încerca diagnostic rapid prin
imunofluorescența. Detectia ARN viral se poate realiza prin RT-PCR, insa aceasta nu se practica
de rutina. Diagnosticul în rabie trebuie sa fie rapid, sensibil, specific și economic.

Tratament si profilaxie.

In scop terapeutic se practica:

- îngrijirea imediata a ranilor (spalare cu apa, sapun, detergenți anionici),


- seroprofilaxie pasiva (administrare de Ig antirabice: optim imuniglobuline umane antirabice
preparate din plasma donatorilor hiperimunizati- preparat extrem de scump, cu
disponibilitatea redusa. Se administreaza in jurul ranii si intramuscular.
- administrare de vaccin inactivat (in primele 48 de la expunere. In total se recomanda 4-5 doze
a 0.5-1 ml, administrate intramuscular, in decurs de 4 saptamani). Regimul de imunizare
post-expunere se mentine si daca persoana în cauza are antecedente de vaccinare antirabica,
dar in forma modificata, si fara administrae de seroprofilaxie. .
Profilaxie pre-expunere. Imunizarea antirabica cu vaccinul inactivat în scop profilactic se
practica la persoanele cu risc profesional: îngrijitori de animale, personal de laborator, veterinari,
vânatori. Se administreaza 3 doze intradeltoidian la 0,7, 21-28 zile, . OI doza booster poate fi
administrata la 1 an distanta si ulterior la 3-5 ani pentru cei cu risc continuu. Testarea raspunsului
în anticorpi se face la doua - trei saptamâni de la ultima inoculare.

Vaccinarea antirabica a animalelor domestice (obligatorie) si salbatice este metoda


specifică pentru controlul rabiei silvatice. In 90% din cazuri, câinii sunt responsabili de infecția
omului.

Odata aparuta simptomatologia SNC nu exista tratament specific, singura optiune este terapia
suportiva. Foarte putine persoane au supravietuit infectiei rabice – sunt raportate 5 cazuri cu
profilaxie postexpunere tardiva, si un caz fara tratament/ profilaxie tratat prin inducerea unei come
medicamentoase (protocolul Milwakee) . In acest ultim caz, expunerea s-a facut prin muscatura
unui liliac, posibil cu o varianta virala atenuata, iar raspunsul imun inascut a jucat un rol deosebit
in recuperare.

Infectia cu paramixovirusuri noi

Virusul Nipah. Izolat si identificat pentru prima oara in epidemia de encefalite si infectii
respiratorii din Malaezia si Singapore in 1999. Ulterior a fost identificat in alte izbucniri
epidemice din Asia de Sud-Est (India, Bangladesh). Contextul epidemiologic ramane extrem de
important ca unul din primii pasi pentru diagnosticul virusologic.

Diagnosticul virusologic in infectia cu virusul Nipah se bazeaza pe izolarea virala si identificarea


genomului viral prin Rt-PCR avand ca produse patologice LCR, SNF, urina sau sange la debutul
bolii, ulterior putand utiliza si diagnosticul serologic prin identificarea anticorpilor de tip IgM si
IgG.

V. Hendra a fost identificat initial in 1994, in Australia, si determina simptomatologie severa


respiratory si semne de meningoencefalitã; a fost transmis la om prin contact direct cu cai de rasã,
transmiterea realizandu-se prin secretii respiratorii.
RETROVIRIDAE

Familia retroviridae cuprinde trei subfamilii:

• Oncovirinae (virusuri cu potential oncogen);


• Lentivirinae (grupeaza agenți ai unor afecțiuni lent degenerative);
• Spumavirinae (produc infecții persistente, asimptomatice).
Retrovirusurile sunt particulare prin modul de expresie a informatie genetice: desi au genom
ARNss cu polaritate pozitiva, replicarea lor presupune sinteza unui intermediar de tip ADNc,
numit ADN proviral prin reverstranscriere, proces mediat de o enzima virala-
reverstranscriptaza . Ulterior, ADN proviral,va fi integrat în genomul gazdei, sub actiunea
altei enzime virale- integraza, initiind o infectie persistenta. Formarea virionilor progeni se
relizeaza prin sinteza unor specii de ARNm de catre polimeraza celulara II, utilizând ca
matrița provirusul integrat, acesta va servi ca atat ca ARN progen, cat si pentru transcrierea
proteinelor structurale virale

VIRUSUL IMUNODEFICIENTEI UMANE DOBADITE (HIV)

Sindromul de imunodeficit dobândit (SIDA sau AIDS, din engleza) este o suferința
cronica datorata infecției cu virusul imunodeficienței umane (HIV). Boala trebuie înțeleasa în
complexitatea ei incluzând patru stadii: infecția primara, stadiul asimptomatic, ARC (Aids
Related Complex) și sindromul de imunodeficienta dobândita (SIDA/AIDS).

Origine. Infecția HIV poate fi considerata inițial o zoonoza, în care agentul etiologic –un virus
simian (SIV- virusul imunodeficienței simiene) s-a adaptat treptat la om. Exista doua tipuri
antigenic distincte ale virusului HIV:
- HIV1 (ce domina pandemia umana), derivat din SIV ce infecteaza o specie particulara
de cimpanzei (Pan troglodites troglodites) si
- HIV2 (un tip viral mai atenuat ,cu distributie geografica mai restrictiva, in general in
Africa de Vest, zonele cu prevalenta inalta fiind Guinea-Bissau si Senegal)- derivat din
SIV ce infecteaza sooty mangabey.
Exista o serie de argumente pentru originea HIV din virusurile simiene : similitudini in
organizarea genomului, inrudire filogenetica; prevalenta in gazda naturala; areal geografic
comun; cai plauzibile de transmitere (contact percutan/permucos cu fluide provenite de la

84
primate infectate in cursul vanatarilor si sacrificarii animalelor). Testarea neinvaziva (detectie
de anticorpi specifici si acid nucleic viral in probe de materii fecale si urina, recoltate de la
primate ce traiesc in salbaticie) a permis documentarea a cel putin patru transferuri distincte ale
SI cpz catre specia umana, cu aparitia unor grupe HIV1, filogenetic distincte: M (grupul
principal, responsabil de mai mult de 95% din infectiile HIV), O (outlier, gasit in Africa de Vest
şi Centrală, infectand aproximativ 15000 de persoane in Camerun, recent s-a sugerat ca ar putea
proveni dintr-un virus simian ce infecteaza gorilele sălbatice), P (izolat recent de la o persoana
din Camerun) si N (izolat in 1998, ulterior foarte rar, la circa 50 de persoane din Camerun) .
Cea mai veche proba de plasma umana infectata cu HIV1 provine din 1959, de la un
barbat din Congo (secventierea virusului din acesta proba s-a realizat in 1998)
De la traversarea barierei de specie de la cimpanzeu la om (cu aproximativ 7 decenii în urma)
HIV 1 s-a diversificat pe masura ce pandemia umana a evoluat. In prezent circula multe
subtipuri, toate apartinand grupului principal M-“main”, notate A-I, si forme recombinate unice
sau circulante, rezultate probabil din suprainfecții ale unui subiect cu mai multe subtipuri,
succesiv. Subtipul HIV-1 cu prevalenta caea mai ridicata in prezent este subtipul C,
predominant în ţările subsahariene (unde se află două treimi din persoanele infectate), în ţările
Africii de Est, în India şi în sudul Braziliei. Subtipul A este prevalent în Africa Centrală, Europa
de Est şi Asia Centrală si devine din ce in ce mai raspandit la utilizatorii de droguri din toate
regiunile globului, subtipul B predomina in Europa de Vest si SUA, iar in România circula un
subtip particular, numit F, ce nu a mai fost raportat decat in America Latina (mai ales in
Brazilia) si in Angola. Identificarea subtipurilor are implicații privind lamurirea cailor de
transmitere, evoluția rezistenței la medicamente și perspectiva prepararii unui vaccin.

Morfologia virionului. HIV aparține familiei Retroviridae, subfamilia lentivirinae.


Genomul HIV este diploid, reprezentat de doua copii identice ARNss cu polaritate pozitiva,
alcatuite din mai multe gene suprapuse: structurale: (env, gag si pol), reglatorii (rev, tat, nef) si
de maturare (vif, vpu, vpr).
Genomul prezinta la capete o serie de secvente noncodante importante pentru replicarea virala:
asa numitele LTR (long terminal repeats) ce asigura corectitudinea sintezei ADN proviral in
cursul reverstranscrierii, si ofera semnale importante pentru integrarea si impachetarea
genomului; precum si primeri pentru initierea reverstranscrierii.

Genele structurale env codifica proteinele de anvelopa (gp 160- precursor-; gp 120- de
suprafata- ce va lega receptorul CD4 si coreceptorii virali si gp 41 -transmembranara – factor

85
de fuziune). Genele gag codifica antigenele de grup (matrice p17, capsidara p 24 si
nucleocapsida -p 7). Genele pol codifica complexul polimerazic: reverstranscriptaza -p 55/66;
integraza- p 11 si proteaza p 32.

Proteinele codificate de genele structurale pot fi separate electroforetic in gel de poliacrilamida,


dupa denaturare cu sodium-dodecil-sulfat (SDS-PAGE), in functie de greutatea lor
moleculara, si ulterior pot fi transferate pe o membrana de nitroceluloza, servind pentru
identificarea anticorpilor specifici anti -proteine structurale in serul pacientilor -testul de
confirmare Western Blot.

Receptori si coreceptori HIV. Celelulele tinta in infectia HIV sunt cele care prezinta pe
suprafata receptori CD4: limfocite T helper, monocite/macrofage fixe (celulele Kuppfer,
celule endoteliale, celule gliale etc), celule foliculare dendritice (CFD). Atasarea gp120 la
receptorii CD4 induce modificari conformationale in structura acesteia, ce permit cuplarea
coreceptorilor. Pentru HIV s-au descris nu mai puțin de 10 coreceptori, cei mai importanti sunt
receptorii pentru betachemokine (CCR5), regasiti mai ales pe suprafata macrofagelor si
celulelor prezentatoare de antigen si receptorii pentru alfa chemokine CXCR4, prezenti mai
ales la suprafata limfocitelor Th.

Impactul coreceptorilor aupra evolutiei infectiei. Tropismul celular al izolatelor HIV variaza
in functie de evolutia bolii:

- In infecția primara predomina izolate macrofagotrope (M-trop) și nonsincițizante


(NSI). Aceste izolate utilizeaza coreceptorul pentru beta-chemokine notat CCR5
- In infecția tardiva izolatele sunt cu tropism pentru limfocite (T-trope) și sincițizante
(SI). Aceste tulpini utilizeaza coreceptorul pentru alfachemokine- fusina - CXCR 4.

Extrem de interesant , la nivelul CCR5 a fost descrisa o deletie de 32 de perechi de baze, care
poate fi prezenta: pe o singura alela: genotip CCR5 delta 32 heterozigot ( prezent la 10% din
populatia caucaziana), ce genereaza o evolutie lenta a infectiei HIV (nonprogresori,
supravietuitori de lunga durata) sau pe ambele alele: genotip CCR5 delta 32 homozigot
(prezent la <1 % din populatia caucaziana, niciodata la rasa neagra), ce genereaza rezistenta
la infectia naturala HIV (pacienti expusi, dar neinfectati HIV). Aceasta particularitate a fost
utilizata in scop terapeutic, in singurul caz cunoscut de vindecare a infectie HIV: pacientul
”Berlin”. Este vorba de un pacient infectat HIV , diagnosticat cu leucemie mieloida acuta, ce
a primit un transplant de celule stem hematopoietice de la un donator cu genotipul homozigot

86
CCR5 delta32 , dupa ablatia maduvei osoase. Pacientul a eradicat complet infectia HIV,
ramanand cu viremie nedetectabila si cu supresia completa a rezervoarelor virale in absenta
oricarei terapii antiretrovirale. In prezent se incearca abordari de terapie genica prin
transplantul unor celule autologe de la pacienti HIV pozitivi, dupa întreruperea expresiei
coreceptorilor CCR5 in vitro, cu nucleaze de tip zinc finger, insa rezultatele sunt modeste.

Replicare.
Dupa atasarea virionului la receptori si coreceptori prin gp120, internalizarea HIV se face prin
fuziunea anvelopei cu membrana celulara, fenomen mediat de gp 41. Efectul citopatic al HIV
este sincițizant. (Schematic internalizarea HIV urmează pași succesivi: atașarea gp 120 la
receptorul CD4; modificări conformaționale care permit cuplarea coreceptorilor de
glicoproteina gp 41;fuziunea anvelopei cu membrana celulei țintă).
Dupa decapsidare are loc prima etapa a cresterii logaritmice: reverstranscrierea ARNss in
ADN proviral. Reverstranscriptaza virala sintetizeaza inițial o singura spira ADN pe matrița
ARN viral, iar apoi și spira ADN complementara.Urmeaza translocarea ADN proviral în
nucleul celulei infectate si insertia în genomul gazdei prin acțiunea integrazei – o alta
enzima a HIV si a secvențelor genomice de la captele ADN proviral, numite LTR (long
terminal repeats). Integrarea are ca urmare dezvoltarea unei infecții lente, în timpul careia
secvențele ADN provirale nu pot fi deosebite de ADN celular, urmând aceleași reguli de
traducere a informației genetice.

In urma transcrierii ADN proviral rezulta mai multe specii de ARNm, care vor servi fie
ca genom progen (ARNss, cu polaritate pozitiva), fie ca matrita pentru traducerea proteinelor
virale. Acestea sunt sintetizate sub forma unui precursor polipetidic gag-pol, clivat ulterior in
proteine individuale sub actiunea proteazei virale. Eliberarea virionilor progeni se face prin
inmugurire.

Exista o serie de factori virali si celulari care moduleaza replicarea virala:

Proteine celulare care incearca sa se opuna replicarii virale:


TRIM5α (TRIpartite Motif) la primate intervine in degradarea
complexului de reverstranscriere in
proteazomi
APOBEC3G citozin deaminaza converteste citozina in uracil in cursul
(inactivata de proteina vif a HIV) sintezei ADNss(-) – este

87
Theterina- factor restrictiv al gazdei- blocheaza eliberarea virionilor prin
inductibil de IFN (inactivata de proteina ancorarea acestora la nivelul rafturi lipidice
vpu a HIV). membranare bogate in colesterol;

FACTORI VIRALI IMPLICATI IN REPLICAREA HIV


Gene de maturare (neesențiale pentru maturarea in vitro, în culturi de celule, dar
importante pentru patogenitate in vivo):

Vpr promoveaza transportul intranuclear al


complexului preintegrativ (ADN proviral)

Vif- promoveaza infectivitatea virionilor,


stimuleaza formarea ADN proviral, prin
blocarea APOBEC3G celular

Vpu creste eliberarea virionilor HIV,


antagonizeaza activitatea theterinei prin
interactiune directa cu domeniul TM

Gene reglatorii:

Tat - transactivator al promoterului HIV,


implicata în relația cu factori de
transcriere celulari

Rev activatoare a producției de virus, stimuleaza


exportul citoplasmatic al ARNm si
faciliteaza transcrierea preferentiala a ADN
proviral

Nef creste infectivitatea virala, interactioneaza


cu proteine celulare implicate in
semnalizarea celulara permitand
supravietuirea pe termen lung a LT helper
infectate si promovarea apoptozei LT
neinfectate ,

88
Cai de transmitere

➢ Percutan sau permucos, prin contact cu fluide infectioase provenite de la persoane


infectate- (prin injectii, transfuzii, manevre stomatologice sau chirurgicale cu
instrumentar incorect sterilizat, folosirea in comun de ace, seringi şi alte instrumente
necesare consumului de droguri, tatuaje, piercing, etc). Toti donatorii de sange sunt
testati serologic pentru infectia HIV, totusi trebuie considerat si riscul rezidual asociat
tranfuziilor (donatori aflati in faa de fereastra serologica).
➢ Sexual (homo si heterosexual). Utilizarea constanta, cu toti partenerii sexuali, a
prezervativului reduce riscul de transmitere a infectiei.
➢ Materno-fetal (intrapartum; peripartum si post-partum). In absenta masurilor
profilactice riscul transmiterii materno-fetale este de 15-30%. Transmiterea se
realizeaza mai ales in cursul nasterii (intrapartum); posibil post-partum (inclusiv prin
alaptare). Transmiterea este- dependenta de incarcarea virala si stadiul de imunosupresie
al mamei in momentul declansarii travaliului, precum si de durata travaliului.

Simptomatologia infectiei HIV

Monitorizarea evolutiei naturale si sub tratament a infectiei HIV se realizeaza prin urmarirea
parametrilor clinici, imunologici (numar celule CD4 pozitive - normal :500-1200c/mm3, 40-
68% din total limfocite si raport CD4/CD8-normal >1) si virusologici (incarcare virala - nr
copii ARN HIV /ml plasma). Supraviețuitorii de lunga durata (“longsurvivori” sau
nonprogresorii pe termen lung- 4-7% din persoanele HIV pozitive) au infecție HIV serologic
demonstrata (mai veche de 7 ani la adulți sau mai veche de 5 ani la copii) dar asimptomatica,
cu numar limfocitelor CD4 pozitive constant peste 500/ml, si viremie minima , in absența
oricarui tratament antiretroviral. Acestia au raspuns Tcitotoxic putenic si pastreaza arhitectura
a ganglionilor limfatici. ara

Infecția HIV prezinta urmatoarele stadii clinice:

1. infecția primara (sindrom retroviral acut) - sindrom pasager asemanator mononucleozei


infecțioase sau complet asimptomatic

89
2. infecția asimptomatica; de latenta clinica (cu sau fara limfadenopatie generalizata)
3. Infectia simptomatica timpurie (numita anterior ARC -AIDS related complex)-in care apar
infecții oportuniste (IO) fara risc vital (leucoplakia orala paroasa, candidiaze).
4. SIDA/ AIDS – etapa marcata de evoluția unor IO cu risc vital, de neoplasme oportuniste sau
de manifestari directe ale citopatogenitații HIV care, de asemenea, amenința viața (exemplu:
encefalopatia HIV). SIDA este definita de scaderea numarului de celulel CD4 sub 200/ml,
indiferet de simptomatologie , cateodata se foloseste termenul de infectie HIV avansta pentru
etapa un care numarul celulelor CD4 scade sub 50/ml.

Patogenie.

In infectia primara, virusul infecteaza preponderent macrofagele, care joaca rolul unui cal
troian, permitand diseminarea in ganglionii limfatici. In ciuda simptomatologiei nespecifice
sau absente, titrul viral este ridicat (> 10 milioane copii ARN HIV/ml); are loc si se
inregistreaza o scadere tranzitorie a numarului de celule CD4+. De cele mai multe ori aceasta
etapa coincide cu fereastra serologica (cand anticorpii specifici nu s-au dezvoltat), ceea ce
creaza un risc rezidual pentru transfuziile de sange, in absenta testarii acidului nucleic viral.
In acesta etapa se formeaza si rezervoarele virale (sub forma ADN proviral integrat celular)
la nivelul SNC, organelor limfoide centrale, tractului genital etc), care sunt inaccesibile
raspunsului imun sau terapiei antiretrovirale.

In faza asimptomatica, se stabileste echilibrul între replicarea virala si raspunsul imun, cu


valori relativ normale ale numarului de limfocite CD4, si viremie scazuta in raport cu etapa
anterioara, chiar în absenta oricarui tratament. Aceasta perioada de latenta clinica poate dura si
10 ani. In acest timp insa, in ganglionii limfatici (și în alte organe limfoide centrale), replicarea
virala este foarte productiva: în fiecare zi circa 10 miliarde de virioni sunt produși. 99% din
acești virioni sunt produși de limfocitele CD4 în urma unei infecții litice (semiviața lor este de
numai 1,6 zile). Efortul sistemului imun de-a balansa citopatogenitatea virusului se traduce prin
diviziunea rapida a precursorilor limfocitari. Mult timp numarul limfocitelor CD4 în periferie
ramâne constant (>500 celule/mmc), însa declinul acestui numar precede intrarea bolnavului în
stadiul simptomatic. Eficienta raspusului imun in infecția primara influenteaza nivelul
incarcarii virale, fixand un asa numit “set-point” (o anumita concentrație plasmatica a
virusului). Cu cât raspuns imun este mai puternic, cu atat nivelul incarcarii virale este mai mic,
iar evoluția ulterioara este mai buna, cu progresie lenta catre SIDA. Balanța dintre factorii
inductori și supresori ai replicarii virale influențeaza cursul bolii.

90
Etapa simptomatica apare in momentul in care capacitatea sd de refacere a numarului de
limfocite din periferie se epuizeaza, in timp ce virusul se replica continuu, scapand de sub
supravegherea imuna si producând o infecție progresiva, cu mortalitate ridicata. Eludarea
raspunsului imun se explica prin marea variabilitate a genomului retroviral datorată numărului
mare de erori ale reverstranscriptazei virale, ce nu dispune de uni mecanism de corectie a
incorporarilor gresite de nucleotide, frecventelor recombinări din timpul reverstranscrierii,
precum şi nivelului crescut al replicării HIV-1 (10 miliarde de virioni fiind produsi în fiecare
zi).
Principalele caracteristici ale infecției simptomatice HIV la om sunt:
- Replicare virala masiva în țesutul limfoid,cu selectia tulpinilor limfotrope, ce
utilizeaza receptorii CXCR4, sincitizante
- Depleția limfocitelor T CD4+ infectate, mai ales la nivelul mucoaselor(GALT),
cu scadere progresisva ulterioara in sange, pana la pragul de 200 celule/ml, care
defineste SIDA imunologic
- Hiper-reactivitate imuna generalizata, cu activarea imuna aberanta, mediata atat
de produsii virali cat si de imbalanta intre citokine, translocatie bacteriana si
reactivarea virusurilor latente-

Acestea conduc la epuizarea sistemului imun (in faza de SIDA); declinul capacitatii
regenerative celulare si imunosenescenta
Cel mai frecvente infectii oportuniste sunt virale (reactivari ale herpesvirusurilor latente,
leucoencefalopatia progresivă multifocală-infecție cu papovavirusul JC, molluscum
contagiosum -infecție cu poxvirusul molluscum contagiosum), bacteriene (Pneumocystis
carinii, tuberculoza atat cu Mycobacterium tuberculosis, cat si cu Mycobacterium avium
complex) și fungice (criptosporidiaza și microsporidiaza).

Cauze importante de mortalitate la pacientii HIV pozitivi sunt hepatitele cronice- prin
coinfecții cu VHB sau/și VHC, neoplaziile (in special cele cu etiologie virala- sarcomul
Kaposi- reactivarea herpesvirusului uman HHV8; cancerul de col uterin- infectie persistenta
cu HPV cu risc oncogen inalt, leucemii si limfoame- reactivarea infectiilor cu EBV),

91
Medicamente antiretrovirale

Medicamente antiretrovirale (ARV) folosite în tratamentul infecției HIV sunt inacadrate dupa
mecanismul de actiune in șase clase farmacologic diferite. Principalele clase de antiretrovirale

Clasa de ARV / Mecanism de actiune Reprezentanti Reactii


Abrevierea adverse
internațională frecvente
Inhibitori Competitie cu Zidovudina greata,
nucleozidici/nucleotidi nucleoz(t)idele (azidothymidine varsaturi, rash,
ci ai fiziologice, AZT), neuropatie
reverstranscriptazei/ incorporarea Didanosine, periferica,
NRTIs preferentiala in lantul (dideoxyinosine, ddI) acidoza lactica
ADNc nascent si Stavudine (d4T) cu steatoza
blocarea elongarii Abacavir (ABC) hepatica si
acestuia Tenofovir disoproxil pancreatita
Compusii sunt inactivi fumarate (TDF)
ca atare, necesita
fosforilarea
intracelulara
Inhibitori non- Blocheaza direct Nevirapine ( NVP) rash, hepatita
nucleozidici ai situsul catalitic al RT Efavirenz (EFV) severa (NVP)
reverstranscriptazei Delavirdine (DLV)
NNRTIs- Etravirine,
Rilpivirine
Inhibitori de protează Blocheaza situsul Nelfinavir (NFV) complicatii
PI catalitic al proteazei, Fosamprenavir (FOS- metabolice
impiedica clivarea APV) hiperglicemie
precursorilor gag-polsi Saquinavir (SQV) sau diabet,
maturarea virionilor Indinavir (IDV) dislipidemie,
progeni Tipranavir (TPV) lipodistrofie,
Darunavir distributie
Atazanavir anormala a
*Ritonavir (booster tesutului
farmacocinetic- creste adipos
nivelul plasmatica l
celorlalti PI prin
actiune asupra
citocromului P450 )
Inhibitori ai integrazei Inhiba legarea ADN Raltegravir rash, greata,
INSTIs (integrase proviral (complex Dolutegravir varsaturi,
strand transfer preintegrativ) la ADN diaree
inhibitors) celular

Inhibitori ai fuziunii Stabilizeaza Enfuvirtide dureri, abcese


conformatia gp41, la loc injectare
inhiba internalizarea

92
Antagoniști receptor Blocant al Maraviroc Influenza –
CCR5 coreceptorilor pt beta like, dureri
chemokine, prin abdominale
schimbari
conformationale ale
acestora impiedica
atasarea HIV

O alta clasa de inhibitori ai atasarii la receptorii CD4 se afla in studii clinice avansate- cel mai
promitator reprezentant este Ibalizumab - un anticorp monoclonal umanizat anti CD4 -in curs
de aprobare.

Terapia in infectia HIV se bazeaza pe administrarea unor combinatii divergente de ARV –


numita cART (combined antiretroviral therapy) sau HAART (highly active antiretroviral
therapy), care ofera supresie masiva a replicarii virale, cu efecte adverse limitate. Aceasta
terapie este compusa din cel putin trei medicamente diferite, obisnuit doi inhibitori nucleozidici/
nucleotidici de reverstranscriptaza (INRT), asociati fie cu un inhibitor non-nucleozidic de
reverstranscriptaza (INNRT), fie cu un inhibitor de proteaza (IP) sau un inhibitor de integraza.
Exista la ora actuala o serie de combinatii medicamentoase care se pot administra in doza unica,
ceea ce creste mult aderenta pacientilor.

Exista, de asemenea, si combinatii medicamentoase intre mai multe ARV, administrabile in


doza unica, pentru a creste caliatatea vietii si complianta pacientului.

In prezent se recomanda initierea tratamentului ART la toți pacientii diagnosticati cu infecție


HIV, indiferent de numarul de CD4. Aceasta recomandare tine cont de faptul ca o initiere
precoce a terapiei evita degradarea imunologica, scade gradul de inflamatie si de activare a
sistemului imun, caracteristic infecției HIV cronice si previne anomaliile functionale ale .
celulelor T, precum si de posibila diminuare a rezervoarelor virale.

Toate schemele terapeutice trebuie să asigure:

- scăderea rapidă si durabila a încărcării virale, optim la nivel nedetectabil (<50


copii/ml);
- refacerea numărului de limfocite CD4 (peste 500 cel/ml)
- evitarea aparitiei IO sau, optim, mentinerea pacientului in stadiul asimptomatic
- întârzierea emergenței mutantelor rezistente

93
In afara efectelor adverse cumulative (deloc neglijabile), un factor limitativ important in cursul
tratamentului antiretroviral este aparitia mutantelor virale rezistente. In general NRTI si
NNRTI au bariera joasa de rezistenta, dar rezistenta la PI se dezvolta mai greu. Combinatiile
scad riscul emergentei tulpinilor rezistente, dar nu il elimina complet. In plus aceste tulpini
rezistente se pot transmite, la ora actuala intre 5-15% cazurilor nou confirmate sunt cu astfel
de mutante.

Tratamentul disponibile la ora actuala nu asigura eliminarea completa a viruului si nu pot


determina vindecarea infectiei. Antiretroviralele nu au penetrabilitate buna la nivelul
sanctuarelor tisulare (ganglioni limfatici, SNC, tract genital) si nu actioneaza aupra provirusului
integrat. De asemenea, intreruperea tratamentului determina reluarea rapida a replicarii virale,
datorita rezervoarelor de ADN proviral integrat, in special in limfocitele de memorie, astfel
incat terapia cART trebuie mentinuta toata viata.

Administrarea antiretroviralelor pentru prevenirea infectiei HIV


A. Preventia transmiterii materno-fetale se realizeaza prin:
- Tratament antiretroviral administrat mamei, in vederea scaderii incarcarii virale (optim la
nivel nedetectabil) si nou nascutului, timp de 6 saptamani, cu initiere cat mai rapida dupa
nastere
- Cezariana de electie (interventia cezariana efectuata inaintea rupturii membranelor, dupa
saptamana 37 de sarcina). Cezariana de urgenta (dupa inceperea contractiilor sau dupa
ruptura membranelor, indiferent de varsta gestationala) determina o expunere prelungita a
fatului la secretiile genitale si este asociata cu risc mai mare de transmitere a virusului)
- Evitarea alaptarii pentru prevenirea transmiterii postpartum a HIV.
In prezent OMS recomanda trei optiuni terapeutice:

- Monoterapie cu zidovudina administrata mamei antepartum (preferabil din


saptamana 14) si intrapartum precum si nou nascutului timp de 6 saptamani
- Doza unica de nevirapina pentru mama la debutul travaliului si nou nascut in
primele 48 de ora de viata
- Tripla terapie ca profilaxie antepartum din saptamana 14, intrapartum, si in primele
7 zile postpartum daca mama alapteaza

94
Ghidul european recomanda tripla terapie (HAART) ca profilaxie (din saptamana 28 de
sarcina) si tratament timp de 6 saptamani adminstrat nou nascutului. Alaptarea este
contraindicata.

B. Profilaxia post-expunere

Dupa expuneri ocupationale la fluide potential infectioase (sange, tesuturi, lichid


cefalorahidian, sinovial, pleural, peritoneal, pericadic, amniotic, suspensii virale), provenite
de la o pesoana diagnosticata cu infectie HIV, se recomanda administratrea profilaxiei post
expunere (initiata cat mai rapid, optim in primele 4 ore, admis in primele 72 de ore), daca
exista solutii de continuitate la nivelul tegumentelor sau contact prelungit/cu cantitati
semnificative la nivelul mucoaselor. Se administreaza biterapie (2 NRTI: ZDV + 3TC/ d4T +
3TC/ TDF + 3TC) sau triterapie (cu NRTI mentionati anterior in asociere cu un inhibitor de
proteaza) timp de 28 de zile.

C. Profilaxia preexpunere (PrEP) este o noua strategie de prventie ce consta in


administrarea de antiretrovirale persoanelor neinfectate HIV, dar care fac parte din grupe
cu risc crecut de achizitie a infectiei. PrEP consta in administrarea zilnica orala a unei
combinatii cu doza fixa de tenofovir disoproxil fumarate (TDF, 300 mg) si emtricitabina
(FTC, 200 mg), comercializata sub numele Truvada. Aceasta metoda este recomandata in
SUA pentru preventia transmiterii HIV la adultii hetero- si homosexuali cu risc inalt de
achizitie a virusului, la cei din cupluri serodiscordante si la utilizatorii de droguri
injectabile

Strategii in vederea vindecarii infectiei HIV.

Exista la ora actuala cazuri documentate de pacienti capabili sa controleze replicarea virala dupa
intreruperea fortuita a tratamentului , precum si un caz unic de eradicare completa a infectiei
(fara replicare virala activa si fara rezervoare detectabile)- - pacientul Berlin (post transplant de
celule stem de la donator homozigot pentru mutatia de 32 bp in gena CCR5, fara tratament ART
din 2007, fara semne de recadere) Hutter , NEJM 2009. Pornind de la aceste exemple se
testeaza mai multe strategii in vederea eradicarii complete a rezervoarelor virale, si obinerii
vinedcarii in infectia HIV.

1. Eliminarea replicarii virale reziduale- intensificarea cART (fara rezultate pe rezervoare)


cu initiere foarte timpurie a tratamentului (inainte sau imediat dupa seroconversie)

95
2. Terapie genica:
- blocarea expresiei coreceptorilor CCR5 (knock-out CCR5 -Host gene editing)- zinc
finger nucleaze (Tebas NEJM 2014)- reducerea a viremiei cu1-2 log;
- silentiere genica si inhibitori endogeni HIV (vector lentiviral pt knovk down CCR5
si inhibitor de fuziune la nivel membranar)
3. Stimularea expresiei virusului latent din rezervoare (inhibitori HDAC- vorinostat,
panobinostat, romidepsin- impact asupra condensarii cromatiniene si transcriptiei
virale, activatori PKC)
4. Stimularea imunitatii inascute(IFN alfa) si adaptative (inclusiv vaccinare terapeutica cu
vector CMV )

Perspectiva unor vaccinuri în infecția HIV.

Numai câteva vaccinuri anti HIV candidate au trecut în studii clinice:

- vaccin subunitar produs prin tehnologia ADN recombinant care sintetizează


glicoproteina gp 120 cu epitopi ai subtipurilor B sau B și E (AIDSVAX B/B and
AIDSVAX B/E);
- vaccinul produs pe platforma adenovirusului tip 5 recombinant care exprimă
proteinele HIV-1 Gag, Pol, și Nef;
- Vaccinuri produse pe platforma virusului vaccinal recombinant ALVAC-HIV
vCP1521;
- Combinații secvențiale ale vaccinurilor menționate mai sus.
Totuși, peste 50000 voluntari umani, înrolați în peste 200 trialuri clinice, au fost vaccinați
fără a se obține rezultate concludente.

Epidemiologie) 9931

La 31 decembrie 2018 numarul cumulat de cazuri raportat de Romania (perioada 1985-2018)


era de 23.892 pacienti. Numărul de cazuri HIV/SIDA în viață trece de 15.500, numărul de
cazuri noi înregistrate anual este în jur de 600. Grupele de risc care furnizează cel mai mare
număr de cazuri noi sunt consumatorii de droguri și homosexualii (MSM- men having sex
with men).

96
La nivel global, numărul celor infectați este în jur de 37 milioane (predominant în Africa
subecuatorială). Anual se înregistrează 2,5 milioane cazuri noi (din care aprox. 300.000 la
copii infectați materno-fetal) și 1,5 milioane decese. Programul Organizației Națiunilor Unite
pentru AIDS (UNAIDS) are drept obiective: zero noi infecții, zero decese prin AIDS, zero

97
HEPATITE VIRALE

Hepatitele virale sunt afecțiuni inițial asemanatoare ca simptomatologie, dar cu evolutie


clinica si prognostic complet diferite, determinate de de o serie de virusuri hepatotrope,
din familii taxonomic distincte. Virusurile cu tropism exclusiv pentru hepatocit sunt
numite virusuri hepatitice și cuprind:

A. Virusurile hepatitelor cu transmitere enterica (digestiva, fecal-orala) :


-Virusul Hepatitic A (VHA) din familia Picornaviridae, genul Hepatovirus
- Virusul Hepatitic E (VHE) din familia Hepeviridae

B. Virusurile hepatitelor cu transmitere predominant parenterala


(percutana/permucoasa):
 Virusul Hepatitic B (VHB) din familia Hepadnaviridae
 Virusul Hepatitic C (VHC) din familia Flaviviridae, genul Hepacivirus
 Virusul Hepatitic delta, -virus defectiv,neincadrat taxonomic intr-o familie
O serie de virusuri nou descoperite (un flavivirus inrudit in proportie de sub 30% cu VHC,
numit provizoriu virus hepatitic G- cu 2 izolate VHG si GB tip C si un anellovirus-TTv)
sunt incomplet caracterizate, si, desi sunt regasite cu prevalenta mare in randul
donatorilor de sange, nu par a reprezenta cauze importante pentru hepatitele acute sau
cronice.

A. HEPATITELE CU TRANSMITERE ENTERICA

VIRUSUL HEPATITEI A (VHA)


Caracteristici structurale. HA este prototipul unui gen separat în familia picornaviridae
numit Hepatovirus care determina peste 90% din hepatitele virale acute. Este un virus cu
genom ARNss, cu polaritate pozitiva, de talie mica (~30 nm), neanvelopat. Lipsa
anvelopei explica rezistența VHA la dezinfectante, la actiunea enzimelor proteolitice, a
pH-ului acid al sucului gastric si a sarurilor biliare. De asemenea,VHA este rezistent la
caldura; numai fierberea la peste 85oC, pentru cel puțin 3 minute, inactivandu-l.
Transmitere. VHA este transmis prin ape si alimente contaminate cu materii fecale (apa
neclorinata, apele minerale din surse neverificate, bauturile nesterilizate, cuburile de
gheața; fructele si legumele proaspete, înghețata, fructele de mare și alte alimente
neprelucrate termic.
Patogenie. Hepatita A este o boala cu transmitere digestiva, cu replicare virala la nivelul
orofarigelui, diseminare la ganglionilor limfatici mezenterici si tesutului limfatic din
placile lui Peyer, excretie prin bila, replicare in hepatocit, si eliminare prelungita (cateva
saptamani). In materiile fecale. Incubația este lunga, până la 30 zile, iar infectia ramane in
multe cazuri (mai ales la copii) asimptomatica. In România, peste 80% din copiii sub 10
ani au trecut prin infecție, de cele mai multe ori forme asimptomatice.
Clinica. In cazurile clinic aparente simptomatologia se caracterizeaza prin: stare generala
alterata, astenie, anorexie, greața, febra, urmate de un sindrom icteric, datorat precipitarii
bilirubinei directe, exprimat prin colorarea in galben a tegumentelor si mucoaselor, urini
hipercrome, scaun decolorat, insotit de hepatomegalie dureroasa la palpare. Rareori (1 la
mie de cazuri), la adulți pot apare forme severe de hepatite fulminante, cateodata letale.
Infectia VHA nu cronicizeaza niciodata, majoritatea cazurilor se vindeca, iar imunitatea
persista toata viata asigurand protectie impiotriva reinfectiilor.
Diagnostic.
Infecția acuta: evidențierea anticorpilor anti VHA de tip IgM (prin ELISA de captura).
Infectie vindecata sau vaccinare: evidențierea anticorpilor anti VHA de tip IgG (persista
toata viața dupa boala naturala sau dupa vaccinare)- prin ELISA indirecta sau de
competiție.
Profilaxie.
Pre-expunere: administrarea unui vaccin anti VHA inactivat. Acesta nu este inclus între
imunizarile obligatorii în România, insa se recomanda tuturor copiilor inainte de
intrarea in colectivitate.
Postexpunere: administrarea de imunoglobuline într-o doza unica de 0,02 ml/kc. Aceasta
concentrație mica de imunoglobuline standard (preparate din plasma donatorilor)
conține suficienți anticorpi anti VHA pentru a preveni infecția sau pentru a atenua
simptomatologia
- Respectarea masurilor de igiena personla si in colectivitate, asigurarea surselor de
apa potabila siutilizarea unor agenti cirulicizi pentru dezinfectie si decontaminare.

VIRUSUL HEPATITEI E (VHE)


Caracteristici. Virusul Hepatitei E (VHE) aparține familiei Hepeviridae. VHE este un
virus neanvelopat cu genom ARN cu polaritate pozitivă cu dimensiuni relativ mici ∼7.2
Kilobaze. Proteinele virionului sunt transcrise pe trei cadre de citire distincte. Au fost
caracterizate 4 genotipuri: 1 și 2, care infectează numai omul și sunt asociate cu epidemii
în țările în curs de dezvoltare; respectiv genotipurile 3 și , izolate in Europa si SUA, care
infectează o serie de animale domestice (porcii, iepurii, în special) si care se pot transmite
zoonotic la om.

Caracteristica Genotip 1 si 2 Genotip 3 si 4

Prevalenta Endemice in India, America Cazuri sporadice in Europa,


Centrala-transmitere fecal- SUA, legate de consumul de
orala prin ape contaminate carne si organe de porc

Aparitia in zone non- Import (calatorii) Autohtona (zoonoza)


endemice

Transmitere Neobisnuita Foarte rara


secundara

Rata bolilor icterice Inalta Joasa

Mortalitate Ridicata la femeile insarcinate Ridicata la adultii in varsta

Afectari Rare Complicatii neurologice


extrahepatice

Infectie cronica Nu Posibila la persoanele


imunosupresate
Patogenie. Virusul Hepatitei E este agentul unor hepatite cu transmitere fecal-orala,
frecvente în țarile în curs de dezvoltare (India și America Centrala). Rata de atac (raportul
dintre cazurile simptomatice și asimptomatice) în cursul acestor epidemii a variat între 1
și 15%, mai mare la adulți (3 – 30%) decât la copii (0.2-10%). Epidemiile cu rata de atac
înalta dau și mortalitate ridicata.
Epidemiologie.
In zonele ne-endemice (Europa, SUA), VHE este responsabil de mai puțin de 1% din
hepatitele virale acute. Surprinzator însa, datele serologice din zonele neendemice indica
cifre de seroprevalența mult mai mari decât cele anticipate. Unele studii au sugerat ca
hepatita E poate fi considerata o zoonoza, transmisa de la suine prin consumul carnii si
organelor insuficient preparate termic. deși rolul porcilor ca sursa a infecției umane nu a
fost definitiv probat. La imunosupresați, inclusiv la bolnavii cu transplant, infecția VHE
cronică poate surveni în urma transmiterii virusului prin transfuzii.
Clinica. Desi in forma epidemica este frecvent asimptomatica, hepatita E poate prezenta
forme icterice si un spectru larg de simptome extrahepatice inclusiv neurologice.
Colestaza este simptomul cel mai frapant în hepatita E. Faza icterica începe brusc,
coincide cu creșterea transaminazelor și se poate prelungi la peste doua saptamâni. In
forma clasica endemica, Hepatita E nu cronicizeaza, iar formele cu evoluție fulminanta
sunt rare. Cazuri de hepatita E cronica ai fost raportate in cazul genotipurilor 3 si 4 la
persoane imunocompromise (primitorii de transplant de organe)
Hepatita E endemica se remarca prin gravitatea evoluției la femeile însarcinate.
Consecințele infecției VHE la gravide sunt:
- avorturi sau nașteri premature: 12 - 30% cazuri;
- moartea fatului in utero: 25%;
- decesul mamei prin hepatita fulminanta-vulnerabilitatea gravidelor crește odata cu
vârsta gestaționala: gravidele în trimestrul 2 sau 3 de sarcina fac forme severe datorita
încarcarii virale mari, urmare a replicarii viusului în ficatul fatului; în ultimul trimestru al
sarcinii mortalitatea materna (prin tulburari de coagulare) atinge 25%.
Diagnosticul se face pe baza semnelor clinice si si de laborator (evidențierea anticorpilor
IgM anti VHE si detectia acidului nucleic viral prin RT-PCR). Durata excreției virusului
în fecale ca și durata viremiei nu depașesc 28 zile. In general, dupa revenirea la valori
normale a transmainazelor hepatice, contagiozitatea înceteaza. Diagnosticul de hepatită E
trebuie luat în considerație la pacienții cu creșteri de transaminaze și cu antecedente
epidemiologice sugestive- călătorii în zonele endemice
Tratamentul cu ribavirină si Peg-Interferon atenuează formele severe.
Profilaxia hepatitei E este condiționata de ameliorarea sanitației, asigurarea unor surse
de apa necontaminate și pastrarea bunei conduite în igiena individuala. O atenție
particulara trebuie acordata protecției gravidelor în epidemii. In prezent nu exista un
vaccin anti hepatita E aprobat in Europa sau SUA. In China, insa este utilizat un vaccin
bazat pe o proteină imunogenă HEV 239, sintetizata prin tehnica ADN recombinat.

B. HEPATITELE CU TRANSMITERE PREPONDERENT PARENTERALA

Hepatitele virale cu transmitere parenterală constituie o cauza majora de morbiditate și


mortalitate. Infecțiile cu VHB sau cu VHC pot croniciza, determinând afecțiuni hepatice
severe, cu evolutie catre ciroza hepatica și carcinom hepatic primitiv (CHP). Global,
peste 350 milioane persoane sunt infectate cronic cu VHB, iar circa 180 milioane sunt
infectate cronic cu VHC. Datorita cailor comune de transmisie, infecțiile simultane cu
ambele virusuri sau co-infecțiile cu virusul HIV sunt foarte frecvente.

VIRUSUL HEPATITEI B (VHB)


Caracteristici. VHB face parte din familia Hepadnaviridae – virus cu genom circular,
ADN parțial dublu spiralat (o spira lunga, alta scurta). Genomul este alcatuit din mai
multe gene (numite orf sau cadre de citire) parțial suprapuse, ceea ce face ca mutații într-
un punct al genomului sa afecteze simultan proteinele codificate de doua sau trei gene.
Genele VHB codifica:
- Antigenul de suprafața AgHBs (Gena S, cu trei componente: preS1+preS2+S);
- Antigenul de centru AgHBc (Gena C, pre C) care prin clivare produce AgHBe
(marker de infectivitate);
- Reverstranscriptaza (gena pol), ținta medicamentelor antivirale;
- Factori transactivatori ai unor gene celulare (gena X, implicata în cancerizare).
In urma replicarii virale rezulta atat particule complete (cu anvelopa, capsisa si acid
nucleic), cu dimensiuni de 42 nm - particulele Dane, cat si particule vide, fara genom,
rezultate din autoasamblarea moleculelor de AgHBs sintetizate în exces. Aceste ultime
particule, cu diametrul de 22 nm, sferice sau filamentoase, nu conțin ADN VHB, nu sunt
infectante, ci numai imunogene.

Replicarea VHB se caracterizeaza prin:


- Existenta unei etape de reverstranscriere in urma careia se sintetizeaza noul
genom viral
- Disproporția între sinteza particulele virale complete (particulele Dane), cu genom
și cele vide (care conțin doar AgHBs autoasamblat). Acest fapt este rezultatul
producției în exces a proteinelor virale (1014 copii) în comparație cu genomul viral
(numai 108-10 copii ADN viral). Particulele vide intervin in liza imun- mediata a
hepatocitelor si servesc ca invelis proteic pentru virusul hepatitei delta (virus
defectiv, ce nu se poate replica in absenta AgHBs)
- Persistenta ADNccc sub forma episomala in nucleul hepatocitului infectat

Dupa internalizarea virusului in hepatocit si eliberarea acidului nucleic viral: ADN


partial dublu spirat, partil circularizat, are loc completarea secvenței spirei scurte, sub
actiunea ADN polimerazei virale, cu sinteza unui ADNds relaxat, care este transportat in
nucleu si formeaza ADN circular inchis (ADNccc - closed covalent circular), mentinut în
forma episomala, neintegrata cromozomial. Acest ADNds serveste pentru transcrierea
mai multor specii de ARNm liniar: o parte numita ARN pregenomic va fi matrita pentru
reverstranscriptaza virala care va sintetiza noul genom viral ADNds, iar celelalte pentru
sintetiza proteinelor virale. Medicamentele antivirale utilizate în tratamentul hepatitei B
intervin in etapa de reverstranscriere si nu pot interfera ADNccc. Acesta se poate integra
la nivel hepatocitar și constituie un rezervor viral, ce explică persistența virusului și
posibilitatea reactivărilor. Mutațiile în gena pol, induse frecvent de noile medicamente
antivirale, modifica și celelalte gene.

Cai de transmitere -Transmiterea VHB se realizeaza :


 Percutan sau permucos, prin contact cu fluide infectioase provenite de la
persoane infectate) - prin injectii, transfuzii, manevre stomatologice sau
chirurgicale, tatuaje, piercing, acupunctura cu instrumentar incorect sterilizat,
utilizarea in comun a forfecutelor, lamelor de ras, periutelor de dinti, etc
predispune la transmiterea virusului etc). La ora actuala se realizeaza testarea
obligatorie a tuturor donatorilor de sange pentru prezenta AgHBs. Cu toate
acestea datorita existentei unei ferestre serologice lungi (cca 75 zile), exista un
risc rezidual asociat transfuziei, ce ar putea fi scazut/eliminat complet prin
introducerea testarii ADN VHB in sangele donatorilor (metoda prea costisitoare
inca pentru majoritatea sistemelor de sanatate publica)
 Sexual (hetero si homosexual). Toate persoanele sunt expuse riscului de infectie
cu VHB, dar cei cu parteneri sexuali multipli, in special cei care intretin relatii
sexuale neprotejate (fara prezervativ) au risc inalt de infectare.
 Materno-fetal (perinatal, nu transplacentar)
 Prin contact direct cu o persoana infectata (virusul realizeaza concentratii
ridicate in saliva)

VHB este foarte rezistent la stocare, la fierbere, la dezinfectante.VHB are infectivitate


de 50-100 de ori mai mare decat virusul imunodeficientei umane (HIV). VHB isi
pastreaza infectivitatea la 30°C-pt minim 6 luni si la –15°C pt 15 ani ; ramane infectios
in pete de sange uscat – pentru minim o saptamana. Expunerea la eter, acid (pH 2.4 pt
cel putin 6 h) si caldura (98°C pt 1 min; 60°C pt 10 h) nu distrug immunogenicitatea
sau antigenicitate – inactivarea poate fi incompleta daca titrul viral este ridicat.
Infectivitatea este distrusa dupa autoclavare la 121°C pt 20 min sau expunere la caldura
uscata 160°C pt 1 h. Urmatoarele substante dezinfectante sunt eficiente pe VHB:
hipoclorit de sodiu---500 mg clor liber / litru (expunere minim 10 minute); glutaraldehida
solutie 2% (expunere 5 minute la temperatuta camerei); formaldehida 18.5 g/l, alcool
isopropilic 70% , alcool etilic 80% expunere pentru minim 2 minute, β-propriolactonain
tratament combinat cu iradiere UV.

Epidemiologie. Hepatita B este o problema majora de sanatate publica. Aproximativ 2


miliarde de oameni in intreaga lume au fost infectati cu virusul hepatitic B, peste 350
milioane sunt purtatori cronici ai VHB si reprezinta un rezervor pentru transmiterea
continua a infectiei. In plus, infectia cronica cu VHB este cauza principala a cirozei
hepatice si a carcinomului hepatic primitiv (CPC) si una din primele zece cauze de
mortalitate la nivel global.

Clinica. Incubatia dureaza in medie 75 de zile, timp in care pacientul este contagios.
Debutul este discret, cu simptomatologie nespecifica (astenie, inapetenta/anorexie, greturi,
disconfort abdominal, artralgii/mialgii,), icter și creșterea nivelului transaminazelor.
Formele icterice apar in < 10% din cazurila copiii cu varste intre 1-5 ani, dar sunt mult
mai frecvente (30-50% din cazuri) la copiii mari si adulti. Persistența AgHBs peste 6 luni
de la debutul icterului este indiciu de hepatita B cronica.

Hepatita B cronica se caracterizeaza prin mai multe etape clinice:


1. Faza de imunotoleranta, cu nivel normal de transaminaze si leziuni hepatocitare
minime, in ciuda unui nivel foarte ridicat al ADN VHB
2. Faza activa, cu replicarea virala, raspuns imun sustinut, transaminaze crescute si
leziuni hepatocitare necroinflamatorii
3. Faza inactiva cu nivel ADN VHB scazut/ nedetectabil, transmaninaze normale,
seroconversie AgHBeanti HBe cu ameliorarea evidenta a histopatologiei hepatice.
Rata anuala a seroconversiei spontane este 8-15%, mai mica la cei cu transaminaze
normale. O parte din pacienti vor ramane in acest stadiu, putand sa realizeze
seroconversie AgHB catre anti HBs (si deci clearence viral) complet, in timp ce
altii vor trece din nou in faza activa, cu reluarea replicarii virale si a sindromului
inflamator.
VHB nu este direct citopatogen, majoritatea leziunilor hepatice sunt determiate de liza
imun mediata a hepatocitelor.
Evolutia este distincta in functie de varsta la achizitia infectiei (vezi tabel)::
- La nou nascut, dupa transmitere materno-fetala, desi infectia este asimptomatica
in majoritatea cazurilor, cronicizarea survine in > 90% cazuri. Aceasta se
datoreaza unei faze prelungite de imunotoleranta, datorata transferului
transplacentar al AgHBe, ce induce unraspuns citotoxic ineficient fata de AgHBc,
blocarea functiilor LTc si APC prin inhibitia citokine proinflamatorii. Viremia
este inalta, dar nu se asociaza cu transaminaze crescute si nici cu modificari
importante la nivel hepatocitar, cee ce arata lipsa citopatogenitatii VHB. Evoluția
la copii este mult timp subclinica cu transaminaze normale si activitate
inflamatorie hepatica minima. Reactivarea se produce tardiv, dupa 10-30 ani, la
subiecți cu o serie de factori de risc.
- La copii mari (peste 5 ani) rata de cronicizare este de 30-50%, iar la adulti de
numai 8-10%. Pierderea rapida a fazei de imunotoleranta precipita liza imun-
indusa a hepatocitelor infectate si alaturi de replicarea virala masiva, genereaza
modificari histopatologice hepatocitare importante (activitate necroinflamatorie
urmata de fibroza progresiva).

Evolutia hepatitei B

Faza de Faza replicativa Faza nonreplicativa


Immuno-
toleranta

Hepatita B Hepatita B Purtator inactiv


cronica AgHBe+ cronica AgHBe- Ag HBs
(Mutante
core/precore )

AgHBs + + + +

AgHBe + + – –

Anti-HBe – – + +

ALT Normal   Normal


ADN VHB 5-7 9 7
IU/mL > 200,000- 10 > 2x 105 -10 2000 - 2 x 10 < 2000

Normal/ Inflamatie
Histologie Inflamatie Activa Normal
moderat Activa

Tratament Nu Da Da Nu

Complicații tardive severe ale infecției cronice sunt ciroza și carcinomul


hepatocelular (CHC). Apariția cirozei este mai frecventa în hepatita B cronica cu AgHBe
negativ. Alți factori asociați cu progresia catre ciroza si carcinom hepatic primitiv sunt:
expunere la substante hepatotoxice (consumul de alcool, factori asociati dietei- expunere
la concentratii mari de aflatoxina, medicamente, etc.), vârsta înaintata, sexul masculin,
tulpini virale VHB din genotipul C, coinfecția VHC. Decompensarea cirozei este de 16%
în primii 5 ani. Dupa decompensare speranța de viața scade la 14-28% în urmatorii 5 ani.

Mecanismul oncogenezei induse de VHB este incomplet elucidat. Carcinomul


hepatocelular C (CHC) poate apărea în absența cirozei în hepatita cronica B. Factorii de
risc sunt reprezentati de infectia cu genotipul C al VHB, varsta > 40 ani, nivel ADN VHB
ridicat, mutatii in regiunea precore (A1762Y și G1764A); ADN ccc ce persista la nivel
intrahepatic poate fi integrat in genomul celular (asemanator transpozonilor) in cursul
regenerarii hepatocitelor, proces ce poate inactiva antioncogenele sau poate determina
activarea aberanta a oncogenelor virale. Proteina reglatorie codificata de gena virala X
(frecvent identificata in tumori hepatice asociate VHB) are rol transactivator asupra unor
factori implicati in semnalizarea citoplasmatica si cea intranucleara, in crestera celulara,
apoptoza si repararea ADNului. HBx intervine in procesul de fibrogeneza si angiogeneza.

Diagnostic de laborator:
Infectie acuta cu VHB: AgHBs + anticorpi anti-HBc de tip IgM, ADN VHB
Infectie cronica cu VHB: AgHBs + anticorpi anti-HBc de tip IgG.
Infectia cronica VHB poate fi
- Infectia cronica activa (cu replicarea virala sustinuta): ADN VHB prezent si
AgHBe prezent; exceptie fac cazurile cu mutante core/precore in care AgHBe poate fi
negativ, dar ADN VHB este prezent in concentratii ridicate)
- Infectia cronica persistenta (cu replicare virala redusa, intermitenta): de obicei
AgHBe negativ, si ADN VHB in concentratii mici
Confirmarea infectiei cronice se realizeaza prin:
• persistenta AgHBs >6 luni,
• valori ale încarcarii virale >104 copii/ml ADN/VHB,
• transaminaze persistent sau intermitent crescute,
• activitatea necroinflamatorie progresiva+/- fibroza la biopsia hepatica.
Hepatita B oculta: anticorpi anti HBc izolati, fara AgHBs prezent, dar cu replicarea
virala evidentiata prin detectia ADN-VHB (obisnuit sub 104 UI/ml plasma). Acesti
pacienti pot transmite VHB in special prin transfuzii sau transplant de organ, iar leziunile
hepatice evolueaza in special in conditii de imunosupresie.
Vindecarea hepatitei B: anticorpi anti-HBc de tip IgG prezenti (markerul trecerii prin
infectia naturala) si anticorpi anti HBs- singurii care neutralizeaza virusul.
Vaccinare eficienta impotriva VHB : anticorpi anti HBs serici (titru>10 mUi/ml).

Preventie
- profilaxie specifica: vaccin recombinant ce contine numai antigen HBs obtinut prin
biotehnologie. In Romania, din 1995, a fost introdusa vaccinarea universala a nou
nascutilor impotriva hepatitei B. Acesta se incepe in maternitatea si cuprinde o schema de
4 doze de vaccin (0-2-4-11 luni) .
- profilaxie nespecifica: triajul donatorilor de sange, administrarea de gamaglobuline
specifice anti VHB la contacti sau nou nascuti, respectarea masurilor de precautie
universala
Precautiile standard includ:
• Utilizarea echipamentului de protectie individuala si schimbarea manusilor/
mastilor intre pacienti
• Igiena riguroasa a mainilor
• Reducerea manipularii instrumentelor taioase (inclusiv a echipamentului de
injectare)
• Separarea fizica a ariilor si echipamentelor “curate” si contaminate pentru evitarea
cros-contaminarii
• Evitarea contaminarii medicatiei administrate injectabil
• Siguranta injectiilor –separarea si eliminarea deseurilor taioase/contaminate/
dezinfectia si sterilizarea mediului

Pentru prevenirea transmiterii materno-fetale la copiii nascuti de mame AgHBs


pozitive ( mai ales cele care au replicare activa, cu AgHbe pozitiv si ADN VHB) se
recomanda asocierea vaccinarii în maternitate în primele 12-24 ore dupa nastere cu
administrarea injectabila de imunoglobuline specifice anti VHB), ulterior, rapeluri: (2-4-
11 luni) .
Orice program de prevenire a hepatitelor virale B trebuie sa combine vaccinarea,
screeningul, diagnosticul corect si terapia.

Tratamentul cu antivirale în hepatita B cronica urmarește: încetinirea progresiei


fibrozei catre ciroza, prevenirea insuficienței hepatice, prevenirea apariției CHC. Aceasta
se realizeaza prin disparitia markerilor de replicarea virala activa: AgHBs, AgHBe și
ADN VHB (cel mai sensibil și mai persistent). Scopul tratamentului este obtinerea unui
raspuns virusologic sustinut (RVS- ADN VHB nedetectabil la 6 luni de la stoparea
tratamentului). Vindecarea este urmarea sintezei anticorpilor anti HBs, singurii care
neutralizeaza replicarea virala.

Criteriile de apreciere ale succesului terapeutic în hepatita B cronica sunt:


 reducerea încarcarii virale (optim ADN VHB nedetectabil)- succes virusologic
 normalizarea transaminazelor;
 seroconversia la antiHBe (succes serologic) și pierderea AgHBs cu seroconversie
antiHBs (vindecare). Aceasta arata incetarea replicarii virale
 ameliorarea histologiei hepatice (scaderea scorului activitații necroinflamatorii
sau fibrozei).
Antiviralele nu reușesc sa vindece compet infecția, caci formele replicative ale
genomului viral ramân în nucleul hepatocitelor infectate sub forma ADN ccc, inaccesibil
raspunsului imun sau medicamentelor. Persistența ADN ccc explica recaderile la
întreruperea terapiei sau în condiții de imunosupresie
Tratamentul actual se realizeaza cu monoterapie cu analogi
nucleozidici/nucleotidici inhibitori ai reverstranscriptazei (NUC) sau cu Interferon
pegylat (PEG-IFN) .
Cei mai utilizati NUC la ora actuala sunt entecavir si tenofovir, medicamentele
mai vechi (lamivudina, adefovir, telbivudina) fiind grevate de rate mari de rezistenta,
rapid instalata.
Aceste medicamente trebuie administrate zilnic, timp de peste 1 an (cateodata chiar
indefinit - pana la obtinerea succesului terapeutic), dar sunt bine tolerate, determina
scadere importanta a replicarii virale, cu sanse mari (90%) de obtinere a unui raspuns
virusologic inițial și consolidat și sunt active și pe mutantele VHB rezistente la
lamivudina.
Terapia combinata are avantaje potentiale (rate scazute de rezistenta), desi nu exista
dovezi ca una din combinatiile PEG-IFN + NUC sau 2 NUC ar fi superioara
monoterapiei.

Initierea tratamentului se realizeaza:


- la pacienti cu AgHBe pozitiv daca: ADN VHB > 2000 IU/mL (conform
criteriilor Europene-EASL) sau daca ADN VHB > 20,000 IU/mL si ALT > 2
ori ULN (conform criteriilor din SUA- AASLD )
- la pacienti cu Ag HBe negativ daca:ADN VHB > 2000 IU/mL si ALT crescute
(EASL si AASLD)

O scadere in titrul AgHBs la saptamana 12 sau 24 in cursul tratamentului cu PEG-IFN


pare sa fie predictiva pentru RSV Coinfecția cu HIV sau VHC înrăutățește evoluția și
prognosticul afecțiunii hepatice: accelerează fibroza și limitează rata de succes a terapiei
antivirale.
Noi terapii in infectia VHB:
- Myrcludex B (Bulevirtide) peptid sintetic analog preS1, inhiba legarea de
receptorul NTCP (std faza 2b - coinfectie B-D)
- Inhibitia secretiei AgHBs (Polimeri de acizi nucleici –REP2139; previn atasarea
la GAG, activitate dependenta de marime si de caracterul amfipatic
- Terapii care tintesc ADNccc
• Distrugere prin endonucleaze specifice-CRISPR/cas, ZFN, TALEN
• Silentiere functionala
- siRNA (small interfering RNA)

VIRUSUL HEPATITEI DELTA (VHD)

Virusul Hepatitei Delta este cel mai mic virus uman cunoscut, fiind grupat între agenții
subvirali (virusoid), mai apropiat ca structura de virurile plantelor. Virusoizii au un
genom mic ARN parțial circular (VHD are 1700 baze), care este incapabil sa codifice
proteinele structurale ale virionului. De aceea, replicarea VHD depinde de un virus helper
- virusul hepatitic B (VHB), care ii asigura invelisurile proteice.
Are genomul ARN ss, cu polaritate antimesaj, nu are o ARN polimeraza proprie si
utilizeaza polimerazele gazdei pentru replicare; practic genomul VHD se încapsideza in
particulele vide formate in exces in cursul replicarii VHB prin autoasamblarea AgHBs.
Astfel, hepatita Delta survine numai în infecție mixta cu hepatita B. Infecțiile sunt
achiziționate simultan – coinfecție, sau succesiv: peste o hepatita B cronica se suprapune
infecția delta – suprainfecție. Ultima alternativa este o condiție agravanta cu risc de
hepatita fulminanta sau de cronicizare in forme agresive. Virusul delta nu este
citopatogen, leziunile sunt imun-mediate, determinând progresie mai rapida catre ciroza
si crescand riscul de aparitie a carcinomului hepatocelular.
Diagnosticul infecției cu virus hepatitic delta se face prin evidențierea anticorpilor anti
VHD prin ELISA si a ARN VHD prin Rt-PCR. Un profil serologic sugestiv pentru
coinfectia B-delta este AgHBs pozitiv, antiHBcIgM pozitivi, anti VHD IgM pozitivi; iar
pentru suprainfectie B-delta: AgHBs pozitiv, antiHBcIgG pozitivi, anti VHD IgG pozitivi.
La pacientii cu infectie dubla B-delta, domina replicarea virusului hepatitic delta, nivelul
ADN VHB fiind scazut.
Tratament. Interferon pegylat pentru 48 de saptamani la cei cu boala activa compensata,
totusi. rata de raspuns este scazuta si boala progreseaza frecvent catre insuficienta
hepatica . La cei cu replicarea VHB importanta (>2000 UI/ml) se poate administra un
analog nucleotidic inhibitor al reverstranscriptazei; de asemenea terapiile noi includ
Mircludex B (inhibitor al receptorului NTCP) si Lonafarnib (inhibitor de prenilare,
inhiba farnesil transferaza celulara, administrat oral impreuna cu RTV +/- PEGIFN)

Profilaxia hepatitei delta se face prin vaccinare împotriva VHB. Se apreciaza ca la nivel
global in cei 350 milioane de purtatori cronici ai VHB, 15 milioane sunt coinfectati cu
VHD, dar prevalenta hepatitei delta este in scadere, in mare parte ca urmare a
programului de vaccinare anti VHB.

VIRUSUL HEPATITEI C (VHC)


Virusul hepatitei C (VHC) a fost descoperit în 1989 prin tehnici de biologie moleculara,
ca principal agent etiologic al hepatitelor post-transfuzionale non A, non B. VHC
determina o infectie cu potential foarte mare de cronicizare. OMS estimeaza ca hepatita C
afecteza peste 3% din populatia globului (175-180 milioane subiecti), anual
înregistrandu-se între 3 si 4 milioane de noi infectii. In Romania, seroprevalenta infectiei
cu VHC in populatia generala este în jur de 4.5%.
Un sfert din persoanele infectate HIV sunt coinfectate cu VHC (condiție agravanta pentru
evoluția bolii hepatice, ce a devenit una din pincipalele cauze de mortalitate si
morbiditate la pacientii HIV pozitivi).
Caracteristici.
VHC face parte din familia Flaviviridae (genom ARNss, 9500 nucleotide, polaritate
pozitiva), genul Hepacivirus. Prezinta o anvelopa cu proiecții din proteine hidrofobe care
se îmbraca în betalipoproteine plasmatice, ce ecraneaza antigenitatea virusului. Aceasta
explica de ce seroconversia dupa infecție este tardiva (dupa circa 100 zile), generand un
risc rezidual important asociat transfuziilor de sange, in cazul in care triajul donatorilor
testati doar prin teste serologice.

Replicarea VHC.
Genomul VHC contine un singur cadru de citire deschis (ORF) care codifica un
polipeptid format din ≈3,000 de aminoacizi, clivat ulterior de catre enzimele virale (cea
mai importanta fiind proteaza VHC NS3/NS4A) si celulare in proteine structurale si
nestructurale. Replicarea virala este coordonata de catre o ARN polimeraza-ARN
dependenta (RdRp), codificata de gena NS5B. Aceasta enzima are o fidelitate scazuta de
transcriere (rata incorporarii gresite de nucleotide este 10-3 per nucleotid per generatie
virala), ceea ce, asociat o rata foarte rapida a replicarii virale (1010-1012 virioni pe zi, cu
un timp de injumatatire de 2-3 ore), genereaza o mare variabilitate virala. Acesta este
evidenta in special la nivelul proteinelor anvelopei virale codificate de o regiune
hipervariabila a genomului. Variabilitatea se exprima prin:
- existența a cel puțin 6 genotipuri distincte (diferente de este 30% in secventa de
nucleotide), intre care nu exista cross reactivitate antigenica.
- prezenta cvasispeciilor virale (variante intragenotipice care difera în secvența
numai prin câteva procente). VHC poate eluda raspunsul imun al gazdei selectând dintre
qvasispeciile care alcatuiesc populația virala, variante non-neutralizabile, responsabile de
rata înalta a cronicizarilor î
n hepatita C.
Alaturi de polimeraza NS5B, un rol important in formarea complexului replicativ il joaca
o alta proteina virala- NS5A, ce actioneaza prin recrutarea unor factori celulari de tipul
ciclofilinelor A si B, care determina izomerizarea cis-trans, necesara replicarii virale.
Aceeasi proteina NS5A intervine si in asamblarea virionilor progeni.
Proteinele virale NS3/NS4A (proteaza), NS5B (polimeraza) si NS5A sunt tintele noilor
medicamente cu actiune directa antivirala, active in infectia VHC .
Replicarea VHC este strans legata de metabolismul lipidic, frecventa dislipidemiilor,
sindromului metabolic si a bolilor cardiovasculare cu debut precoce fiind semnificativ
crescuta la pacientii cu hepstita C cronica.

Cai de transmitere
Infectia VHC se transmite preponderent percutan sau permucos, prin contact cu fluide
infectioase provenite de la persoane infectate- prin injectii, transfuzii, manevre
stomatologice sau chirurgicale cu instrumentar incorect sterilizat), tatuaje, piercing, etc).
Persoanele care au primit transfuzii de sange (mai ales înainte de 1993), care au suferit
interventii chirurgicale sau tratamente parenterale au risc mai mare de a fi infectati cu
VHC . La ora actuala triajul donatorilor de sange pentru infectia cu VHC este obligatoriu,
totusi dat fiind faptul ca seroconversia dupa infectie este tardiva (dupa circa 100 zile),
exista un risc rezidual de transmitere asociat tranfuziei .
Folosirea in comun a acelor, siringilor şi altor instrumente de catre consumatorii de
droguri este acum cea mai importanta cale de transmitere. parenterala.
Transmiterea VHC pe cale sexuala (homo si heterosexuala) este posibila, desi riscul este
mult mai scazut decat in cazul altor virusuri (VHB- virusul hepatitei B sau HIV).
Utilizarea constanta a prezervativului scade riscul de transmitere. Recent s-au raportat
focare de transmitere VHC la homosexualii fara alti factori de risc.
Transmiterea materno-fetala a VHC este posibila, dar rata transmiterii este redusa (in jur
de 6%), mult mai scazut decat in cazul altor virusuri (VHB- virusul hepatitei B sau HIV).
Riscul de transmitere creste in cazul coinfectiei HIV-VHC la mama.

Clinica.
Infecția acuta este adesea asimptomatica (70-80% din cazuri), formele clinic aparente
(stare subfecrila, oboseala,pierderea apetitului, greata, dureri abdominale, dureri
articulare, urini hipercrome,acaune acolurice, icter) sunt ușoare. Predictorii vindecarii
spontane a infectiei acute VHC sunt: sexul feminin, varsta tanara, formele simptomatice
si prezenta unui polimorfism genetic favorabil la nivelul genei pentru IL28B (implicat si
in rata de raspuns la tratamentul cu IFN recombinant). Cu toate acestea, infectia cu VHC
cronicizeaza frecvent (in >80% din cazuri), boala evoluând catre o infecție persistenta. In
o treime din cazuri, infectia cronica progreseaza lent (pe parcursul mai multor decade)
catre insuficienta hepatica, ciroza si carcinom hepatic primitiv. Boala hepatica terminala
determinata de infectia cronica cu VHC este principala indicatie de transplant hepatic.

Diagnostic.
Diagnosticul infectiei VHC se realizeaza prin:
- teste imunoenzimatice de detecţie a anticorpilor specifici anti VHC (pana
acum cativa ani rezultatul acestora trebuia confirmat prin RIBA, Western Blot,
astazi insa specificitatea lor este inalta, fiind suficiente pentru diagnostic)
- teste de detectie a incarcarii virale (numar de copii ARN VHC/ml plasma) si
de teste genotipare.

Este important de retinut ca:


- ARN- VHC poate fi detectat din primele zile ale infectiei, mult înaintea
aparitiei anticorpilor anti VHC.
- Numai evidentierea incarcarii virala (ARN-VHC) indica replicare virala activa
si potential infectant al pacientului.
- In cursul infectiei cronice cu VHC evolutia viremiei este fluctuanta, deci
ARN-VHC poate fi detectat intermitent.

Prevenire

- profilaxie specifica: Nu exista vaccin impotriva hepatitei C si, datorita marii


variabilitati a virusului, sunt putine sanse de a fi obtinut intr-un termen scurt.
- profilaxie nespecifica: Deoarece VHC se transmite prin sange si lichide
biologice, prevenirea infectiei se poate realiza prin:
 Triajul donatorilor de sange pentru prezenta infectiei VHC (obligatoriu in Romania
la ora actuala)
 Evitarea consumului ilegal de drogurilor; in cazul consumatorilor de droguri
injectabile-utilizarea acelor si siringilor de unica folosinta si evitarea folosirii in
comun a acelor, seringilor si altor echipamente de preparare a drogurilor
 Utilizarea acelor de unica folosinta in cazul tatuajelor si body piercing-urilor;
 Sterilizarea corecta a instrumentelor folosite la cosmetica, manechiura sau frizerie;
 Respectarea bunelor practici pentru utilizarea, depozitarea si distrugerea acelor de
seringa de catre personalul medical.
 Masuri de precautie universala
 Evitarea folosirii in comun a obiectelor personale precum periuta de dinti, aparate de
ras, cercei, forfecute, unghiera
 Utilizarea constanta si corecta a prezervativului in orice tip de relatie sexuala, cu toti
partenerii sexuali;

Orice program de prevenire a hepatitei virale C trebuie sa combine screeningul,


diagnosticul corect si terapia.

Tratament. Scopul tratamentului antiviral este eradicarea replicării virale. Pana in 2011,
tratamentul standard al hepatitei C cronice consta în administrarea combinată a
Interferonului pegylat (Peginterferoni alfa) și ribavirinei, pentru 24-48 de saptamani. Rata
de raspuns varia mult in funtie de genotipul viral (cea mai scazuta de cca 40-50% in cazul
genotipului 1, cea mai ridicata 70-80% in cazul genotipurilor 2 si 3), in plus tratamentul
era asociat cu serie de reactii adverse severe (anemie, neutropenie, trombocitopenie,
depresie, iritabilitate, somnolenta etc).
Noile medicamente cu actiune directa antivirala –DAA (inhibitori de proteaza , inhibitori
de polimerază, inhibitori ai proteinei NS5A) au fost introduse atat pentru tratamnentul de
prima linie, cat si pentru tratamentul non-responderilor la tratamentul standard.
Medicamentele aprobate pana in prezent sunt:
- Inhibitorii de proteaza:-Telaprevir (Incivek, Vertex Pharmaceuticals),
Boceprevir (Victrelis, Merck); Simeprevir (Olysio, Janssen)
- Inhibitorii de polimeraza – Sofosbuvir (Sovaldi, Gilead Bioscences).
- Inhibitorii de fosfoproteia NS5A- Ledipasvir
Din 2018, in Romania se trateaza toti pacientii VHC cu F1-F4 (ciroza compensata)- 12-
24 saptamani cu 3 regimuri disponibile:
- Sofosbuvir+ Ledipasvir
- Grazoprevir +Elbasvir
- Ombitasvir/Paritaprevir/ritonavir+ Dasabuvir
Aceste medicamente au activitate pangenotipica, sunt administrate oral, multe in doza
unica, si au putine reactii adverse. Ratele de raspuns, dupa administrare de numai 12
saptamani, sunt exceptionale: in 90-99% din cazuri se obtine raspuns virusologic
sustinut- (ARN VHC nedetectabil la 6 luni de la oprirea tratamentului), ceea ce
echivaleaza cu vindecarea infectiei, caci in hepatita C nu exista rezervoare virale. Mai
multe elemente prognosticheaza un raspuns moderat sau absent la terapie: un nivel ridicat
ala replicarii virale inainte de initierea tratamentului (ARN VHC >800 000UI/ml), grad
avansat de fibroza hepatica (functie de vechimea infecției), sexul masculin, infecția cu
anumite genotipuri. In curs de dezvoltare sunt si terapii bazate pe inhibarea unor factori
celulari imporatanti pentru replicarea virala (ca ciclofilinele sau HMG-CoA reductaza)
sau pe utilizarea unor antagonosti nucleotidici ce sechestreaza molecule microARN.
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor infectioase,
subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu, aparut la Editura Medicala,
Bucuresti, 2018.

VIRUSURI SI CANCERE

Infectiile virale sunt implicate in circa 16% din cancerele umane, cu variatii importante intre
tarile cu economie dezvoltata si cele in curs de dezvoltare [1]. Virusurile oncogene actioneaza
asupra mecanismelor celulare ce coordoneaza diviziunea normala a celulelor, inducand
mutatii discrete sau alterand expresia genelor cheie implicate in controlul ciclului celular.
Astfel, exista:

- virusuri oncogene ce determina activarea aberanta a unor proto-oncogene sau


suprarexpresia proteinelor codificate de acestea. Proto-oncogenele sunt gene celulare normale
ce controleaza progresia corecta in ciclul replicativ, functionand ca factori de crestere,
receptori ai factorilor de crestere, proteine implicate in semnalizarea intracelulara sau factori
de transcriere (exemple sunt virusul hepatitic B- VHB si virusul Epstein Barr- EBV).

- virusuri oncogene ce inactiveaza antioncogene celulare- gene supresoare ale tumorilor


(exemplul clasic este al papilomavirusurilor umane- HPV)

Retrovirusuri oncogene.

Practic, Oncovirusurile din familia Retroviridae pot fi grupate in doua categorii importante
(2):

- oncovirusuri rapid oncogene in vivo si transformante in vitro, care au oncogene virale


proprii, dar in general sunt defective din punct de vedere replicativ, si au nevoie de virusuri
helper pentru a-si exprima capacitatea transformanta

- oncovirusuri lent oncogene in vivo si non-transformante in vitro, care nu au oncogene


virale proprii, dar pot altera expresia unor proto-oncogene celuare

Oncovirusurile rapid oncogene in vivo si transformante in vitro sunt patogene


pentru o serie de specii animale, dar nu pentru om, Aceste virusuri au propriile oncogene -
gene virale capabile sa induca transformare celulara, prin insertie in genomul celulei gazda si
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor infectioase,
subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu, aparut la Editura Medicala,
Bucuresti, 2018.

sa preia controlului ciclului celular, generand diviziune si proliferare celulara haotica,


necontrolata, cu dezvoltarea rapida a unor cancere extreme de agresive. Aceste virusuri sunt
in general defective din punct de vedere replicativ, oncogenele inlocuind portiuni din genele
structurale. Exista insa si o exceptie importanta- virusul sarcomului Rous (primul virus
oncogen descris -in 1911, de Peyton Rous, distins in 1966 cu premiul Nobel pentru Medicina
pentru aceasta descoperire) - un retrovirus care este competent replicativ, prezentand o
oncogena proprie (v-src), separata de genele structurale, ce determina transformare celulara in
vitro si in vivo, generand un cancer extrem de agresiv la puii de gaina (sarcomul Rous).
Desi nepatogene pentru om, retrovirusurile rapid oncogene au fost modele importante
pentru descifrarea controlului ciclului celular si pentru intelegerea oncogenezei. Cercetari
bazate pe studiul actiunii acestor virusuri au dus la descoperirea:

- modului de interactiune a virusurilor oncogene cu materialul genetic celular (studii realizate


de Howard Temin, Renato Dulbeco si David Baltimore, laureati ai premiului Nobel pentru
Medicina in 1975),

- originii oncogenelor virale din oncogenele celulare (ipoteza formulata de Michael Bishop si
Harold Varmus, laureati ai premiului Nobel pentru Medicina in 1989). [2]

Practic astazi se considera ca oncogenele virale sunt de fapt gene celulare achizitionate de
virusuri in cursul replicarii si selectate datorita capacitatii lor transformante. Oncogenele virale
au structura similara cu a proto-oncogenelor celulare (le lipsesc doar intronii), dar sunt sub
controlul altor promotori (virali) si prezinta mutatii sau deletii ce altereaza produsul proteic,
de obicei exprimat fuzionat cu alte proteine virale. De exemplu oncogena v- src, din virusul
sarcomului Rous, are structura similara cu proto-oncogene din familia src -kinazelor-
importante componente ale semnalizarii celulare in cursul diviziunii celulare; iar oncogena erb
B (din virusul eritroblastozei aviare) este similara cu proto-oncogena Her2/Neu- membru al
familiei receptorilor pentru factorul de crestere epitelial. Amplificarea acestei proto-oncogene
celulare joaca un rol important in dezvoltarea unor tipuri agresive de cancer de san, aceasta
proteina fiind un biomarker valoros pentru monitorizarea progresiei, si o tinta pentru terapia
bazata pe un un anticorp monoclonal specific - Trastuzumab (Herceptin) [3].
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor infectioase,
subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu, aparut la Editura Medicala,
Bucuresti, 2018.

Oncovirusurile lent oncogene in vivo si non-transformante in vitro genereaza cancere prin


mutageneza insertionala. Practic, replicarea urmeaza pasii normali pentru un retrovirus:
genomul viral- ARNss + este reverstranscris intr-un ADN proviral, care se va integra in
genomul celular, dar aceasta integrare nu se face random, ci intotdeauna in imediata vecinatate
a unei proto-oncogene celulare. Insertia provirusului duce la expresia aberanta proto-
oncogenei respective, ceea ce genereaza perturbarea diviziunii celulare, cu proliferare haotica
si transformare celulara.

Singurele retrovirusuri umane oncogene sunt delta retrovirusurile: HTLV I si II (Human T


cell leukemia viruses). HTLV I si II se transmit pareneteral, prin sange si derivate de sange,
dar si sexual si materno fetal. Incidenta infectiei cu HTLV I este mare in anumite regiuni din
Japonia, Caraibe si Africa, iar a celei cu HTLV II in America de Nord, de Sud si Centrala.

HTLVI determina leucemia cu celule T a adultului (ATL) - o forma de leucemie cu prognostic


foarte rezervat, datorita imunosupresiei induse si rezistentei la chimioterapie, limfoame
cutanate cu celule T si o boala neurodegenerativa: parapareza spastica tropicala (TSP) numita
si mielopatie asociata cu HTLV-1 (HAM). A fost sugerata posibila implicare a HTLV I si in
aparitia unor leucemii limfocitare cronice, a limfoamelor non-Hodgkin, sau a mielomului
multiplu. [4,5]

Odata integrat in genomul celular, HTLV sintetizeaza proteine reglatorii - tax, ce promoveaza
replicarea virala si asigura transformarea limfocitelor T in vitro. Acestea sunt transactivatoare
pentru regiunile LTR (long terminal repeats de la capetele genomului viral) si capabile sa
creasca transcrierea virala LTR mediata si sa genereze supraexpresia si modularea unor
promotori celulari implicati in proliferarea si diferentierea celulara, in sinteza citokinelor; a
receptorilor pentru citokine si a moleculelor costimulatorii si in mecanismele de reparare a
ADN [6]. Totusi, se pare ca expresia genei tax este relativ frecvent inactivata in cazurile de
ATL, iar studii mai recente atribuie un rol critic in oncogeneza genei HBZ (HTLV-1 basic
leucine zipper factor), ce codifica un factor esential pentru infectivitatea HTLV si promovarea
proliferarii celulelor T [7]. HTLV pot sa stimuleaza cresterea celulara necontrolata si prin
legare directa de kinazele dependende de cicline ce controleaza normal trecerea dintr-o etapa
de repaus in una activa a ciclului celular.
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor infectioase,
subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu, aparut la Editura Medicala,
Bucuresti, 2018.

Papilomavirusurile umane (HPV).

Infectia persistenta cu genotipuri HPV cu risc oncogen inalt este implicata in dezvoltarea unor
leziuni displazice premaligne si in aparitia cancerului de col uterin, precum si a altor cancere
in sfera genitala (cancer vulvar, cancer penian, cancer anal si perianal) si in sfera oro-
faringiana (carcinom laringian, carcinom oral, carcinom scuamos tonsilar), Rolul HPV in
oncogeneza a fost demonstrat in urma studiilor initiate de Harald zur Hausen, recompensat cu
Premiul Nobel pentru Medicinã, 2008 [8]. Infectia persistenta se produce in celulele
nonpermisive, din straturile profunde ale epiteliului bazal. Aici genomul viral se integreaza in
genomul celular, ceea ce conduce la o replicare virala abortiva- fara formare de virioni
progeni. Practic ADN HPV se liniarizeaza si are loc expresia preferentiala a unor gene virale
timpurii - E6 si E7. Proteinele E6 și E7 inactiveaza antioncogenele celulare p53 și respectiv
pRb, ceea ce conduce la expresia aberanta a ciclinelor și a kinazelor ciclin-dependente, cu
progresie necontrolata in ciclul celular si transformare celulara. ce doua gene virale implicate
in oncogenza E6 si E7 sunt situate in amonte fata de o regiune de control- LCR (long control
region) ce contine enhanceri ce pot fi activati de co-factori celulari sau virali [9]. Desi infectia
persistenta cu HPV de risc inalt este cauza cancerului de col uterin, pentru dezvoltarea
procesului tumoral sunt necesari si o serie de cofactori, intre care cei mai importanti sunt:
utilizarea pe termen lung a contraceptivelor orale,multiparitatea, fumatul si co-infectia cu
HIV. Alti cofactori probabili sunt reprezentati de co-infectia cu Chlamydia trachomatis si
herpes simplex virus tip-2 (HSV-2); imunosupresie, deficiente in dieta. Rolul factorilor
genetici, epigenetici si imunologici ca si al incarcarii virale sau sitului de integrare este, la ora
actuala, insuficient sustinut de dovezi.

Vaccinarea anti HPV asigurã reducerea incidenței carcinomului de col uterin invaziv și a
leziunilor precanceroase. Toate vaccinurile anti HPV sunt produse prin tehnologia ADN
recombinant si contin particule neinfectioase asemanatoare virionilor (VLP-virus-like
particles) formate prin auto-asamblarea proteinei capsidare majore L1 (specifica de tip) în
capside virale goale, lipsite de genomul viral [10]. Vaccinurile sunt (Gardasil®) sau eukaryote
(Cervarix®). Cele trei vaccinuri comerciale disponibile la ora actuala sunt:

1. Cervarix® – este un vaccin bivalent ce protejază împotriva genotipurilor HPV16/18 cu


risc oncogen inalt. Vaccinul este produs prin expresia genelor L1 în celule eukariote.
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor infectioase,
subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu, aparut la Editura Medicala,
Bucuresti, 2018.

Vaccinarea determina o reducere de 92% a citologiilor anormale, si are o eficienta de 94-100%


în prevenirea infecţiei persistente.

2. Gardasil® – este vaccin tetravalent ce protejează împotriva genotipurilor HPV 6/11 (cu
risc oncogen scazut) si a genotipurilor HPV 16/18 (cu risc oncogen inalt).Este produs prin
expresia genelor L1 în celule prokariote. În Romania, vaccinul se comercializează sub
denumirea de Silgard®.

3. O varianta a acestui vaccin -Gardasil 9® este un vaccin nonavalent contine genotipurile


HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52 si 58.

In general, toate aceste vaccinuri sunt recomandate pentru imunizarea de rutinã a


fetițelor cu varste intre 11– 12 ani, tinind cont de faptul ca exista o probabilitate ridicatã de
achiziție a infecției HPV imediat dupã debutul vieții sexuale (practic 25% femei sunt infectate
dupã primul an de la inceperea vietii sexuale), iar eficiența vaccinului la femeile deja infectate
este scazuta. De asemenea, administrarea vaccinului la aceastã grupã de vârstã pare sa induca
titruri mai inalte de anticorpi, si are avantajul utilizãrii rețelei de medicinã școlarã pentru a se
asigura o acoperire vaccinalã cât mai completã. Vaccinul tetravalent si cel nonavalent sunt
aprobate in SUA si pentru utilizarea la sexul masculin. Varsta recomandata de administrare
atat la fete cat si la baieti, este 11-12 ani, dar vaccinul poate fi administrat si intre 9-10 ani, si
intre 13-26 ani, la ambele sexe. Vaccinurile previn cancerul de col uterin si leziunile
precanceroase, cancerele anale, verucile genitale şi alte afecţiuni cauzate de genotipurile de
HPV continute. Vaccinurile sunt inalt imunogene si sigure, oferind protectie pentru minim 5
ani, dupa o schema completa de vaccinare ce include 3 doze de vaccin, administrate la 0-1/2-
6 luni.

Vaccinarea nu inlocuieste screeningul citologic/virusologic periodic si nu trebuie sa afecteze


masurile de profilaxie impotriva bolilor cu transmitere sexuala.
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor infectioase,
subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu, aparut la Editura Medicala,
Bucuresti, 2018.

Gamaherpesvirusuri

Virusul Epstein Barr, un herpesvirus ubicvitar, ce infecteaza >90% din populatia globului,
fiind frecvent achizitionat in copilarie in forma asimptomatica sau asociat mononucleozei
infectioase, are drept sediu principal al latentei limfocitele B de memorie din sange si maduva
osoasa, in care expresia genelor virale este foarte restrictiva.

Reactivarea infectiei latente, in special in conditii de imunosupresie, sau asociat cu anumiti


factori de mediu, poate conduce la aparitia unor proliferari limfoide maligne, cu aspect clinic
variat:

- limfomul Burkitt (o forma endemica exista in Africa Centrala si de Est la copii, in regiuni
cu incidenta mare a malariei, cu evolutie extrem de agresiva)

- carcinomul nazo-faringian (endemic in Asia de Sud Est, Africa mediteraneeana si unele


populatii de eschimosi), probabil asociat cu factori genetici sau de mediu ( inclusiv co-
carcinogeni din dieta: peste sarat, nitrosaminele derivate din modul de preparare al alimentelor
in regiune),

- limfom post-transplant (o limfoproliferare initial policlonala, cepoate deveni mono sau


oligoclonala, consecinta a imunosupresiei pe linia limfocitelor T citotoxice, apare cu frecventa
de 5-15% post transplant cardiac, 10% post transplant cardio-pumonar, 1-3% post transplant
renal si 1 -2% post transplant de maduva osoasa).

- limfoame asociate infectiei HIV , inclusiv limfoame la nivelul SNC , (apar probabil datorita
perturbarii sintezei citokinelor ce promoveaza proliferarea autocrina a limfocitelor B
transformate e EBV) si leucoplazia viloasa a limbii

- o serie de alte tumori (limfoame cu celule T aparute mai ales in glandele parotide, un subset
de limfoame Hodgkin, si chiar unele tumori gastrice) au fost asociate cu infectia EBV.

In cancerele asociate cu reactivari ale infectiei EBV este intalnita constant supraexpresia unor
proteine virale timpurii care joaca rol de factori de crestere autocrini pentru limfocitele B, de
receptori ai factorilor de crestere sau de activatori ai unor oncogene celulare. De altfel, virusul
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor infectioase,
subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu, aparut la Editura Medicala,
Bucuresti, 2018.

Epstein Barr poate transforma limfocitele B in vitro, inducand imortalizare si fiind utilizat
pentru obtinerea unor linii celulare limfoblastoide.

In aparitia limfomului Burkitt este implicata o activare anormala a protooncogenei celulare c-


myc, ce apare in urma unei translocatii cromozomiale -obisnuit t(8/14), posibil si t(8,2) sau
t(8/22) ce muta o secventa enhancer de pe cromozomii 14,2, 22 ce codifica lantul greu/usor al
imunoglobulinelor, pe cromozomul 8, in vecinatatea genei c-myc. Malaria pare sa joace un
rol in dezvoltarea acestui cancer, Plasmodium falciparum (prin o regiune bogta in cisteina
dintr-o proteina membranara) actioneaza ca activator policlonal al limfocitelor B, preferential
in compartimentul celulelor de memorie, stimuland reactivarea EBV din acest sediu de
latenta, cu inhibitia raspunsului imun specific anti EBV. S-a sugerat si ca Plasodium
falciparum si hemozoina ar reprezenta liganzi pentru TLR 9, inducand in celulele infectate
EBV o citidin deaminaza care ar stimula translocatiile cromozomiale caracteristice limfomului
Burkitt. In ultimii ani sunt tot mai multe dovezi in sprijinul interferarii expresiei genice EBV
prin interactiunea dintre specii de microARN (miRNA) virali si celulari. Limfomul Burkit, in
varianta intalnita la copii raspunde relativ bine la chimioterapie agresiva si tratamet adjuvant
cu Rituximab, un anticorp monoclonal himera (uman/murin) ce se leaga specific de antigenul
transmembranar, CD20, o fosfoproteină neglicozilată, situată pe limfocitele pre-B ş i B
mature.atat normale cat si maligne, mediind distugerea acestora [14, 15].

Virusul herpetic uman 8 (HHV8, anterior cunoscut ca virus asociat sarcomului Kaposi)
este implicat in aparitia unui cancer de celule endoteliale- sarcomul Kaposi, a bolii
multicentrice Castleman (afectiune limfoproliferativa rara) si a unui limfom primar la nivelul
cavitatilor seroase: pleura, pericardul, peritoneu-PEL (primary effusion lymphoma). Toate
aceste malignitati au incidenta mare la persoane imunosupresate, fiind in particular asociate
cu infectia HIV, mai ales la sexul masculin; dar aparand si post-transplant (mai ales renal).
Mecanismele oncogenezei induse de HHV8 sunt complexe si insuficient intelese. In genomul
viral exista un numar mare de cadre deschise de citire, dintre care unele codifica o serie de
analogi celulari: proteine asemanatoare ciclinelor celulare, ce stimuleaza diviziunea celulara
si inhiba apoptoza, ca si transcriptele virale asociate latentei (antigen nuclear asociat latentei -
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor infectioase,
subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu, aparut la Editura Medicala,
Bucuresti, 2018.

LANA), precum si o serie de citokine si chemokine virale ce stimuleaza angioproliferarea si


inflamatia, contribuind la promovarea carcinogenezei printr-un mecanism numit neoplazie
paracrina. Mai multe specii de miRNA virali inhiba reactivarea virusului latent si faciliteaza
transformarea celulara, proces la care participa si alti factori virus codificati: proteina de legare
a complementului, factorul de reglarea a interferonului etc, ce ajuta la eludarea raspunsului
imun [16].

Virusul hepatitic B (VHB).

Peste jumãtate din cazurile de carcinom hepatic primitiv (CHP) sunt asociate infecţiei
persistente cu VHB, iar purtãtorii cronici de AgHBs au un risc de 25-37 ori mai mare de a
dezvolta CHP, mai accentuat la pacientii cu ciroza [17].

In cursul infectiei persistente VHB poate avea loc integrarea formei replicative ADNccc
(covalent, circular, inchis) in genomul celular, ceea ce duce la deleţii la situl de integrare în
genomul hepatocitar, cu afectarea unor gene implicate in controlul ciclului celular, in special
a cascadei de semnalizare membranã –nucleu si poate conduce la translocatii cromozomiale.
In plus, au loc rearanjari ale genelor virale, cu expresia proteinelor reglatorii codificate de gena
X, ce pot determina activarea aberanta a protooncogenelor celulare, supraexpresia factorilor
de transcriptie si a unor inhibitori ai apoptozei si pot modula caile de semnalizare intracelulara
[18]. Genotipul viral pare a avea o importanta in progresia catre CHP: in Asia riscul este mai
mare in cazul infectiei cu Genotipul C comparatic cu genotipul B, iar in Europa genotipul D
este mai frecvent asociat cu CHP comparativ cu genotipul A. De asemenea un rol important
pare sa revina prezentei unor mutatii punctiforme in promotorul genei core si unor deletii la
nivelul genei preS [19-21].

VHB este principala cauza de CHP in Asia-Pacific si Africa sub-Sahariana, in stransa legatura
cu statusul endemic al infectiei VHB dar si cu existenta unor co-carcinogeni alimentari: in
special aflatoxina B1- metabolit al ciupercii Aspergillus flavus care contamineazã hrana
vegetalã impropriu depozitata, si care determina ruperea helixului de ADN si mutatii la nivelul
genei supresoare a tumorilor p53. In China anumite toxine derivate din alge (Microcystin) ce
Acest text face parte din Tratat de boli infectioase (capitolul Etiologia bolilor infectioase,
subcapitolul Virusurile, autor Simona Ruta), sub redactia Emanoil Ceausu, aparut la Editura Medicala,
Bucuresti, 2018.

contamineaza apa par a fi asociate cu un risc crescut de cancer hepatic. O serie de modificari
epigenetice intervin in riscul de carcinogeneza: hipometilarea globala asociata cu hipermetilari
localizate promoveaza instabilitatea cromozomiala si scade expresia genelor supresoare ale
tumorilor [22].

In Europa, 90% din CHP apar dupa ciroza avansata, ca efect al procesului ineficient de
regenerare hepatica in urma infectiei cu VHB sau VHC, ce duce la apritia unor mutatii
cumulative in ADN celular. Coinfecţia cu HIV, obezitatea, diabetul, alcoolismul, sunt factori
importanti de risc pentru aparitia si progresia CHP.
Noul coronavirus uman

Prof.dr. Simona Ruta

Virusul a fost denumit SARS CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) de
Comitetul international pentru taxonomia virusurilor, iar boala cauzata de acesta a fost
denumita COVID 19 (Coronavirus Disease 19) de OMS.

Background: Un nou coronavirus, asociat cu infectii umane respiratorii severe a fost


identificat in ianuarie 2020, in Wuhan, oras cu peste 11 milioane de locuitori, situat in
provincia Hubei din China. Un focar de 45 de cazuri de pneumonie atipica fusese raportat
anterior catre OMS, in China au existat insa cazuri internate inca din primele zile din decembrie
2019. Virusul a fost initial identificat prin secventiere NGS (cu o combinatie Illumina si
Nanopore) si izolat in China pe culturi primare de celule epiteliale respiratorii umane.
Anterior alte doua coronavirusuri de origine zoonotica, provenite de la lilieci, au produs
epidemii de infectii respiratorii severe:
- SARS-CoV (Severe acute Respiratory Syndrome coronavirus) identificat in 2002 in Sudul
Chinei, in regiunea Guangdong, transmis initial printr-o gazda intermediara reprezentata de
zibeta (Palm Civet), ulterior interuman, respirator. SARS CoV s-a raspandit rapid global si a
cauzat peste 8,000 cazuri umane si 774 decese (mortalitate 9.5%), pana cand a disparut din
circulatie, in 2004 (fenomen la care au contribuit atat masurile eficiente de sanatate publica, cat
si aparitia unor mutatii in genomul viral care au atenuat transmisibilitatea si virulenta).
- MERS CoV (Middle East Respiratory syndrome coronavirus), identificat in 2012 in Arabia
Saudita, s-a transmis initial printr-o gazda intermediara reprezentata de camile, ulterior
interuman, respirator. MERS CoV circula si in prezent in Orientul Mijlociu, si a determinat
pana acum 2521 cazuri si 919 decese (mortalitate 35%), asociind si simptomatologie
gastrointestinala si insuficienta renala acuta.

Transmitere. Majoritatea cazurilor initiale de COVID-19 au avut legatura cu o piață locală


care vindea animale vii, carne de animale exotice si fructe de mare proaspete, ceea ce a sugerat
transmiterea zoonotica a virusului. Rezervorul este reprezentat de lilieci, insa transmiterea a
implicat o gazda intermediara, inca necunoscuta, in ciuda vehicularii multor ipoteze, insuficient
demonstrate. Pentru identificarea sursei initiale, in China sunt in desfasurare investigații
epidemiologice pentru cazurile cu debut la Wuhan pe parcursul lunii decembrie 2019,
prelevarea de probe de mediu de la pietele din Huanan, sunt colectate înregistrări detaliate
privind originea și tipul animalelor sălbatice, speciile vândute pe piața Huanan și destinația
acestor animale după închiderea pieței.

In prezent exista transmitere respiratorie interumana sustinuta. Transmiterea se realizeaza pe


cale respiratorie, prin picaturile lui Pfluge (picaturi mari generate de tuse stranut, vorbit
precipitat, care nu se deplaseaza pe distante >2 m) sau prin fomite, prin contact direct cu obiecte
contaminate (de aceea dezinfectia periodica a suprafetelor cu etanol 70% sau hipoclorit de
sodiu, 0.5% este importanta). Datele actuale nu sustin transmiterea prin aerosoli a SARS CoV2,
insa in unitatile spitalicesti se aplica precautiile universale pentru patogeni respiratori. In cazul
celor 2 coronavirusuri zoonotice anterioare (SARS CoV si MERS CoV) transmiterea secundara
a fost in special intraspitaliceasca, aerosolii generati în cursul unor proceduri medicale
(intubatie endotrahealã, bronhoscopie, administrarea unor medicamente aerosolizate) au
facilitat rãspândirea bolii.

Mai multe studii arata ca virusul poate fi transmis si de la persoane aflate in incubatie (a carei
durata medie este, conform datelor OMS, de 4-5 zile, cu limite intre 0-14 zile), cu circa 2 zile
inainte de debutul simptomelor. In raportul misiunii comune OMS- China, se arata ca rata
infectiilor secundare la contactii apropiati ai cazurilor confirmate in China a variat intre 1-5%.
Unele rapoarte arata ca SARSCoV-2 poate determina infectii asimptomatice, de la care
transmiterea este posibila, dar nu cu aceeasi eficienta cu care se realizeaza in cazurile
simptomatice.

SARS CoV 2 are contagiozitatea cea mai ridicata dintre cele 3 coronavirusuri zoonotice, rata
de reproducere R0 (numarul de cazuri secundare aparute de la un caz index) fiind estimata la
2.3-2.8. Aceasta rata depinde de multi factori intre care durata eliminarii de virus infectios (din
datele actuale concentartii mai mari de virus sunt prezente in primele zile ale bolii, iar de la
cazurile cu severitate medie nu a fost evidentiata eliminarea de virus infectios dupa mai mult
de 8 zile, desi ARN viral poate ramane detectabil pe periode mai lungi, chiar dupa remisia
simptomelor), oportunitatea transmiterii (mare in cazul aglomerarii de persoane, a contactelor
sociale apropiate), susceptibilitatea individuala.

Atat in cazul SARS, cat si in cazul MERS au existat pacienti asa numiti "supersheeders", care
au eliminat concentratii foarte mari ale virusului, generând un numãr impresionant de cazuri
secundare. Astfel de cazuri au fost inregistrate si cursul actualei epidemii in Coreea de Sud.
La ora actuala transmiterea fecal orala nu poate fi complet exclusa, dar nu pare a fi un element
determinant in lantul epidemiologic. Exista excretie virala in materiile fecale, insa rezultatele
in privinta eliminarii de virus viabil (care poate infecta celule in cultura) sunt contradictorii. In
epidemia din 2003-2004, intr-un complex de apartamente din Hong Kong (Amoy Garden), au
fost înregistrate nu mai putin de 300 de cazuri de SARS, transmise prin sistemul de canalizare
inadecvat construit sau prin cel de ventilatie, virusul fiind izolat din gurile de scurgere ale bãilor.

Evolutia infectiei. Simptomele cele mai frecvente sunt febra (care insa, dupa unele studii poate
sa nu fie prezenta la debutul bolii clinice, apare insa aproape intotdeauna in timpul evolutiei in
88% din cazuri) si tuse, urmate cateodata de dificultati in respiratie. Pneumonia este cea mai
frecventa forma clinica, cu ifiltrate bilaterale evidentiate radiologic, manifestarile clinice si
imagistica nu permit diferentierea etiologica. In cazurile severe se instaleaza insuficienta
respiratorie, detresa respiratorie acută (ARDS) fiind principala cauza de mortalitate.

Majoritatea datelor legate de evolutia bolii provin din China. CDC China a publicat in 11
februarie 2020 o analiza a datelor provenite din fisele medicale a peste 72.000 de pacienti,
dintre care 44.672 au fost cazuri confirmate de infectie cu noul coronavirus SARS CoV-2,
16.186 cazuri suspecte, 10.567 cazuri diagnosticate clinic și 889 cazuri asimptomatice. Dintre
cazurile confirmate, 80.9% cazuri au fost ușoare, marea majoritate (86,6%) inregistrate la
persoane cu vârste cuprinse între 30 și 79 de ani. Aproximativ 14% au fost cazuri severe, care
au inclus pneumonie și dificultăți de respirație, și 5% au fost pacienti in stare critica, cu
insuficiență respiratorie, șoc septic și insuficiență multiorganica.
Rata generală a mortalității a fost de 2.33%, insa aceasta variaza mult in functie de varsta, fiind
sub 1% pana in 50 ani si 1.3% intre 50-59 ani. Ulterior mortalitatea creste: la grupa de varsta
60-69 ani este 3,6%, la cei intre 70-79 - 8% si peste 80 ani- 14.8%. In studiul din China au fost
incluse 1023 de decese, majoritatea fiind inregistrate la persoanele cu vârsta de peste 60 de ani
si la cele cu comorbiditati. Sexul masculin a fost mai frecvent afectat, una din explicatiile
posibile fiind legata de prevalenta mult crescuta a fumatorilor in randul barbatilor in China.

Aceste date par sa fie confirmate de evolutia epidemiei din Italia, a 2 a cea mai afectata tara in
prezent (>21000 cazuri si 1441 decese). In Italia (12729 cazuri si 1441 decese) vârsta medie a
celor care au murit pana la data de 14.03 2020 a fost de 81 de ani (42.2% pacienti intre 80-89
ani, 14.1 % peste 90 ani), 80% sunt barbati și mai mult de două treimi dintre acești pacienți au
avut comorbiditati (diabet zaharat, boli cardiovasculare, cancer), sau au fost fumători. Cauza
decesului a fost detresa acuta respiratorie (ARDS) in cursul evolutiei unei pneumonii
determinata de SARS-CoV-2.

In Coreea de sud (8162 cazuri- 75 decese) au fost 2 clustere mari legate de un grup religios
Shincheonji Church, Daegu si un alt cluster legat de cazuri in mediul intraspitalicesc,
majoritatea in sectiile de psihiatrie. Distributia cazurilor curba in M cu doua varfuri la 20 si 50
ani, fara diferente pe grupe de varsta sau sex care ar putea fi atribuite unei susceptibilitati
distincte, ci mai curand unor diferente sociale, legate de deplasari, activitati sociale, aglomerari
populationale.

Exista la ora actuala sugestii care atribuie mortalitatea unei hiperinflamatii generate de
replicarea virala, care ar surveni mai tarziu in cursul evolutiei bolii si ar genera o „furtuna de
citokine proinflamatorii”, responsabila de leziunile tisulare si sunt facute sugestii terapeutice
pentru pacientii severi.

Au fost putine cazuri confirmate la copii, datele din China arata ca acestia se infecteaza de la
adulti in mediul familial, si, spre deosebire de gripa, nu reprezinta un vector important de
transmitere in comunitate. Infectia are evolutie blanda la copii, nefiind raportate decese in
grupa de varsta 0-9 ani. In Coreea de sud au fost raportate cazuri (cu evolutie usoara) la copii,
reprezentand 4.8% din cazurile confirmate, dintre acestea numai 15.9% la cei cu varste intre 0–
9 ani.

Rata reala a infectiilor usoare, nespitalizate nu este inca cunoscuta, si va fi determinata numai
prin studii de seroprevalenta. Astfel de infectii sunt importante pentru ca determina imunizarea
celor infectati si stoparea raspandirii virusului. Interesant, in China, unele studii realizate in
cursul epidemiei initiale, in asa numite „clinici pentru febrilitate” in care s-au testat exudate
nazo-faringiene, au aratat o rata foarte mica de infectii cu SARS CoV 2 (<1%), ceea ce ar indica
putine infectii asimptomatice sau cu simptomatologie nespecifica, insa aceste date trebuie
confirmate.

Receptori celulari. SARS CoV2 utilizeaza acelasi receptor ca SARS CoV. Acesta este
reprezentat de o metalopeptidaza - ACE II (enzima de conversie a angiotensinei 2), prezenta pe
celule epiteliale din mucoasa respiratorie, caile respiratorii, celule alveolare tip II pulmonare,
si pe endoteliul vascular.

MERS CoV utilizeaza un receptor distinct, o dipeptidilpeptidaza -DPP4 (CD26), care se


regaseste in tractul respirator inferior, mai ales pe celulele epiteliale alveolare, dar si in alte
tesuturi, ceea ce ar explica asocierea posibila a simptomatologiei respiratorii cu cea
gastrointestinala si cu insuficienta renala acuta. Sunt studii care au arat hiperexpresia ACE2
la pacienti cu comorbiditati (obezitate, astm), infectii virale concomitente si la fumatori,
considerati a fi la risc pentru evolutia severa a bolii.

Originea virusului. Analiza genomica a aratat ca SARS CoV-2 este un betacoronavirus,


distinct fata de coronavirusurile SARS CoV si MERS CoV. Desi toate cele trei coronaviruri
zoonotice au ca rezervor liliecii, provin de la specii diferite, si s-au transmis la om printr-o
gazda intermediara, care ramane inca necunoscuta pentru SARS CoV-2. Analizele filogenetice
sustin inrudirea SARS CoV2 cu un coronavirus izolat anterior de la lilieci din provincia
Yunnan (BatCoV RaTG13), fata de care exista 96.3% similitudine genetica.

Rezultatele secventierii intregului genom arata ca SARS CoV 2 reprezinta o clada distincta fata
de alte coronavirusuri SARS-like de la lilieci si nu este un recombinant intre alte coronavirusuri
umane sau animale, asa cum sugerasera studii preliminare bazate pe analiza secventelor
glicoproteinei din anvelopa virala. Analiza secventelor nucleotidice arata inrudire mai mare cu
SARS CoV (cca 765) vs MERS CoV, insa sunt diferente semnificative mai ales in regiunea
ORF 1ab si in regiunea ce codifica glicoproteina S (spike), din anvelopa virala, cu care se
realizeaza legarea de receptorul ACE2. SARS CoV -2 are o afinitate mai mare de legare de
receptorul ACE2 comparativ cu SARS CoV, aceasta fiind atribuita unor modificari
conformationale, date de achizitia a 6 noi aminoacizi in domeniul de legare la receptor, prin
selectie naturala in cursul evolutiei virusului. Aceeasi 6 aminoacizi se regasesc si in genomul
unui coronavirus izolat de la pangolin, insa datele nu sunt suficiente ca sa sustina rolul acestuia
ca gazda intermediara.

Secventele nucleotidice ale izolatelor SARS CoV-2 disponibile la ora actuala sunt foarte
omogene, ceea ce arata ca virusul este recent introdus in populatia umana si nu a suferit mutatii
majore. Desi au fost publicate date preliminare legate de existenta a 2 tulpini separate (S-
considerata ancestor, si L- derivata din S, intalnita cu frecventa mai mare la inceputul epidemiei
din Wuhan), acestea nu indica decat o diversitate genomica, fireasca pentru un virus ARN si nu
sunt in nici un fel asociate cu evolutia clinica.

Diagnosticul infectiei cu noul coronavirus se pune in prezent pe baza detectiei acidului


nucleic viral prin real time PCR in exudat nazo-faringian, lavaj brohoalveolar sau aspirat
traheobronsic. Au fost formulate si kituri de detectie a anticorpilor, care sunt testate in prezent,
si care vor permite evaluarea seroprevalentei infectiei si evidentierea infectiilor asimptomatice.

Tratamentul infectiilor cu coronavirusuri zoonotice. In prezent tratamentul este simptomatic


si suportiv, nu exista un tratament etiologic. Experimental, o serie de antivirale cu spectru larg
sunt testate pentru infectiile cu coronavirusuri, inclusiv cu 2019- nCoV.

Remdesivir este un nou analog nucleotidic, inhibitor al ARN polimerazei virale, care in studii
pe modele animale a aratat o imbunatatire a functiei pulmonare si o reducere importanta atat a
incarcarii virale, cat si a leziunilor la nivel pulmonar. Pare sa dea rezultate bune la pacientii
tratati empiric in China, a fost testat si in epidemia de febra hemoragica Ebola din 2018-2020
din RDC, dar fara eficienta mare.

O combinatie de inhibitori de proteaza frecvent administrata in infectia HIV (Kaletra-


lopinavir combinat cu un potentator farmacologic- ritonavir), eficienta in vitro, este testata
pentru infectia cu MERS CoV intr-un trial clinic (MIRACLE) in Arabia Saudita in combinatie
cu interferon beta. Rezultatele pe SARS CoV-2 par sa fie mai putin spectaculoase, dar
combinatia este inclusa in ghidurile de tratament, uneori asociata cu interferon nebulizat.

Cloroquina fosfat (antimalaric) si hidroxi-cloroquina (utilizata atat ca antimalaric, cat si in


boli autoimune -lupus, artrita reumatoida, artrita idiopatica juvenila, cu tolerabilitatea crescuta
fata de cloroquina) au inhibat eficient replicarea SARS Cov-2 in vitro.
Anterior, studii pe modele animale, si chiar incercari de utilizare la om in alte boli virale acute
cei doi compusi nu au dat rezultatele sperate. In China sunt in curs de evaluare in mai multe
trialuri clinice, in monoterapie sau in asociere cu Kaletra. Intre mecanismele propuse pentru
actiunea antivirala se numara impiedicarea acidifierii endozomilor, cu inhibitia internalizarii
virale si interferenta cu receptorul celular ACE2. Atat pentru cloroquina, cat si pentru
hidroxicloroquina, desi efectele adverse nu sunt importante, dozele terapeutice mari sunt
apropiate de cele toxice si pot precipita afectiuni cardiovasculare severe. In plus nu se stie cum
vor afecta efectele imunosupresoare ale celor doi compusi evolutia COVID-19.
OMS nu recomanda utilizarea corticosteroizilor la pacientii cu SARS- CoV-2, datele actuale
indicand riscuri crescute (necroza avasculara, posibila agravare a leziunilor pulmonare), fara
beneficii pentru supravietuire .
Pentru cazurile severe exista sugestii privind aparitia unui sindrom hiperinflamator precipat de
infectia virala- limfohistiocitoza hemofagocitica (febra, citopenie, hiperferitinemie cu ARDS
in 50% pacienti), in care anumite subseturi de pacienti ar putea beneficia de imunosupresoare
(steroizi doar in soc septic refractar sau exacerbari ale astm bronsic si in doze mici-dozele mari
precipita leziunile pulmonare, imunoglobuline intravenos) sau de blocanti selectivi de citokine
(ex. blocant IL1- anakinra, un anticorp monoclonal umanizat anti receptor IL-6 – Tocilizumab
si inhibitori de cai de semnalizare -inhibitori de JAK kinaze) - sindrom hiperinflamator
declansat de infectii virale.
Pentru cazurile usoare nu este indicat decat tratament suportiv, monitorizarea balantei hidro-
electrolitice, monitorizarea saturatiei de oxigen.

Oseltamivir si alti inhibitori de neuramainidaza activi pe virusurile gripale nu par sa fie eficienti
pe SARV coV 2. In China a fost testat si un inhibitor al internalizarii virusurilor gripale aprobat
in aceasta tara si in Rusia. Sunt investigate alte antivirale cu spectru larg pe virusuri ARN, care
inhiba ARN polimeraza virala, ca Favipiravir. Anterior, in cursul epidemiilor cauzate de SARS
CoV si MERS CoV studii observationale au aratat unele beneficii clinice asociate:
imunoprofilaxiei pasive bazate pe administrarea plasmei provenite de la pacienti vindecati;
utilizarii combinate a PEG IFN alfa si ribavirinei, utilizarii combinate a unor doze crescute de
corticosteroizi si interferonului alfacon-1. O serie de medicamente traditionale chinezesti sunt
utilizate empiric. Se realizeaza un screening permanent al bibliotecilor de compusi chimici si
al bazelor de date pentru a gasi potentiale antivirale eficiente.

Preventie

Vaccin. In prezent nu exista un vaccin anti coronavirusuri. Studii preliminare au fost realizate
in cursul epidemiei SARS CoV, dar abandonate dupa disparitia virusului. La ora actuala sunt
formulati si testati multi candidati vaccinali, in studii finantate atat de companii farmaceutice,
cat si de NIH, SUA si de alianta globala Cepi (un parteneriat intre organizatii publice, private,
filantropice si ale societatii civil) pentru inovare in pregatirea impotriva epidemiilor. Trebuie
subliniat ca un vaccin eficient si sigur trebuie sa treaca obligatoriu prin mai multe etape pentru
a fi aprobat pentru utilizare: dezvoltare preclinica, care presupune teste in vitro si in vivo, pe
modele animale si dezvoltare clinica, cu trialuri clinice de faza I-III, care evalueaza eficienta
imunogenitatea si siguranta vaccinului. Post-autorizare se realizeaza o monitorizare continua a
sigurantei.

Masuri de sanatate publica. La ora actuala COVID 19 este declarata de OMS pandemie.
Anterior, pe 30 ianuarie, OMS a declarat epidemia generata de noul coronavirus o urgenta
internationala de sanatate publica, semnaland necesitatea unui raspuns rapid coordonat
international, in special pentru a preveni acumularea de cazuri in regiunile cu resurse limitate.
Acesta presupunea supravegherea activă, depistarea precoce, izolarea și gestionarea cazurilor,
identificarea contactilor și prevenirea răspândirii ulterioare a infecției.
Anterior, China instituise carantina completa pentru mai multe metropole (>54 milioane de
persoane), prima fiind Wuhan, oras cu 11 milioane de locuitori, in care s-a diagnosticat pentru
prima data infectia. La 23 ianuarie, atat mijloacele de transport in comun din oras, cat si traficul
aerian și cel feroviar dinspre Wuhan au fost suspendate in incercarea de a stopa diseminarea
noului coronavirus. Au fost luate masuri extreme de monitorizare a miscarilor populatiei,
inclusiv prin utilizarea inteligentei artificiale, prin tranformarea unei platforme de plati on- line
intr-un card electronic de sanatate ce restrictiona deplasarea si accesul in anumite zone. Aceste
masuri au fost eficiente- China raporteaza in prezent sub 20 de cazuri noi zilnic.
In mare parte masurile sunt justificate daca tinem cont de modul in care a evoluat epidemia
SARS din 2003-2004, un exemplu de ce insemna o viroza emergenta în conditiile globalizãrii,
urbanizãrii excesive, cu supraaglomerãri populationale si vitezei mari de deplasare. SARS a
fost recunoscut la sfarsitul lunii februarie 2003, dupa ce infectii fusesera diagnosticate in China
inca din noiembrie 2002, fara sa fie insa raportate catre OMS. Cazul index pentru transmiterea
bolii dincolo de teritoriul Chinei continentale a fost un medic de 65 de ani, ce îngrijise pacienti
bolnavi de SARS în Guangdong. La 21 februarie 2003 acesta s-a cazat la un hotel din Hong
Kong, prezentând semnele unei afectiuni respiratorii ce debutase cu 6 zile în urmã. Starea
sanatãtii sale s-a deteriorat rapid, o zi mai târziu ea fost internat, si a decedat pe 4 martie. O
serie de cazuri secundare au aparut în spital si 17 persoane care au venit în contact cu pacientul
index la hotel au fost infectate, declansând epidemia din Hong Kong. Unele dintre acestea au
calatorit spre Vietnam, Singapore si Toronto, unde au devnit sursa epidemiilor locale. La 28
februarie 2003 un pacient cu simptomatologie pseudogripalã este internat într-un mic spital
privat din Hanoi, Vietnam; 60 de membri ai personalului medical se îmbolnãvesc. Dr. Carlo
Urbani, ofiterul OMS din regiune, instituie rapid carantina completã a spitalului, limitând astfel
rãspândirea bolii, si avertizeaza OMS despre existenta noului sindrom. El însusi rãmâne în
spital pânã pe data de 11 martie, când cãlãtoreste spre Bangkok, Thailanda; în timpul zborului
devine simptomatic, se autoizoleazã pe aeroport si decedeazã dupã 18 zile, pe 29 martie 2003.
Pe 12 martie 2003, OMS a instituit alertã globalã de sanatate publica, iar 3 zile mai târziu s-a
constituit cea mai mare retea internationalã de laboratoare pentru studiul noului sindrom, care
avea sa identifice SARS CoV.

Bibliografie selectiva
O pagina speciala dedicata noului coronavirus este mentinuta de la inceputul epidemiei de
New England Journal of Medicine - https://www.nejm.org/coronavirus.
The Lancet - https://www.thelancet.com/coronavirus
Recent, Elsevier a creat un hub pentru informatii legate de noul coronavirus -
https://www.elsevier.com/connect/coronavirus-information-center

Articolele cele mai importante sunt mentionate mai jos, lista se imbogateste continuu.

Izolarea 2019-nCoV
1. Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, Zhao X, Huang B, Shi W, Lu R,
Niu P, Zhan F, Ma X, Wang D, Xu W, Wu G, Gao GF, Tan W; China Novel
Coronavirus Investigating and Research Team. A Novel Coronavirus from Patients
with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 2020 Jan 24. doi:
10.1056/NEJMoa2001017. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 31978945.
2. Zhou, P. et al. A pneumonia outbreak associated with a new corona- virus of probable bat origin. Nature https://
doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7 (2020).
3. Chan JF, Kok KH, Zhu Z, Chu H, To KK, Yuan S, Yuen KY. Genomic
characterization of the 2019 novel human-pathogenic coronavirus isolated from a
patient with atypical pneumonia after visiting Wuhan. Emerg Microbes Infect. 2020
Dec;9(1):221-236. doi: 10.1080/22221751.2020.1719902. PubMed PMID: 31987001.
4. Chen Y, Liu Q, Guo D. Emerging coronaviruses: genome structure, replication, and
pathogenesis. J Med Virol. 2020 Jan 22. doi: 10.1002/jmv.25681. [Epub aheadof
print] Review. PubMed PMID: 31967327.

Evolutia epidemiei
1. Paules CI, Marston HD, Fauci AS. Coronavirus Infections-More Than Just the
Common Cold. JAMA. 2020 Jan 23. doi: 10.1001/jama.2020.0757. [Epub ahead of
print] PubMed PMID: 31971553.
2. Li Q, Guan X, Wu P, Wang X, Zhou L, Tong Y, Ren R, Leung KSM, Lau EHY,
WongJY, Xing X, Xiang N, Wu Y, Li C, Chen Q, Li D, Liu T, Zhao J, Li M, Tu W,
Chen C,Jin L, Yang R, Wang Q, Zhou S, Wang R, Liu H, Luo Y, Liu Y, Shao G, Li
H, Tao Z, Yang Y, Deng Z, Liu B, Ma Z, Zhang Y, Shi G, Lam TTY, Wu JTK, Gao
GF, Cowling BJ,Yang B, Leung GM, Feng Z. Early Transmission Dynamics in
Wuhan, China, of Novel Coronavirus-Infected Pneumonia. N Engl J Med. 2020 Jan
29. doi:10.1056/NEJMoa2001316. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 31995857.
3. The Lancet. Emerging understandings of 2019-nCoV. Lancet. 2020 Jan 24. pii:
S0140-6736(20)30186-0. doi: 10.1016/S0140-6736(20)30186-0. [Epub ahead of print]
PubMed PMID: 31986259.
4. Li X, Zai J, Wang X, Li Y. Potential of large 'first generation' human-to-human
transmission of 2019-nCoV. J Med Virol. 2020 Jan 30. doi: 10.1002/jmv.25693.
[Epub ahead of print] PubMed PMID: 31997390.
5. Rothe C, Schunk M, Sothmann P, Bretzel G, Froeschl G, Wallrauch C, Zimmer T,
Thiel V, Janke C, Guggemos W, Seilmaier M, Drosten C, Vollmar P, Zwirglmaier K,
Zange S, Wölfel R, Hoelscher M. Transmission of 2019-nCoV Infection from an
Asymptomatic Contact in Germany. N Engl J Med. 2020 Jan 30. doi:
10.1056/NEJMc2001468. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 32003551.
6. Hui DS, I Azhar E, Madani TA, Ntoumi F, Kock R, Dar O, Ippolito G, Mchugh
TD,Memish ZA, Drosten C, Zumla A, Petersen E. The continuing 2019-nCoV
epidemic threat of novel coronaviruses to global health - The latest 2019 novel
coronavirus outbreak in Wuhan, China. Int J Infect Dis. 2020 Jan 14;91:264-266. doi:
10.1016/j.ijid.2020.01.009. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 31953166.
7. Remuzzi A, Remuzzi G. COVID-19 and Italy: what next? Lancet
DOI:https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30627-9)

Clinica infectiei
1. Huang C, Wang Y, Li X, Ren L, Zhao J, Hu Y, Zhang L, Fan G, Xu J, Gu X, ChengZ,
Yu T, Xia J, Wei Y, Wu W, Xie X, Yin W, Li H, Liu M, Xiao Y, Gao H, Guo L, XieJ,
Wang G, Jiang R, Gao Z, Jin Q, Wang J, Cao B. Clinical features of patients infected
with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 2020 Jan 24. pii: S0140-
6736(20)30183-5. doi: 10.1016/S0140-6736(20)30183-5. [Epub ahead of print]
PubMed PMID: 31986264.
2. Chan JF, Yuan S, Kok KH, To KK, Chu H, Yang J, Xing F, Liu J, Yip CC, Poon
RW,Tsoi HW, Lo SK, Chan KH, Poon VK, Chan WM, Ip JD, Cai JP, Cheng VC,
Chen H, HuiCK, Yuen KY. A familial cluster of pneumonia associated with the 2019
novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family
cluster. Lancet. 2020 Jan 24. pii: S0140-6736(20)30154-9. doi: 10.1016/S0140-
6736(20)30154-9. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 31986261.
3. CDC China http://weekly.chinacdc.cn/en/article/id/e53946e2-c6c4-41e9-9a9b-
fea8db1a8f51 11th Feb. 2020
4. Korean Society of Infectious Diseases, Korean Society of Pediatric Infectious Diseases,
Korean Society of Epidemiology, Korean Society for Antimicrobial Therapy, Korean
Society for Healthcare-associated Infection Control and Prevention, Korea Centers for
Disease Control and Prevention. Report on the Epidemiological Features of
Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Outbreak in the Republic of Korea from
January 19 to March 2, 2020. J Korean Med Sci. 2020
Mar;35(10):e112. https://doi.org/10.3346/jkms.2020.35.e112)

Originea virusului si receptorii celulari

1. Paraskevis D, Kostaki EG, Magiorkinis G, Panayiotakopoulos G, Sourvinos G,


Tsiodras S. Full-genome evolutionary analysis of the novel corona virus (2019-nCoV)
rejects the hypothesis of emergence as a result of a recent recombination event. Infect
Genet Evol. 2020 Jan 28:104212. doi:10.1016/j.meegid.2020.104212. [Epub ahead of
print] PubMed PMID: 32004758.
2. Ji W, Wang W, Zhao X, Zai J, Li X. Homologous recombination within the spike
glycoprotein of the newly identified coronavirus may boost cross-species transmission
from snake to human. J Med Virol. 2020 Jan 22. doi:10.1002/jmv.25682. [Epub ahead
of print] PubMed PMID: 31967321.
3. Wan Y, Shang J, Graham R, Baric RS, Li F. Receptor recognition by novel
coronavirus from Wuhan: An analysis based on decade-long structural studies of
SARS. J Virol. 2020 Jan 29. pii: JVI.00127-20. doi: 10.1128/JVI.00127-20. [Epub
ahead of print] PubMed PMID: 31996437.
4. Benvenuto D, Giovannetti M, Ciccozzi A, Spoto S, Angeletti S, Ciccozzi M. The
2019-new coronavirus epidemic: evidence for virus evolution. J Med Virol. 2020Jan
29. doi: 10.1002/jmv.25688. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 31994738.
5. Li W, Moore MJ, Vasilieva N, Sui J, Wong SK, Berne MA, Somasundaran M, Sullivan
JL, Luzuriaga K, Greenough TC, Choe H, Farzan M. Angiotensin-converting enzyme
2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 2003 Nov
27;426(6965):450-4. PubMed PMID: 14647384.
6. X. Tang et al. On the origin and continuing evolution of SARS-CoV-2 National
Science Review, nwaa036, https://doi.org/10.1093/nsr/nwaa036

Diagnostic
1. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DK, Bleicker T,
Brünink S, Schneider J, Schmidt ML, Mulders DG, Haagmans BL, van der Veer B,
van den Brink S, Wijsman L, Goderski G, Romette JL, Ellis J, Zambon M, Peiris
M,Goossens H, Reusken C, Koopmans MP, Drosten C. Detection of 2019
novelcoronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020 Jan;25(3).
doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045. PubMed PMID: 31992387.

Tratament
1. Lu H. Drug treatment options for the 2019-new coronavirus (2019-nCoV). Biosci
Trends. 2020 Jan 28. doi: 10.5582/bst.2020.01020. [Epub ahead of print] PubMed
PMID: 31996494.
2. Sheahan TP, Sims AC, Leist SR, Schäfer A, Won J, Brown AJ, Montgomery SA, Hogg
A, Babusis D, Clarke MO, Spahn JE, Bauer L, Sellers S, Porter D, Feng JY, Cihlar T,
Jordan R, Denison MR, Baric RS. Comparative therapeutic efficacy of remdesivir and
combination lopinavir, ritonavir, and interferon beta against MERS-CoV. Nat Commun.
2020 Jan 10;11(1):222. doi: 10.1038/s41467-019-13940-6.
3. Arabi YM, Alothman A, Balkhy HH, Al-Dawood A, AlJohani S, Al Harbi S, Kojan
S,Al Jeraisy M, Deeb AM, Assiri AM, Al-Hameed F, AlSaedi A, Mandourah Y,
AlmekhlafiGA, Sherbeeni NM, Elzein FE, Memon J, Taha Y, Almotairi A, Maghrabi
KA, QushmaqI, Al Bshabshe A, Kharaba A, Shalhoub S, Jose J, Fowler RA, Hayden
FG, Hussein MA; And the MIRACLE trial group. Treatment of Middle East Respiratory
Syndromewith a combination of lopinavir-ritonavir and interferon-β1b (MIRACLE
trial):study protocol for a randomized controlled trial. Trials. 2018 Jan 30;19(1):81.doi:
10.1186/s13063-017-2427-0.
4. Falzarano D, de Wit E, Martellaro C, Callison J, Munster VJ, Feldmann H. Inhibition
of novel β coronavirus replication by a combination of interferon-α2b and ribavirin. Sci
Rep. 2013;3:1686. doi: 10.1038/srep01686. PubMed PMID:23594967; PubMed Central
PMCID: PMC3629412.
5. Xueting Yao, Fei Ye, Miao Zhang, Cheng Cui, Baoying Huang, Peihua Niu, Xu Liu, Li Zhao,
Erdan Dong, Chunli Song, Siyan Zhan, Roujian Lu, Haiyan Li, Wenjie Tan, Dongyang Liu,
In Vitro Antiviral Activity and Projection of Optimized Dosing Design of
Hydroxychloroquine for the Treatment of Severe Acute Respiratory Syndrome
Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clinical Infectious Diseases, ,
ciaa237, https://doi.org/10.1093/cid/ciaa237
6. Touret F, de Lamballerie X. Of chloroquine and COVID-19. Antiviral Res. 2020 Mar
5;177:104762. doi: 10.1016/j.antiviral.2020.104762.PubMed PMID: 32147496
7. Puja Mehta, Daniel F McAuley, Michael Brown, Emilie Sanchez, Rachel S Tattersall,
Jessica J Manson, on behalf of the HLH Across Speciality Collaboration, UK COVID-
19: consider cytokine storm syndromes and immunosuppression The Lancet, March 13,
2020 https://doi.org/10.1016/ S0140-6736(20)30628-0

Istoric epidemia SARS si MERS


1. S Ruta, C Cernescu Viroze cu potential bioterorisr, Ed Carol Davila, 2004
2. de Wit E, van Doremalen N, Falzarano D, Munster VJ. SARS and MERS: recent
insights into emerging coronaviruses. Nat Rev Microbiol. 2016 Aug;14(8):523-34 doi:
10.1038/nrmicro.2016.81. Epub 2016 Jun 27. Review. PubMed PMID: 27344959.
3. Berger A, Drosten CH, Doerr HW, Stürmer M, Preiser W. Severe acute respiratory
syndrome (SARS): paradigm of an emerging viral infection. Journal of Clinical
Virology. 2004;29(1):13–22
4. Peiris JSM, Yuen KY, Osterhaus ADME, Stöhr K. The severe acute
respiratory syndrome. New England Journal of
Medicine. 2003;349(25):2431–2441.
5. WHO- SARS Center http://www.who.int/csr/sars/en/
6. WHO- MERS https://www.who.int/emergencies/mers-cov/en/
7. CDC. Severe acute respiratory syndrome (SARS). 2004. Web Page. Available
at: http://www.cdc.gov/ncidod/sars/
8. Drosten C, Gunther S, Preiser W, van der Werf S, Brodt HR, Becker S, Rabenau H,
Panning M, Kolesnikova L, Fouchier RA, Berger A, Burguiere AM, Cinatl J,
Eickmann M, Escriou N, Grywna K, Kramme S, Manuguerra JC, Muller S, Rickerts
V, Sturmer M, Vieth S, Klenk HD, Osterhaus AD, Schmitz H, Doerr HW.
Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory
syndrome. New England Journal of Medicine. 2003;348(20):1967–76.
9. Rota PA, Oberste MS, Monroe SS, Nix WA, Campagnoli R, Icenogle JP, Penaranda
S, Bankamp B, Maher K, Chen MH, Tong S, Tamin A, Lowe L, Frace M, DeRisi JL,
Chen Q, Wang D, Erdman DD, Peret TC, Burns C, Ksiazek TG, Rollin PE, Sanchez
A, Liffick S, Holloway B, Limor J, McCaustland K, Olsen-Rasmussen M, Fouchier R,
Gunther S, Osterhaus AD, Drosten C, Pallansch MA, Anderson LJ, Bellini WJ.
Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory
syndrome. Science. 2003;300(5624):1394–9.
10. Al-Tawfiq JA, Smallwood CA, Arbuthnott KG, Malik MS, Barbeschi M, Memish ZA.
Emerging respiratory and novel coronavirus 2012 infections and mass gatherings.East
Mediterr Health J. 2013;19 Suppl 1:S48-54. Review. PubMed PMID: 23888795.
11. Alagaili AN, Briese T, Mishra N, Kapoor V, Sameroff SC, Burbelo PD, de Wit E, Munster VJ, Hensley LE,
Zalmout IS, Kapoor A, Epstein JH, Karesh WB, Daszak P, Mohammed OB, Lipkin WI. Middle East
respiratory syndrome coronavirus infection in dromedary camels in Saudi Arabia. MBio. 2014; 5(2):
e00884-14.
12. Alenazi TH, Al Arbash H, El-Saed A, Alshamrani MM, Baffoe-Bonnie H, Arabi YM, Al Johani SM, Hijazi R,
Alothman A, Balkhy HH. Identified Transmission Dynamics of Middle East Respiratory Syndrome
Coronavirus Infection During an Outbreak: Implications of an Overcrowded Emergency Department.
Clin Infect Dis. 2017; 65(4): 675-679.
13. Alhetheel A, Altalhi H, Albarrag A, Shakoor Z, Mohamed D, El-Hazmi M, Somily A, Barry M, Bakhrebah
M, Nassar M. Assessing the Detection of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus IgG in
Suspected and Proven Cases of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus Infection. Viral
Immunol. 2017; 30(9): 649-653.
14. Hijawi B, Abdallat M, Sayaydeh A, Alqasrawi S, Haddadin A, Jaarour N, Alsheikh S,
Alsanouri T. Novel coronavirus infections in Jordan, April 2012: epidemiological
findings from a retrospective investigation. East Mediterr Health J. 2013;19 Suppl
1:S12-8. PubMed PMID: 23888790.
15. Al Ghamdi M, Alghamdi KM, Ghandoora Y, Alzahrani A, Salah F, Alsulami A, Bawayan MF, Vaidya D, Perl
TM, Sood G. Treatment outcomes for patients with Middle Eastern Respiratory Syndrome Coronavirus
(MERS CoV) infection at a coronavirus referral center in the Kingdom of Saudi Arabia. BMC Infect Dis.
2016; 16: 174.
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

ALGORITM DE DIAGNOSTIC VIRUSOLOGIC

1. Suspiciune viroză - date clinice / paraclinice / epidemiologice


2. Recoltarea probelor - locul şi timpul potrivit
3. Transport probe - rapid, la rece, în siguranţă
4. Directiile diagnosticului virusologic

1. SUSPICIUNEA DE VIROZĂ
Pentru o buna orientare a diagnosticului se apeleaza la trei categorii de
informatii despre pacient:
1. Date clinice
2. Date paraclinice
3. Date epidemiologice

Pentru a sumariza aceste date se pot introduce intr-un formular – tabel 1.1

Tabel 1.1. Formular de trimitere pentru diagnostic virusologic.


Adresa spitalului/policlinicii/ cabinetului Medicul caruia i se va comunica rezultatul (tel,
ce trimite produsul patologic fax, e-mail)

Nume, prenume pacient Sex, Varsta


Date clinice, suspiciune diagnostic Data debutului simptomatolgiei

Tipul produsului patologic Data, ora recoltarii


Tipul tratamentului administrat in Date epidemiologice (contact cu boli infectioase
prealabil transmisibile, vectori, calatorii in zone endemice
pt o anumita boala, vaccinari)
Analiza solicitata
Semnatura, parafa medicului
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

2. RECOLTAREA PRODUSULUI PATOLOGIC

Reguli de aur al recoltarii. Există trei condiţii importante în recoltarea produselor


patologice:
1. recoltarea din locul şi la timpul potrivit
2. recoltarea steril pentru pacient, pentru proba si pentru personalul medical
3. etichetare corecta a recipientelor utilizate

1. Recoltarea din locul şi la timpul potrivit.


Produsele patologice recoltate variază în funcţie de perioada de evoluţie:
- incubaţie + faza prodromală - izolarea virusului de la poarta de intrare
- prodromală + stare - izolarea virusului din organul-ţinta şi diagnosticul
serologic - răspunsului imun de fază acută (Ig M)
- de la jumătatea fazei de stare - diagnostic serologic (IgG)

ATENŢIE:

→ organul implicat clinic nu este totdeauna locul multiplicării maxime a


virusului (de ex.: meningitele acute virale sunt determinate cel mai frecvent de
enterovirusuri, produsul patologic de elecţie sunt materiile fecale, aceste virusuri având poartă
de intrare digestiva şi eliminându-se prin exfolierea celulelor epiteliului intestinal, si nu
lichidul cefalo-rahidian, mai greu de recoltat şi în care s-a demonstrat prezenţa de anticorpi
antivirali secretaţi intratecal care pot impiedica diagnosticul).
→ gravitatea bolii nu este întotdeauna proporţională cu şansele de izolare, există
viroze cu simptomatologie “zgomotoasă” la care nu se poate izola agentul etiologic.

2. Cum recoltam/alegem produsul patologic?

SÂNGE
• se recoltează 3-5 ml prin puncţie venoasă aseptică (excepţii, la copii prin punctie
digitală, la nou-nascut – puncţie in călcâi, cordon ombilical)
• se recolteaza pe anticoagulant (EDTA, heparina, citrat-dextroza A) sau simplu (pentru
diagnosticul serologic)
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

• risc de contaminare crescut (măsuri de protecţie: manusile trebuie purtate pentru toate
procedurile; nu se folosesc decat seringi de unica utilizare; acele nu trebuie
reacoperite, rupte, indoite sau indepartate din seringile de unica folosinta
• colectat în - tuburi etanşe;
- microcapilare ;
- rondele de hârtie uscată ;
Virusuri frecvent izolate: virusuri care disemineaza viremic si agentii etiologici ai febrelor
hemoragice

LICHID CEFALORAHIDIAN (LCR)


• Se recoltează 2-3 ml prin puncţie rahidiană la nivelul L4-L5, inainte de inceperea
tratamentului antibiotic; se prelucrează cât mai rapid.
• Se pastreaza la 2-8 C, fara adaos de mediu de transport viral (MTV); transport cat mai
rapid posibil, pe gheata sau la -70 C.
• Pleiocitoza (numărul crescut de celule limfomonocitare din LCR) poate apărea
macroscopic ca turbiditate (lichid opalescent sau chiar cu aspect cremos), de obicei in
meningitele bacteriene.
• In meningitele virale LCR este clar, are celularitate scazută
Virusuri frecvent izolate: virusul rabic, unele arbovirusuri, enterovirusuri; se mai utilizeaza
pentru aprecierea permeabilitatii barierei hematoencefalice si a sintezei intratecale de
anticorpi.

SECRETII NAZO - FARINGIENE


a) spalatura nazo faringiana (Exsudat naso-faringian) se obtine cu ajutorul unor tampoane
sterile cu coada introduse in cornetul nazal inferior - mişcări rotative, se introduce tamponul
în mediu transport viral (soluţie salină tamponată Hanks sau Earle), se lasa o ora pentru eluţia
virusului şi apoi centrifugare 1200 rpm. / 10 minute, se foloseşte sedimentul.
b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind un speculum nazal prin administrarea a 3 ml
ser fiziologic in nari cu o seringa atasata la un tub de plastic.
• Atenţie la evitarea administrarii antisepticelor/antibioticelor anterior recoltarii şi la
toaleta cavităţii bucale.
• Se evita atingerea tamponului de limba, obraji sau buze pentru evitarea cotaminarii.
• Sputa recoltata in urma tusei si lichidul veziculelor din mucoasa bucala nu sunt utile
pentru diagnosticul virusologic.
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Virusuri frecvent izolate: virusurile gripale, virusurile paragripale, adenovirusuri,


rhinovirusuri, coronavirusuri, virusul respirator sinciţial, v.rujeolos, v. rubeolos, v. urlian; mai
rar: herpes simplex I, varicelozosterian, citomegalic

MATERII FECALE (MF)


• Se recoltează 4-8 grame MF în soluţie MgSO4 1M în suspensie 20% (MgSO4
stabilizeaza infectivitatea enterovirusurilor - agentii meningitelor virale
• Unele virusuri se elimină săptămâni la rând (enterovirusurile), altele doar la
debutul bolii: 2-4 zile (rotavirusuri)
• Se face o suspensie 1 - 2 g materii fecale + 15 ml soluţie Hanks
• Centrifugare în tub de centrifugă pe bile de sticlă sterile, pentru izolarea virală
se foloseşte supernatantul clarificat.
• Se recomanda recoltarea a 2 probe de la pacient la interval de 24-48 ore pentru
izolarea enterovirusurilor
Virusuri frecvent izolate: enterovirusuri, rotavirusuri, calicivirusuri, mai rar adenovirusuri
enterice; pentru diagnosticul etiologic in epidemii de boli diareice acute la copii si
enterovirusuri mai ales in epidemii de meningita aseptica sau pentru supraveghere infectiilor
cu virusuri poliomielitice si alte enterovirusuri.

URINA
• Se recoltează steril 100 ml, preferabil urina de dimineata, dar orice specimen
urinar obtinut prin abstinenta de la mictiune timp de 2 ore este adecvat pentru
diagnosticul virusologic.
• Cel mai frecvent se utilizează în diagnosticul v. citomegalic (CMV )
• Centrifugare 20 min la 2000 rot./min. se foloseşte sediment, reluat l/10 în
mediu de cultură
• şansele de izolare sunt reduse, fiind necesare de obicei 2 - 3 probe.
• Există, de asemenea, posibilitatea recoltării cu tampoane sterile din uretră
Virusuri frecvent izolate: V. citomegalic, v. rujeolos.

LICHID DIN VEZICULE


• Colectarea lichidelor din vezicule, bule, pustule se face după dezinfectarea
tegumentului, se aspiră lichidul si se recoltează material raclat de la baza leziunii cu
un ac ataşat la seringa de tuberculină sau cu pipeta Pasteur.
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

• Lichidul vezicular contine titruri inalte de virus in cazul leziunilor recente (1-2 zile)
• Se inoculeaza ca atare pe culturi de celule pentru izolare sau daca se urmareste
evidentierea antigenelor virale se fixeaza cu acetona pe lame de sticla si se identifica
cu anticorpi specifici marcati cu fluorocromi.
Virusuri frecvent izolate: HSV I, HSV II şi VZV.

SALIVA.
• Se recolteaza saliva de lângă ductul Stenon cu tampon steril.
• Practic, utilizarea salivei este limitata la diagnosticul infectiei rabice - numai in
laboratoarele specializate cu nivel de biosecuritate ridicat.
• Exista si tehnici imunoenzimatice pentru detectia anticorpilor anti-HIV, anti-VHC din
saliva (diagnostic rapid)

TAMPOANE VAGINALE, LAVAJ CERVICO-VAGINAL, TAMPON URETRAL


• Recolatarea de la nivelul colului uterin si uretrei - cu tampoane sterile, fără toaleta
prealabilă a regiunii/ la nivelul colului uterin se poate folosi si periuta de recoltare
endocervicala (utilizata pentru testul Babes-Papanicolau)
• Lavajul cervico-vaginal se obtine cu ajutorul unei seringi la care este atasata o pipeta
de plastic; 10 ml de TFS sau ser fiziologic se introduc in vagin la nivelul fornixului
posterior; se aspira repetat de 2-3 ori; produsul patologic astfel obtinut se stocheata la -
700C.
Virusuri frecvent izolate: virusuri herpetice

TAMPON CONJUNCTIVAL

• Se recolteaza cu tampon steril de la nivelul sacului conjunctival al pleoapei inferioare


in mediu de transport viral sau intr-un tub steril cu 0,5 ml TFS (daca se foloseste
imediat)
Virusuri frecvent izolate: herpesviridae, paramixoviridae, adenovirusuri si enterovirusuri
(Coxsackie A24, enterovirus 70). Este utilizat pentru diagnosticul etiologic in conjunctivite si
keratoconjunctivite .

BIOPSIA DE ORGAN
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

• fragmentul de organ se introduce în câţiva mililitri soluţie salină + ser fetal de


viţel 10 % + antibiotice în concentratiile folosite în culturile de celule
(prelucrare cât mai rapidă / asepsie obligatorie).
• Daca se intentioneaza izolarea de virusuri sau initierea unui explant tisular
produsul nu va fi fixat si se vor lua toate masurile pentru prelucrarea rapida
• Tesuturile destinate diagnosticului molecular trebuie neaparat inghetate dupa
prelevare. Tumorile si tesutul solid sunt surse de nucleaze si proteaze (inhiba
testele moleculare).

3. RECOLTAREA ŞI ETICHETAREA PROBELOR


Recoltarea probelor biologice se realizează în containere sterile pentru evitarea contaminării
cu germeni comensali sau din surse externe; acestea trebuiesc închise ermetic, pentru evitarea
contaminării mediului şi este necesară marcarea vizibilă a containerelor cu semn de biorisc ce
atensemn de biorisc ce atenţionează asupra con asupra coţinnutuui produse infecţioase.

Figura 1.1. Semnul de bio-risc.

În plus este indispensabilă etichetarea corectă, pentru a nu apărea erori (folosind etichete şi
creioane speciale, care să asigure marcaj rezistent la umezeală, îngheţ, fierbere)

3. TRANSPORTUL PRODUSELOR PATOLOGICE VIRUSOLOGICE


Pentru a garanta mentinerea infectivitatii virale transportul
produselor patologice trebuie sa se realizeze:
a) rapid, la rece
b) în siguranţă
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

a) conservarea infectivităţii virale implică temperaturi scăzute, de preferat transport în termos


cu gheaţă sau pe pungi de refrigerare (4 oC), azot lichid ( -190oC), zăpadă carbonică (-70oC),
baia de izopentan (-70oC). Mediul de transport viral contine soluţie salină tamponată (Hanks/
Earle), albumină bovină, antibiotice.
Atenţie: Nu sunt admise congelări şi decongelări repetate, care afectează infectivitatea virală!

b) pentru siguranţa transportului este necesară etanşeitatea perfectă, plus:


- semn de biorisc
- într-un ambalaj special (3 containere) pentru expediţie poştală.
Legătura clinician/medic laborator este indispensabilă deoarece diagnosticul
virusologic este scump, necesită aparatură complicata şi personal calificat.

4. Cum alegem metoda de diagnostic cea mai eficienta?

DIRECŢIILE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC SUNT:


1. Izolarea virală
2. Demonstrarea prezenţei virusului / componentelor sale
3. Diagnosticul serologic

1. IZOLAREA VIRALĂ
Inocularea produsului patologic se face pe suport viu - virusurile se pot multiplica numai în
celule vii, fiind incapabile să-şi asigure necesarul multiplicării pe medii artificiale: nu au
ribozomi (implicati in sinteza proteica), nu au mitocondrii (produc energia necesara
metabolismului celular).

Prin izolarea virală se obţine replicare virala in vitro, asociata cu multiplicarea


numărului de virioni si cu modificari caracteristice ale celulelor infectate viral.

Există 3 sisteme de izolare folosite în virusologie


• Culturi de celule: cel mai frecvent folosite la ora actuală
• Ou de găină embrionat (OGE) - foarte puţin folosit (acum numai pentru izolare sau
obţinere de vaccin gripal)
• Animalul de laborator - model experimental al bolii umane, dar scump
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Tabel 1.2. Avantajele si dezavantaje sistemelor de izolare virala


AVANTAJE DEZAVANTAJE

ANIMAL DE Infectie naturala, indicatii Cost crescut / considerente


LABORATOR asupra evolutiei bolii etice
O.G.E. Cost scazut Susceptibilitate limitata

CULTURI DE Sensibilitate buna / Susceptibilitate variabila


CELULE disponibilitate larga

Izolarea virala se poate realiza în incubaţie, faza prodromală sau iniţial în faza de stare

2. DEMONSTRAREA PREZENŢEI VIRUSULUI SAU COMPONENTELOR


VIRALE
a) Virion.
Virusurile au dimensiuni sub limita de rezoluţie a microscopului optic (PARTICULELE
VIRALE NU SE POT OBSERVA LA MICROSCOPUL OPTIC!). Detectia particulelor
virale se face la microscopul electronic (ME) sau prim imunelectronomicroscopie (IME) mai
laborioasă (2-3 zile), dar cu specificitate mai mare.
b) Antigenele virale se evidenţiază prin reacţii antigen-anticorp (cu anticorpi aparţinând
serurilor imune de referinţă (se obţin prin inocularea tulpinilor de referinţă la animal) ce pot fi
marcaţi enzimatic (teste imunoenzimatice - ELISA) sau fluorescent (reacţia de
imunofluorescenţă), etc.
c) Detecţia genomului viral – cu teste moleculare sau teste de detectie a acizilor nucleici
(NAT – nucleic acids test): PCR, Rt-PCR, Real Time PCR, etc.

Detecţia particulei virale si a antigenelor se realizează optim în perioada de stare (are


loc multiplicarea virusului în organul ţintă)

3. DIAGNOSTICUL SEROLOGIC este un diagnostic indirect, ce are la bază tot


reactii antigen-anticorp (se folosesc cel mai frecvent teste imunoenzimatice – ELISA)
Se pot realiza 2 tipuri de investigaţii :
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

• pe probă unică de ser în care are loc detecţia anticorpi antivirali de tip IgM (apar în
răspunsul imun primar) se utilizează testul ELISA de captură (cu anticorpi anti Ig M)
• pe probe pereche de ser - proba I se recoltează la debut, iar proba II - la 2-3
săptămâni (se utilizează tot ELISA tehnica indirectă sau de competiţie )
- se observă fie seroconversia (proba I - nu există anticorpi/ proba II - apar anticorpi
specifici virusului de detectat), fie creşterea semnificativă a titrului de anticorpi între cele 2
probe (de minim 4 ori)

CORELAŢII INTRE STADIUL BOLII SI OPŢIUNEA DE DIAGNOSTIC

Stadiul bolii Metode directe (izolare virus Diagnostic serologic


sau detecţie virală)
Incubaţie rară -
Fază debut frecvent IgM
Fază de stare rară Ig M şi Ig G
Convalescenţă/ cronicizare - IgG

BIOPROTECŢIA IN LABORATORUL DE VIRUSOLOGIE

Pe plan mondial există statuate 4 nivele de bioprotectie (BSL –


biosafety level), corespunzătoare a 4 grupe de risc progresiv al
microorganismelor patogene.

- BSL 1 - Risc individual = 0, Risc colectiv = 0 ;

- BSL 2 - Risc individual = moderat, Risc colectiv =scăzut (nu diseminează uşor şi
există măsuri profilaxie şi tratament eficiente)

- BSL 3 - Risc individual= moderat, Risc colectiv =moderat (există măsuri de


prevenire, tratament)

- BSL 4 - Risc individual = crescut, Risc colectiv =crescut (se transmit uşor, nu
există măsuri de tratament /prevenire.
Disciplina de virusologie UMF Carol Davila

CULTURI DE CELULE

Culturile celulare (CC) sunt cele mai folosite sisteme de izolare a


virusurilor.

CC pot fi obtinute din tesuturi umane sau animale, din tesuri adulte sau
embrionare, din tesuturi normale sau tumorale. Biopsia tisulara se obtine in
conditii sterile.

Toate etapele pentru realizarea unei CC au loc in conditii sterile, lucrandu-se


la hota microbiologica. Fragmentul biopsiat este triturat, tratat cu tripsina
(proteaza ce desface legaturile intercelulare) si EDTA, cu rol de protectie pentru
membrana celulara. Suspensia obtinuta este filtrata pentru indepartarea resturilor
tisulare, apoi este centrifugata. Celulele vor sedimenta la baza tubului de
centrifuga. Aceste celule disociate pot fi folosite pentru realizarea culturilor
celulare.

Celulele sunt transferate pe placi speciale pentru CC sau in flacoane (flask-


uri) de diferite forme si dimensiuni. Pentru stimularea diviziunii celulare se adauga
un mediu nutritiv, care contine solutie salina tamponata, ser fetal de vitel (SFV)
pentru aport proteic si de factori de crestere, vitamine, antibiotic si antifungice
pentru a preveni suprainfectiile bacteriene , respectiv fungice. CC sunt tinute la
incubator , la 37 de grade Celsius si sunt verificate zilnic la microscopul optic cu
inversie (sursa de lumina este inversata cu obiectivul). Se urmareste formarea
monostratului celular, care acopera intreaga baza a placii/flaconului .

Dupa aparitia monostratului celular se poate realiza un pasaj celular


(subcultivare), care reprezinta trecerea de la o cultura la urmatoarea cultura. Pentru
realizarea pasajului se arunca mediul nutritiv al culturii , se spala cultura cu solutie
tampon, se adauga tripsina si EDTA, pentru a obtine celule disociate care pot fi
folosite pentru urmatoarele doua culturi celulare.

Aspectul CC difera in functie de celulele din care provin:


Disciplina de virusologie UMF Carol Davila

- normale: celulele se ataşează de peretele flaconului, se multiplică până


acoperă peretele flaconului, realizează o cultură monostrat (fenomenul inhibiţiei de
contact);

- tumorale: se multiplică şi după acoperirea suprafeţei disponibile, cresc în


mai multe straturi şi în suspensie.

In functie de tesuturile din care provin, exista mai multe tipuri morfologice
de CC :

- CC epiteliale;

- CC de tip fibroblastic;

- CC de tip neuronal;

- CC endoteliale.

Clasificarea culturilor celulare :

1. Culturi de oragan – fragmente de organ mentinute in vitro in vederea


pastrarii arhitecturii si functiei intacte a celulelor diferentiate ( de ex. culturi de
trahee care sunt necesare izolarii rhinovirusurilor);

2. Culturi de celule dispersate, care se clasifica dupa timpul de


supravietuire in vitro in :

a) Culturi primare (mentin caracteristicile organului din care provin, dar


achizitioneaza si proprietati de suprafata noi, care le fac susceptibile la infectii
virale; pot fi mentinute in vitro timp limitat : 3-5 pasaje);

b) Tulpini celulare (au durata de viata limitata la 50-60 de pasaje; au


cariotip diploid; sunt folosite pentru prepararea vaccinurilor virale si pentru
diagnosticul virusologic);

c) Linii celulare ( pot avea un numar nelimitat de pasaje; au cariotip


heteroploid, de aceea nu sunt folosite pentru preparearea vaccinurilor virale vii;
sunt folosite pentru diagnosticul virusologic; sunt cunoscute sute de linii celulare ,
de ex. Vero, LLC-MK2- derivate din rinichi de maimuta, HeLa- derivate din
carcinom de col uterin etc.).
Disciplina de virusologie UMF Carol Davila

Celulele transformate sunt linii celulare ce au suferit o modificare stabila,


spontana sau prin expunere la diferiti agenti (virali, chimici, radiatii), modificare
care este mentinuta indefinit prin cultivare in vitro sau transplant in vivo.
Caracteristicile lor sunt :

1. conţin gene implicate în imortalizarea în vitro (cultivare nr. infinit


pasaje) modificari cromozomiale => cariotip aneuploid;

2. se multiplică haotic, cerinţe nutritive foarte scăzute (se multiplică


la concentraţii foarte scăzute de SFV), glicoliza anaerobă = sursa principala de
energie.

3. membrană celulară modificată în compoziţie (absenţa


fibronectinei => scaderea adeziunii intercelulare

4. nu au inhibitie de contact, se dispun dezordonat diferit de ţesutul


din care derivă

5. au telomeraza activa; inoculate la animale => TUMORI

6. modificarea morfologiei (rotunde, refrigente)

7. au antigene de suprafaţă diferite de N codif. de virus /celule


gazda=> neoantigene

8. aglutinează uşor cu lectinele (antigene vegetale)

9. modificarea mesageri secunzi (AMPc)

IZOLAREA VIRUSURILOR IN CULTURI CELULARE

In CC replicarea virala este recunoscuta datorita efectului citopatic (ECP).

Tipuri de efecte citopatice :

1. Sincitial (caracteristic virusurilor anvelopate, care parasesc celulele


infectate prin inmugurire, se leaga de receptorii celulelor invecinate, exprima
factorul de fuziune si se internalizeaza; se formeaza astfel o masa celulara giganta
multinucleata- sincitiu) (de ex. v. rujeolos, v. sincitial respirator, HIV)
Disciplina de virusologie UMF Carol Davila

2. Incluzionar (incluziile reprezinta proteine virale timpurii, care se


formeaza in faza de crestere logaritmica a ciclului replicativ viral; ele pot fi
localizate intranuclear, de ex. adenovirusurile, papovavirusurile,
intracitoplasmatic, de ex. v. rabic sau mixt (intracitoplasmatic si intranuclear , de
ex. v. herpetice si v. rujeolos)

3. Picnotic (caracteristic virusurilor neanvelopate, care parasesc celula


infectata prin liza, in faza de platou a ciclului replicativ viral; de ex.
enterovirusurile).

Exista cateva ECP patognomonice : corpii Babes-Negri incluzii


intracitoplasmatice acidofile produse de v. rabic; incluzii intranucleare “in ochi de
bufnita” caracteristice infectiei cu citomegalovirus (CMV).
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

IDENTIFICARE VIRALA

REACTIA DE SERONEUTRALIZARE (RSN)

Capacitatea anticorpilor de a neutraliza infectivitatea virusurilor este metoda


cea mai recomandata atat in identificarea virusurilor (reactia de virusneutralizare),
cat si in titrarea anticorpilor (reactia de seroneutralizare).

In reactia de virusneutralizare se folosesc dilutii de virus si se mentine


serul constant (se identifica virusul necunoscut), in timp ce in reactaia de
seroneutralizare se foloseste serul in dilutii, in timp ce virusul ramane constant (se
identifica prezenta anticorpilor protectori).

Modalitatile de recunoastere a efectului neutralizant asupra unor virusuri


depind de substratul folosit. Pe culturile de celule se constata neutralizarea
efectului citopatic.

Etapele RSN sunt:

1. TITRAREA INFECTIVITATII VIRALE

2. BLOCAREA INFECTIVITATII VIRALE

3. DEMONSTRAREA NEUTRALIZARII INFECTIVITATII VIRALE

1. TITRAREA INFECTIVITATII VIRALE

Metoda plajelor:

Aceasta metoda necesita manopere sterile si are urmatoarele etape:

Ø Inoculare dilutii zecimale suspensie virala, succesive pe placi CC

Ø Adsorbtie 30-60 min. 37 grade Celsius

Ø Indepartare inocul

Ø Adaugare mediu semisolid incolor (agar)

Ø Incubare culturi 3-5 zile


Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Ø Colorare plaje cu rosu neutru si numararea lor.

Liza celulara produsa ca ECP de unele virusuri (enterovirusuri) poate fi


focalizata daca se acopera culturile infectate cu un mediu semisolid (agar). In
monostratul celular apar zone punctiforme sau circulare de liza numite plaje.
Numararea plajelor e cea mai precisa metoda de evaluare a infectivitatii virale.
Numarul de plaje produs pe un monostrat de celule, prin inocularea unui volum
dintr-o dilutie de virus, da titrul conform ecuatiei:

Titrul = nr plaje / Vol x dil [PFU]

Titrul se exprima in unitati formatoare de plaje (plaques forming units-PFU).

Numarul de plaje obtinut pe flacoane, inoculate cu dilutii diferite, e invers


proportional cu dilutia. Relatia e corecta daca nu apar plaje confluente. Toate
flacoanele care dau plaje confluente se elimina din calcul.

2. BLOCAREA INFECTIVITATII VIRALE : consta in adaugrea la suspensia


virala de anticorpi antivirali specifici.

3. DEMONSTRAREA NEUTRALIZARII INFECTIVITATII VIRALE consta


in repetarea etapei 1 folosind dilutii zecimale ale amestecurilor antigen-anticorp.
Daca s-a folosit anticorpul antiviral specific nu va mai parea un ECP, ca urmare a
blocarii infectivitatii virale si astfel va fi identificat si virusul corespunzator
anticorpilor antivirali specifici.
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Diagnostic in viroze eruptive

Virozele eruptive care vor fi studiate sunt: rujeola, rubeola si varicela (dg.
infectiei cu virusul varicelo-zoosterian va fi studiat la dg. infectiei cu
herpesvirusuri, familia din care face parte).

1. Diagnosticul infectiei cu virusul rujeolos

Suspiciunea de infectie cu v. rujeolos este data de manifestarile clinice


caracteristice (eruptie maculo-papulara cu tendinta la confluare, triplu catar :
conjunctivita, rinoree, diaree, semnul Koplik, febra), de contextual epidemiologic
(epidemie de rujeola, persoana nevaccinata).

Produsele patologice care pot fi recoltate in vederea diagnosticului de


laborator sunt : secretii nazo-faringiene ,sange ,urina,LCR.

De prima intentie si cel mai usor de realizat este diagnosticul serologic, care
poate fi realizat pe proba unica (detectie de anticorpi anti v. rujeolos IgM, prin
ELISA de captura) sau pe proba pereche (seroconversia, respectiv cresterea
semnificatica a titrului de anticorpi de peste 4 ori titrul initial, sustin diagnosticul
de rujeola).
Detectie de anticorpi se poate face si in LCR pentru diagnosticul PESS, alaturi de
alte metode de diagnostic). Daca ac anti v. rujeolos IgM sunt prezenti in LCR si
absenti in sange, sugereaza o sinteza locala si sprijina dg. de PESS.

Izolarea virala pe culturi de celule se face in anumite contexte


epidemiologice (epidemii) sau in scop de cercetare. ECP este de tip sincitial si
incluzionar mixt.

Detectie directa consta in detectia:

ü ARN viral : RT-PCR (secventiere nucleotidica - genotipare);

ü Antigene virale in SNF (IF)- rar utilizat

2. Diagnosticul infectiei cu virusul rubeolos


Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Suspiciunea de infectie cu v. rubeolos este data de manifestarile clinice


caracteristice (eruptie maculo-papulara fara tendinta la confluare, mai pala decat
cea din rujeola, febra, adenopatie occipitala, retroauriculara, latero-cervicala), de
contextual epidemiologic (epidemie de rubeola, persoana nevaccinata, femeie
gravida – v. rubeolos este teratogen, TORCH). Exista multe forme asimptomatice
de rubeola sau cu simptomatologie frusta.

Produsele patologice care pot fi recoltate in vederea diagnosticului de laborator


sunt : SNF, sange, urina.

3. Diagnostic serologic (ser, LCR)

De prima intentie si cel mai usor de realizat este diagnosticul serologic, care poate
fi realizat pe proba unica (detectie de anticorpi anti v. rubeolos IgM, prin ELISA
de captura) sau pe proba pereche (seroconversia, respectiv cresterea semnificativa
a titrului de anticorpi de peste 4 ori titrul initial, sustin diagnosticul de rubeola).
Prezenta ac antiRubella IgM la nou-nascut sugereaza infectie congenitala.

Izolarea virala pe culturi de celule se face rar, pentru a confirma infectia in timpul
sarcinii .

Detectie directa a ARN-lui viral se face prin teste molecularea RT-PCR , de obicei
pentru dg. infectiei congenitale. In acest caz se pot folosi pentru diagnostic si alte
produse patologice: lichid amniotic, biopsie de cordon ombilical, biopsie de
placenta.

3. Diagnosticul infectiei cu virusul urlian

Oreionul (parotidita epidemica) produs de catre virusul urlian NU este o


viroza eruptiva. Se studiaza alaturi de rujeola si rubeola, avand in vedere ca aceste
viroze pot fi prevenite printr-un vaccin comun : ROR/MMR.

Infectia cu virusul urlian intereseaza in afara glandelor salivare si alte organe


: pancreas, SNC, testicule, ovare.
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Suspiciunea de infectie cu v. urlian este data de manifestarile clinice


caracteristice (parotidita uni sau bilateral, febra, faringita, orhita, meningita,
pancreatita), de contextul epidemiologic (epidemie de oreion, persoana
nevaccinata).

Produsele patologice care pot fi recoltate in vederea diagnosticului de


laborator sunt : saliva, SNF, sange, LCR, urina.

De prima intentie si cel mai usor de realizat este diagnosticul serologic, care
poate fi realizat pe proba unica (detectie de anticorpi anti v. urlian IgM, prin
ELISA de captura) sau pe proba pereche (seroconversia, respectiv cresterea
semnificativa a titrului de anticorpi de peste 4 ori titrul initial, sustin diagnosticul
de oreion).
Izolarea virala pe culturi de celule (Vero) se realizeaza rar, de obicei in scop
de cercetare.
Detectie directa a ARN-lui viral se face prin teste molecularea RT-PCR.
VIROZE ALE TRACTULUI RESPIRATOR

ETIOLOGII FRECVENTE IN VIROZE ALE TRACTULUI RESPIRATOR

Sindrom Etiologie viralã comunã Etiologie viralã rarã


Infectii de tract respirator rhinovirusuri adenovirusuri
superior coronavirusuri virusuri paragripale
adenovirusuri enterovirusuri
virusuri paragripale
Gripa virusuri gripale A, B, C
Laringotraheobronșita virus respirator sincitial (VRS) virusuri gripale
(Crup) virusuri paragripale 1 si3 adenovirusuri

Bronsiolita virus respirator sincitial (VRS) virusuri gripale


virusuri paragripale
adenovirusuri
Pneumonie virusuri gripale virusuri gripale aviare
virusuri paragripale 2 si 4 metapneumovirusuri
adenovirusuri rhinovirusuri
coronavirusurile-SARSCoV,
MERSCoV

Progresul recent în diagnosticul virozelor respiratorii acute constă în disponibilitatea comercială a unor truse
rapide, ieftine, utilizabile la patul bolnavului de către personal nespecializat. Generația recentă de truse
rapide multiplex se bazează pe teste de detectie a acizilor nucleici, însă costul lor este prohibitiv în
comparație cu trusele serologice mult mai ieftine.
Studiile clinice au validat o serie de biomarkeri cu valoare prognostică, care pot distinge intre etiologia
bacteriană si cea virală in infectiile respiratorii acute (IRA) evitând astfel administrarea inutilă de antibiotice
(de ex. baterii de teste ce includ valorile serice ale citokinelor proinflamatorii, proteinei C reactive si
procalcitoninei).
Diagnostic de laborator in infectia cu virusuri gripale

Orientarea clinica

Definitia de caz pentru gripa


Criteriile clinice de suspiciune sunt debutul brusc al simptomatologiei cu:
Cel putin unul dintre următoarele patru simptome sistemice :
• Febră sau stare subfebrilă (3-5 zile)
• Cefalee
• Mialgii
• Astenie
Și cel puțin unul din următoarele trei simptome respiratorii:
• Tuse neproductiva
• Faringita
• Dispnee

N.B.!!!! Gripa nu se diagnosticheaza clinic, ci doar prin diagnostic de laborator!! simptomatologia fiind
asemanatoare cu numeroase alte infectii determinate de: Mycoplasma pneumoniae, adenovirusuri, virusul
respirator sincitial, rhinovirusuri, virusuri paragripale si Legionella (spp), etc.

Pentru infecțiile gripale diagnosticul specific trebuie obținut în primele 48 ore de la debut, pentru că
administrarea medicamentelor antivirale este eficientă numai în acest interval. Testele recomandate sunt cele
rapide de detecție a antigenului sau testele de detecție a acizilor nucleici. Ultimele sunt cele mai specifice și
recomandabile la debutul sezonului epidemic. Evaluarea serologică este oportună numai în supravegherea
colectivităților, bazându-se pe disponibilitatea de probe perechi de ser (retrospectiv, recoltate la debut si în
convalescentă).
Pentru cazurile de imbolnavire individuala, alegerea testului de diagnostic este legata de obtinerea unui
rezultat rapid care sa orienteze decizia terapeutica; in schimb, in cazul epidemiilor gripale, testele de
diagnostic trebuie sa vizeze caracterizarea tulpinii epidemice.
Sindrom Produs patologic Diagnostic de electie
Gripa - spalatura DETECTIA DIRECTA :
nazofaringiana (SNF) • DETECTIA ACIZILOR NUCLEICI VIRALI (DE
- aspirat nazofaringian ELECTIE, mai scump)
- aspirat traheobronsic • DETECTIA ANTIGENELOR VIRALE (metoda
rapida, ieftina)
Pentru a mari sansele
de izolare, probele se - Izolarea virala este „standardul de aur”, dar are utilizare
recolteaza in clinica limitata, necesita timp indelungat (culturi de celule
/ou de gaina embrionat)
primele 72 ore de la
- Diagnosticul serologic folosit numai pentru diagnostic
debutul infectiei.
retrospectiv (necesita seruri pereche; crossreactivitati
frecvente)

1. Izolare virala.

Izolarea virala - urmata de identificarea virusului, este examenul optim pentru obtinerea de informatii privind
tulpinile de virus gripal circulante, tipul si subtipul viral putand in acest fel sa fie comparat cu tulpinile
vaccinale; este insa fastidios si necesita laborator de virusologie. Virusurile gripale pot fi izolate pe 2
substraturi vii:

• CULTURILE DE CELULE- se pot utiliza:


- culturi primare de rinichi de maimuta rhesus mentinute in mediu fara ser
- linie continua epiteliala de rinichi de caine (MDCK - Madin-Darby Canine Kidney),
adaugand in mediul de crestere o cantitate mica de tripsina.
Virusurile gripale nu sunt citopatogene. La 48 ore dupa inoculare se demonstreaza izolarea virusurilor
gripale pe culturi de celule prin hemadsorbtie, obisnuit cu eritrocite de cobai la 40C. Hemadsorbtia rezulta
din interactiunea intre membrana celulara a hematiilor si hemaglutinina virala (HA). Hematiile adsorbite
specific rozeteaza la periferia celulelor infectate. Daca rezultatul este negativ se repeta procedeul de doua ori
pe saptamana timp de 3-4 saptamani.
Izolarea virala necesita insa 4- 5 zile pana cand rezultatele sunt disponibile, ceea ce face ca utilizarea sa
clinica sa fie limitata. Totusi, celulele infectate pot fi utilizate pentru detectia antigenelor virale prin
imunofluorescenta directa (rezultatul obtinandu-se in acest caz mai rapid -18-40 de ore). Supernatantul
culturilor este testat pentru titrul hemaglutinant (unitatea hemaglutinanta - UHA) prin reactia de
hemaglutinare (RHA), demonstrandu-se in acest fel cresterea virusului in cultura, iar apoi se testeaza pentru
identificarea subtipului prin hemaglutinoinhibare (RHAI).
Este important sa se pastreze alicote de produs patologic, pentru ca in cazul unui rezultat pozitiv, acestea sa
fie trimise centrelor de referinta in vederea caracterizarii antigenice a izolatului viral. Aceasta se practica
pentru reactualizarea anuala a vaccinului antigripal prin includerea eventualelor mutante virale izolate.

• OUL DE GAINA EMBRIONAT


Unele tulpini, in special de virusuri gripale A, cresc mai bine pe ou de gaina embrionat, cu varsta embrionului
9-11 zile, inoculat intraamniotic sau intraalantoidian. Izolarea pe oul de gaina embrionat se demonstreaza prin
proprietatea virusurilor gripale de a aglutina hematiile- reactia de hemaglutinare (RHA). Prin RHA se
realizeaza de asemenea titrarea antigenului hemaglutinant inaintea reactiei de hemagutino-inhibare
(RHAI)- reactia de identificare a virusului gripal.

2. Detectia directa include evidentierea:

• acidului nucleic al virusului gripal - este diagnosticul de electie, fiind o tehnica rapida si specifica;
testul utilizat de rutina este Rt-PCR (reactia de amplificare genica precedata de reverstrancriere – in
varianta singleplex sau multiplex; real-time PCR sau alte teste de detectie a ARN viral) rapiditatea
rezultatelor putand facilita investigarea epidemiilor de infectii respiratorii. Analiza genetica a genelor
virusului gripal (in special hemaglutinina-HA si neuraminidaza-NA) poate fi utilizata pentru a
identifica un virus gripal necunoscut in momentul in care caracteristicile antigenice nu pot fi definite.

• antigenelor virale gripale- metoda de diagnostic rapida, economica


Se realizeaza prin imunofluorescenta directa pe celule epiteliale din tractul respirator. Exista lame de
microscop pe care sunt marcate patrate ce faciliteaza testarea mai multor posibili agenti virali. Rapiditatea si
corectitudinea prelucrarii probelor sunt decisive pentru reusita diagnosticului.
Recent au fost introduse si teste comerciale rapide, care detecteaza prezenta antigenelor virusurilor gripale de
tip A, dau rezultatul in aproximativ 20 minute, dar nu pot diferentia subtipurile de virus gripal.
Testele rapide de diagnostic în gripă (imunofluorescență/ reacții imunoenzimatice) au specificitatea și
sensibilitatea mai joase comparativ cu testele moleculare. De asemenea, capacitatea lor de subtipizare este
mult inferioară testelor de amplificare a acizilor nucleici. In cazul unor infecții severe, la bolnavi cu factori de
risc, si in cursul epidemiilor/pandemiilor gripale testele moleculare sunt de preferat.

2. Diagnosticul serologic:

• Nu se practica in mod curent decat in caz de epidemii, pentru diagnostic retrospectiv.


• Necesita recoltarea de probe de ser pereche de la acelasi pacient.
• Diagnosticul implica demonstrarea unei cresteri semnificative (de peste 4 ori) a titrului
anticorpilor specifici antivirali intre:
a. proba de faza acuta, recoltata la o saptamana de la debutul bolii si
b. cea din convalescenta, recoltata 2-3 saptamani mai tarziu.
Metoda preferata de evidentiere a anticorpilor antivirali specifici este hemaglutinoinhibarea.


Tabel 1. Metode de testare pentru virusul gripal

Metoda Tipul de virus Tipul de proba Durata test
gripal detectat

Cultura de celule A si B - spalatura nazofaringiana (SNF) 3-10 zile


- aspirat nazofaringian
- aspirat traheobronsic
- sputa
Cultura de celule rapida A si B - spalatura nazofaringiana (SNF) 1-3 zile
(shell vials)
- aspirat nazofaringian
- aspirat traheobronsic
- sputa
Imunofluorescenta A si B - spalatura nazofaringiana (SNF)
- aspirat nazofaringian
1- 4 ore
- aspirat traheobronsic

RT-PCR (singleplex si A si B - spalatura nazofaringiana (SNF) Variabil


multiplex; real-time PCR (in general 1-6 ore)
- aspirat nazofaringian
sau alte teste de detectie a
ARN viral) - aspirat traheobronsic
- sputa
Testele rapide de A si B - spalatura nazofaringiana (SNF) < 30 minute
diagnostic - aspirat nazofaringian
Diagnostic de laborator in alte viroze respiratorii

Sindrom Etiologie virala Produs patologic Diagnostic virusologic


comuna Izolare Detectie directa Detectie
indirecta
(Serologie)
Infectii de -rhinovirusuri -spalatura
tract -coronavirusuri nazofaringiana
respirator -adenovirusuri
De electie pentru Imunofluorescenta Necesita seruri
superior -virusuri paragripale
adenovirusuri (linii directa- optim pereche;
celulare de tip Hep-2 pentru VRS si
Crup -virusul respirator -aspirat
sau HeLa) virusuri Numai pentru
sincitial (VRS) nazofaringian
paragripale diagnostic
-virusuri sau retrospectiv;
paragripale traheobronsic
Bronsiolita -virusul respirator -aspirat Detectia acizilor Crossreactivitati
sincitial (VRS) nazofaringian nucleici virali- frecvente

sau de electie pentru


coronavirusuri
traheobronsic
-lavaj bronho-
alveolar


Virusul respirator sincitial (VRS)

In prezent, sunt disponibile mai multe tipuri de teste de laborator pentru diagnosticarea
infecției cu virusul respirator sincitial (VRS).

1. Izolarea virala se realizeaza pe:


- culturi de celule, VRS determinand un efect citopatic caracteristic de tip sincitial
- are o sensibilitate redusa, datorita termolabilitatii VRS

1. Detectia directa include evidentierea:


• Antigenelor virale prin reactia de imunofluorescenta directa (DFA)- metoda de
diagnostic rapida, economica
Comparativ cu izolarea pe culturi de celule, sensibilitatea testele de detectie a antigenului
viral variaza intre 80% si 90%. Totusi, metodele de detectie a antigenului viral sunt sigure la
copiii mici, dar mai putin utile la copii mari si adulti.
• Acidului nucleic viral prin reactia RT-PCR- metoda cea mai sensibila si specifica
pentru detectia VRS
Utilizarea testelor moleculare RT-PCR ar trebui luata in considerare in mod particular in cazul
testarii copiilor mari si adultilor, datorita faptului ca acestia prezinta incarcari virale reduse in
probele patologice respiratorii.

2. Detectia indirecta:
• testele serologice sunt mai putin utilizate pentru diagnosticul de rutina al VRS
• utila pentru studii epidemiologice si in scop de cercetare

Virusurile paragripale

1. Izolarea virala se realizeaza pe:


- culturi de celule renale de maimuta sau pe embrion uman
- cresc mai lent decit virusurile gripale
- nu sunt citopatogene
- izolarea lor in culturi se diagnosticheaza prin hemadsorbtie.

2. Detectia directa include evidentierea:


• Antigenelor virale prin reactia de imunofluorescenta directa- metoda de diagnostic
rapida, economica

• Acidului nucleic viral prin reactia RT-PCR- poate fi utilizata pentru identificarea
virusurilor paragripale 1, 2 si 3

3. Detectia indirecta:
- implica evidentierea cresterii de 4 ori sau mai mult a titrului de anticorpi in probele
de ser din faza de convalescenta a bolii in comparatie cu faza acuta
- util doar pentru diagnostic retrospectiv
INFECȚII VIRALE ALE TRACTULUI RESPIRATOR INFERIOR

Diagnosticul de laborator al agenților virali implicați în pneumonii

Sindrom Etiologie virala Produs Diagnostic virusologic


comuna patologic Izolare Detectie directa Detectie
indirecta
(Serologie)
Pneumonie -virusuri gripale -aspirat Culturi de
traheobronsic/ celule -Imunofluorescenta
-virusuri bronhoalveolar directa Nu este
paragripale -spalatura recomandata
nazofaringiana
-adenovirusuri -Detectia acizilor
nucleici virali (de
-coronavirusurile electiei pentru
SARSCoV, coronavirusuri)
MERSCoV
Transportul se va realiza:
- în containere speciale pe gheață
- rapid, în interval de cateva ore
- produsele patologice nu trebuie înghețate

Recomandări exprese ce trebuie respectate în cazul unor pneumonii:


- Prima spută de dimineață conduce cel mai frecvent la izolarea agentului etiologic
- Spălăturile bronho-alveolare recolatate cu lichide care conțin calciu alterează testele
moleculare
- Rezultatele negative impun investigații suplimentare cu alte metode
Rezultatele vor fi obținute cu maximă rapiditate în cazul:
- pneumoniilor asociate cu spitalizarea (la vîrstele extreme)
- pneumoniilor asociate cu procedee de ventilație asistată
- pneumoniilor asociate cu situații epidemice în comunitate.
Sensibilitatea metodelor de diagnostic este mai mică în cazul pacienților aviremici sau cu
viremie joasa (50-60%) comparativ cu cei cu viremie inalta (peste 80%). Frecvent la copii se
pot obține rezultate fals pozitive la debut, care vor trebui confirmate ulterior, în evoluție.

Diagnosticul infectiei cu MERSCoV (Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus)

Definitie de caz
Caz probabil
Definiția 1.
1. Febra si pneumonie sau sindrom de detresă respiratorie acută (clinic sau radiologic)
Si
Persoana a calatorit in tari din/langa Peninsula Arabica in decurs de 14 zile de la debutul
simptomatologiei sau a avut un contact direct cu un pacient simptomatic ce a dezvoltat febra
si boala respiratorie acuta in decurs de 14 zile dupa calatoria in tari din/langa Peninsula
Arabica
sau
Persoana face parte dintr-un grup de pacienti cu boala respiratorie severa (ex: febra si
pneumonie ce necesita spitalizare) de etiologie necunoscuta, infectia cu MERS-CoV fiind in
evaluare

Definiția 2
Febra si simptomatologie de boala respiratorie (nu neaparat pneumonie)
Si
Pacientul a fost intr-un spital dintr-o tara din/langa Peninsula Arabica unde au fost identificate
cazuri de MERS, in decurs de 14 zile inainte de debutul simptomatologiei

Definiția 3
Febra si simptomatologie de boala respiratorie (nu neaparat pneumonie)
Si
Pacientul a avut un contact direct cu un caz confirmat de MERS.

Caz confirmat
O persoană cu confirmare de laborator a infecției MERS-CoV: un rezultat pozitiv pentru
detectia acidului nucleic viral prin rRT-PCR pe cel puțin două ținte genomice specifice
Sau
pe o singură țintă pozitivă cu secvențierea unei a doua ținte.

Pacientii cu boala respiratorie acuta severa (ex.: febra si pneumonie), dar fara legaturi
epidemiologice cu un caz de infectiei MERS-CoV sau cu indivizi ce au calatorit in/langa
Peninsula Arabica, ar trebui evaluati pentru patogeni respiratori obisnuiti; in cazul in care
etiologia ramane necunoscuta, ar trebui luata in considerare testarea pentru MERS-CoV.

Diagnostic de laborator
• Detectia directa
Diagnosticul de rutina al infectiei cu MERSCoV se bazeaza pe detectia acidului nucleic viral
prin rRT-PCR (real-time reverse-transcription polymerase chain reaction).
Pentru testarea infectiei cu MERS-CoV prin rRT-PCR este recomandata colectarea tuturor
celor 3 tipuri de probe patologice- proba respiratorie inferioara, proba respiratorie superioara
si ser. Probele respiratorii ar trebui colectate cat mai rapid posibil- optim in decurs de 7 zile
de la debutul simptomatologiei. Totusi, daca a trecut mai mult de o saptamana de la debut si
pacientul este inca simptomatic, probele respiratorii ar trebui colectate, in special probe
respiratorii inferioare, deoarece virusurile respiratorii pot fi inca detectate prin rRT-PCR.

• Izolarea virala
In anumite circumstante, dar nu ca diagnostic de rutina, laboratoarele cu experienta adecvata
pot incerca izolarea virusului pe culturi de celule.

• Detectia indirecta (serologia)


Pentru detectia anticorpilor sunt necesare doua probe de ser pereche, dar si o o proba de ser
unica poate fi valoroasa pentru identificarea cazurilor probabile. Probele de ser pereche ar
trebui optim recoltate la interval de 14- 21 de zile, prima proba fiind recoltata in prima
saptamana de la debutul simptomatologiei.
Testarea serologica a infectiei cu MERS-CoV nu se realizeaza in scop diagnostic, ci doar in
scop de cercetare/studii epidemiologice.
Diagnosticul infectiei cu SARS-CoV (Sindrom respirator acut sever)

Criterii clinice
1. Febra ≥38ºC sau istoric de febra

si

2. Cel puţin unul din următoarele trei simptome:

o Tuse
o Dificultăţi respiratorii
o Scurtarea respiraţiilor
si

3. Evidenţe radiografice de pneumonie sau de sindrom de detresă respiratorie acută sau dovezi
de pneumonie la autopsie sau dovezi ale sindromului de detresă respiratorie acută la autopsie
si

4. Nicio alta alternativă de diagnostic care poate explica complet boala

Produse patologice

Produsele patologice recomandate sunt reprezentate de: probe respiratorii superioare (ex.:
spalatura nazofaringiana), probe respiratorii inferioare (ex.: sputa), sange (ser si plasma) si
materii fecale. SARS-CoV este stabil in mediu inconjurator si poate ramane viabil pana la 2-3
zile pe suprafetele uscate. Este viabil in probele de materii fecale pana la 4 zile, iar in
secretiile respiratorii mai mult de 7 zile.

Criterii de laborator definitorii pentru infectia cu SARS-CoV

1. Izolare virala in culturi de celule pentru SARS-CoV din orice proba patologica, cu
confirmare PCR utilizand o metoda validata. Izolarea in culturi de celule nu este utilizata in
scop diagnostic, datorita riscului de infectare si sensibilitatii reduse comparativ cu tehnica
PCR.

2. Rezultat pozitiv la un test validat de detectiei a acizilor nucleici specific pentru SARS Co-V
(testul de electie)

• Pe cel putin 2 probe patologice diferite (ex.: exsudat nasofaringean sau materii fecale)

Sau
• Pe aceeaşi proba patologica recoltata la 2 sau mai multe zile in cursul evolutiei bolii
(ex. exudate nazofaringeane repetate)
Sau
• 2 testari diferite sau repetarea unui test de detectie a acizilor nucleici utilizand un nou
extras ARN din proba patologica originala la fiecare testare

3. Seroconversia sau o crestere de minim 4 ori a titrului de anticorpi specifici SARS-CoV, în


serul din faza acută şi de convalescenţă, testate în paralel prin neutralizare, ELISA (enzyme-
linked immunosorbent assay) sau imunofluorescenta (IFA).
Detectia anticorpilor specifici SARS-CoV prin ELISA sau imunofluorescenta ar trebui
confirmata prin neutralizare pentru a exclude crossreactivitatile serologice cu alte
coronavirusuri circulante

Probele ce contin SARS coronavirus viabil trebuie manipulate in laboratoare cu nivel de


biosecuritate 3 (BSL3). Produsele patologice ce contin virus inactivat pot fi manipulate in
laboratoare BSL-2

Sindromul pulmonar cu Hantavirus – a fost descris in 1993 cand s-a produs o epidemie
majora in Sud Vestul Statelor Unite; reprezentantul este virusul Sin Nombre, care se transmite
prin aerosoli de la rozatoare.

Criterii clinice:
• Boala febrila caracterizata prin infiltrate interstitiale bilaterale si insuficienta
respiratorie
• Debutul este cu prodrom respirator - febra, frison, mialgii, cefalee
si/sau gastrointestinal cu hemoconcentrare
• Leucocitoza cu neutrofilie si trombocitopenie; devierea la stanga a formulei
leucocitare

Criterii de laborator:
¨ detectia anticorpilor antivirali specifici de tip IgM antivirali sau cresterea titrului IgG pe
probe pereche de ser
¨ detectia ARN-ului hantavirusului prin amplificare genica
¨ demonstrarea prezentei antigenului hantaviral prin imunohistochimie.

Bibliografie

1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Clinical Description & Lab
Diagnosis of Influenza. http://www.cdc.gov/flu/professionals/diagnosis/index.htm
2. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Guidance for Clinicians on the
Use of Rapid Influenza Diagnostic Tests
http://www.cdc.gov/flu/professionals/diagnosis/clinician_guidance_ridt.htm
3. H. Keipp Talbot and Ann R. Falsey. The Diagnosis of Viral Respiratory Disease in
Older Adults. Clin Infect Dis. 2010 March 1; 50(5): 747–751. doi:10.1086/650486.
4. Therese Popow-Kraupp and Judith H. Aberle. Diagnosis of Respiratory Syncytial
Virus Infection. The Open Microbiology Journal, 2011, 5, (Suppl 2-M2) 128-134
5. WHO Interim recommendations (revised). Laboratory Testing for Middle East
Respiratory Syndrome Coronavirus,September 2014
http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/WHO_interim_recommendatio
ns_lab_detection_MERSCoV_092014.pdf
6. WHO. Case definitions for the four diseases requiring notification in all circumstances
under the International Health Regulations (2005)
)www.who.int/ihr/Case_Definitions.pdf
7. WHO biosafety guidelines for handling of SARS specimens, 25 April 2003.
8. Cheng VC, Lau SK, Woo PC, Yuen KY. Severe acute respiratory syndrome
coronavirus as an agent of emerging and reemerging infection. Clinical microbiology
reviews. 2007 Oct; 20(4):660-94.
DIAGNOSTIC IN INFECTIA CU HERPESVIRUSURI UMANE

In functie de tropismul celular si sediul latentei, precum si datorita unor particularitati fizico-chimice,
herpesvirusurile umane se impart in 3 subfamilii:

1. Alfaherpesvirinae reprezentate prin HSV1, HSV2 si VZV (virusul varicelo-zosterian), avand


sediul latentei in neuronii senzitivi din rãdãcina posterioarã a nervilor spinali şi nucleii
senzitivi ai nervilor cranieni.
2. Betaherpesvirinae reprezentate prin citomegalovirus (CMV), HHV (human herpes virus)-6 si
HHV-7, cu sediul latentei in limfocitul T, monocite, organe solide (plamâni, rinichi) +/-
epiteliul glandelor salivare.
3. Gammaherpesvirinae reprezentate prin EBV (Epstein-Barr virus), HHV-4 si HHV-8 sau virusul
asociat sarcomului Kaposi, cu sediul latentei in limfocitul B, endoteliu capilar.

HERPES SIMPLEX (HSV1, HSV2)

Importanta in virusologie:

-dincolo de infectia primara, prezinta latenta pe toata durata vietii si se pot reactiva de un numar
nelimitat de ori

- pot produce in cadrul infectiei primare sau prin reactivare encefalite si retinite herpetice, infectii
neonatale, infectii severe la pacientii imunodeprimati

Manifestari clinice:

Primoinfectia HSV1 este de regula asimptomatica. Perioada de incubatie a virusului este scurta (de
doua pana la 12 zile, in medie 4 zile). Atunci cand exista simptomatologia se poate prezenta sub
forma gingivo-stomatitelor (mai ales la copii), faringite, leziuni cutanate veziculare „in buchet”,
uneori ulcerate, adenopatii cervicale, uneori febra si tulburari de deglutitie. La copil simptomatologia
poate persista pana la 2 saptamani.

Reactivarile virusului HSV1 sunt insotite de regula de un oarecare prodrom, cu senzatie de arsura sau
prurit ce pot preceda aparitia leziunilor veziculare „in buchet”, care apar la nivelul buzelor si persista
in medie 48-72 de ore.

Primo-infectia HSV2 este simptomatica in doar o treime din cazuri si se manifesta prin prezenta de
leziuni veziculare in buchet initial, urmate ulterior de pustule sau ulceratii. Rareori pot aoarea
complicatii precum febra, disurie, adenopatii inghinale, meningite. Simptomatologia in infectia
primara HSV2 poate persista pana la 2-3 saptamani.

Reactivarile in infectia cu HSV2 se insotesc de manifestari clinice ceva mai discrete decat in infectia
primara (iritatie sau chiar vezicule, leziuni simple cervicale) cu durata mai scurta de pana la 7 zile.

Majoritatea infectiilor oculare cu herpes simplex, cu exceptia celor neo-natale, se datoreaza HSV-1.
Primo-infectia se caracterizeaza prin kerato-conjunctivita, leziunea specifica sau „leziunea dendritica”
putand fi evaluata in cursul unui examen oftalmologic cu fluoresceina. Aceasta leziune tipica se
caracterizeaza prin prezenta descuamarii celulelor infectate de la nivelul corneei. Leziunea oculara
propriu-zisa se poate insoti de adenopatie preauriculara, fotofobie, lacrimare. Durata de vindecare a
corneei este de pana la 1 luna, iar reactivarile sunt de regula frecvente si pot afecta unul sau ambii
ochi.

Infectiile neonatale se produc in momentul nasterii prin filiera pelvi-genitala, prin contactul direct al
nou-nascutului cu particulele virale prezente in sfera genitala a mamei. Infectiile in utero sunt
absolut exceptionale. Majoritatea cazurilor de infectii neo-natale apar in cazul femeilor insarcinate cu
infectie HSV2 asimptomatica. Riscul reactivarii HSV2 la fat este relativ redus pentru ca in mod
obisnuit anticorpii anti HSV2 de tip IgG traverseaza bariera placentara si confera astfel protectie nou-
nascutului. In acelasi sens, alaptarea poate proteja. Infectia neonatala cu HSV2 se poate prezenta sub
3 forme:

- Infectie diseminata – pe cale hematogena si se manifesta inca din primele zile de viata
interesand in mod deosebit ficatul – hepatita fulminata, suprarenalele si encefalul
- Encefalita neonatala ce se manifesta din a treia saptamana de viata
- Infectie localizata la nivelul mucoasei bucale sau oculare

PRODUSUL PATOLOGIC DE ELECTIE ESTE REPREZENTAT DE LICHIDUL VEZICULAR.

Directiile de diagnostic:

Diagnostic direct:

- Izolare virala in cultura – celulele cel mai des utilizate – celule de tip Vero sau celule diploide
umane; izolarea este rapida si facila, efectul citopatic aparand de 48 de ore pana la cateva
zile, in functie de titrul infectios; efectul citopatic remarcat este de tip mixt: sincitial si
incluzionar (corpi Cowdry tip A)
- Reactia de imunofluorescenta (IF) – TESTUL OPTIM DE DIAGNOSTIC – permite detectarea
antigenelor virale. Aceasta reactie are la baza principiul antigen-anticorp. Tehnica realizarii
reactiei de imuno-fluorescenta DIRECTA presupune urmatoarele etape:
o Amprentarea produsului patologic (care poate contine antigenele virale de interes)
pe o lama si uscarea acestuia pentru o perioada de 5-10 minute
o Ulterior, fixarea cu acetona pentru alte 10 minute
o Spalare
o Adaugarea de anticorpi marcati cu fluoresceina sau rhodamina
o Incubare 1 ora la 37 de grade sau peste noapte la 4*C
o Spalare prentru indepartarea excesului de anticorpi marcati
o Citire la microscop in lumina ultravioleta
NB: IF INDIRECTA presupune adaugarea initial a anticorpilor nemarcati, incubare o ora la 37 de
grade sau la 4 grade peste noapte, spalare pentru indepartarea excesului de anticorpi, adaugarea
anticorpilor anti-anticorpi umani marcati (proveniti de la animalul de laborator), spalare pentru
indepartarea excesului de anticorpi marcati si citire la microscop in lumina ultravioleta.

- PCR in vederea identificarii acidului nucleic viral (ADN) – indicat in encefalitele herpetice,
retinite sau in cazul unor leziuni atipice si in cazul pacientilor aflati in tratament antiviral.

Diagnosticul indirect:

- Detectarea anticorpilor de tip IgM si IgG cu teste de tip ELISA, in dinamica cu teste pereche
(unul in momentul primei evaluari a pacientului si unul la 7-10 zile) pentru orientarea cu
privire la o infectie primara. In afara primo-infectiei serologia nu poate fi interpretata.
- Acest tip de diagnostic NU POATE FI UTILIZAT SINGUR PENTRU CONFIRMAREA INFECTIEI ci
trebuie asociat cu un test de diagnostic direct

VIRUSUL VARICELO-ZOSTERIAN (VZV)


Se transmite pe cale aeriana. Primo-infectia corespunde varicelei, o boala caracterizata printr-o
eruptie veziculara generalizata intalnita preponderent in randul copiilor. Secundar primo-infectiei,
virusul ramane latent pentru tot restul vietii putandu-se reactiva de un numar nelimitat de ori in
conditii de imunosupresie. Reactivarile simptomatice afecteaza aproximativ 15% din pacientii ce
prezinta infectie cu virus latent si se manifesta printr-o eruptie veziculara localizata, dureroasa, ce
urmareste de regula un dermatom – zona Zoster.

Diagnosticul de laborator se bazeaza pe identificarea virusului din leziunile cutanate sau, in


encefalite, din LCR prin aceleasi metode ca si in cazul HSV.Testul optim de diagnostic este
imunofluorescenta directa sau identificarea acidului nucleic prin PCR in LCR. Serologia, identificarea
anticorpilor de tip IgM sau IgG este utila in infectia acuta, insa, nu serveste pentru confirmarea
diagnosticului decat atunci cand se asociaza cu un test de diagnostic direct.

Primoinfectie VZV Reactivare VZV


Diagnostic Varicela Zona Zoster
Eruptie Generalizata Localizata
Frecventa >90% >20%
Varsta < 15 ani >50 ani
Risc pentru aparitia Imunodeprimati Imunodeprimati
complicatiilor Adulti Varstnici
Sarcina

CITOMEGALOVIRUSUL

Infectia cu citomegalovirus este raspandita la nivel mondial, seroprevalenta fiind cu atat mai ridicata
cu cat statutul socio-economic este mai redus. Dupa o primo-infectie, la fel ca celelalte virusuri din
familia herpesviridae, citomegalovirusul ramane latent si poate determina infectii secundare prin
reactivare sau prin infectarea cu o noua susa. Consecintele infectiei cu citomegalovirus uman
depinde in mod direct de imunitatea gazdei. In majoritatea situatiilor infectia CMV este
asimptomatica la adultul imunocompetent, dar poate produce leziuni viscerale severe la pacientii
imunodeprimati sau la fat si nou nascut, secundar transmiterii in utero.

Diagnosticul de laborator

Produse patologice: PBMC (peripheral blood mononuclear cells),saliva, urina, sange, secretie
lacrimala, biopsie tisulara, LCR, lichid amniotic, sange din cordonul ombilical. In teorie in infectia
primara, produsul patologic poate fi reprezentat aproape de orice tip de fluid biologic si in egala
masura de biopsii tisulare (ficat, segmente arteriale, placenta, ganglioni limfatici).

Diagnostic direct:

- Izolare virala in cultura – se inoculeaza virusul pe culturi de fibroblaste embrionare umane.


In mod obisnuit efectul citopatic de tip incluzionar (incluziuni intranucleare – ”ochi de
bufnita”) se poate observa intre 8 si 20 de zile, insa uneori poate fi necesara o perioada de
pana la 6 saptamani pentru observarea efectului citopatic. Din acest motiv s-a dezvoltat
tehnica rapida de izolare in cultura – shell vials – care presupune centrifugarea produsului
patologic pe o cultura de fibroblaste in monostrat, intr-un flacon vertical, pentru facilitarea
patrunderii virusului in interiorul celulei si ulterior, detectarea antigenelor foarte precoce,
care sunt sintetizate in cursul primului ciclu de replicare virala, prin imunohistochimie dupa
numai 24-48 de ore de incubare.
- Detectarea antigenelor virale (de ex pp65) prin imunofluorescenta directa din fractia
limfocitara
- PCR – identificarea ADN viral din leucocite, sange circulant, plasma, ser, biopsie tisulara sau
LCR; tehnica destinata in mod deosebit manifestarilor neurologice

Diagnosticul indirect consta in identificarea anticorpilor de tip IgM si IgG cu teste de tip ELISA.
Diagnosticul serologic se utilizeaza in screeningul TORCH la gravide. In conditiile prezentei
anticorpilor antiCMV se recomanda efectuarea testelor de aviditate. Definita ca intensitatea cu care
anticorpii de tip IgG se leaga de antigen, aviditatea IgG creste progresiv in timp dupa infectia primara.
Astfel, cu cat infectia este mai recenta cu atat indicele de aviditate este mai redus. Masurarea
aviditatii anticorpilor CMV-IgG s-a dovedit a fi un test important pentru diferentierea infectiei CMV
primare de cea secundara, prin aceea ca aviditatea joasa se asociaza cu infectia primara recenta. Pe
de alta parte, obtinerea unei aviditati crescute la o gravida in primul trimestru de sarcina exclude
posibilitatea ca infectia sa fi fost contractata dupa conceptie

Indexul de aviditate reprezinta raportul dintre cantitatea de anticorpi cu aviditate crescută şi


cantitatea anticorpilor specifici totali.

In urma screeningului infectiei CMV la gravida putem identifica una din urmatoarele 4 situatii:

1. IgM -/IgG- nu exista contact cu virusul, ceea ce inseamna ca pacienta este vulnerabila
si s-ar putea infecta. In aceasta situatie se recomana profilaxia infectiei primare (atentie
la contactul cu copilul mic care reprezinta principalul rezervor de infectie CMV) si
repetarea testarii trimestrial in cursul sarcinii.
2. IgM-/IgG+ absenta unei infectii recente. Se recomanda monitorizarea cu un nou test, in
dinamica, la 2-4 saptamani.
3. IgM+/IgG+ necesita teste de aviditate. Daca aviditatea este crescuta nu se va lua in
considerare infectia recenta. Se recomanda monitorizarea cu un nou test, in dinamica, la
2-4 saptamani. Daca aviditatea este scazuta se recomanda un al doilea test de
identificare al anticorpilor dupa 2 saptamani. Daca al doilea test detecteaza o crestere de
cel putin 4 ori a titrului de anticorpi in raport cu prima testare pacienta prezinta o
reactivare a infectiei CMV.
4. IgM+/IgG- probabil infectie recenta; necesita o noua testare la 2-4 saptamani. Daca IgG+
la a doua testare sau IgM de 4x mai mult decat la prima testare se stabileste diagnosticul
de infectie recenta si, in functie de trimestrul de sarcina se fac recomandari specifice
(trimestrul I-II – biopsie de vilozitati coriale, amniocenteza sau intrerupere de sarcina in
functie de un set complex de investigatii biologice si imagistice, trimestrul III –
monitorizare, biopsie de vilozitati coriale sau amniocenteza).

VIRUSUL EPSTEIN BARR (EBV) este asociat cu mononucleoza infectioasa sau boala sarutului la adultul
imunocompetent precum si cu o serie de proliferari maligme ca limfomul Burkitt, proliferari epiteliale
precum carcinomul nediferentiat de nazofaringe. La pacientii imunodeprimati EBV poate fi asociat cu
o serie de patologii precum mononucleoza infectioasa acuta fatala, limfoame maligne non hodgkin,
limfoproliferari si leucoplasia cu celule paroase a limbii.

Diagnosticul infectiei cu EBV poate fi direct prin evidentierea acidului nucleic viral (PCR din biopsie
tisulara sau sange integral) sau a antigenelor virale si indirect prin identificarea de anticorpi specifici.
Diagnosticul serologic detecteaza anticorpi impotriva proteinelor de capsida de tip VCA, EA (anticorpi
anticapsidari IgM) si proteinelor nucleare EBNA (anticorpi antinucleari), permitand diferentierea unei
infectii primare de o infectie veche sau reactivare virala. Metodele de izolare virala bazate pe
imortalizarea si transformarea limfocitelor B de catre EBV in cultura sunt de durata si nu sunt utilizate
in practica de zi cu zi.
DIAGNOSTICUL IN INFECTIILE VIRALE ALE
SISTEMULUI NERVOS CENTRAL (NEUROVIROZE)

In functie de nivelul la care are loc afectarea sistemului nervos central (meninge, encefal,
maduva spinarii) pot fi descrise mai multe sindroame clinice (meningite, encefalite,
meningoencefalite, mielite, encefalomielite). Majoritatea meningitelor aseptice, cu lichid clar
și multe encefalite sunt de etiologie viralã. Excluzând complicațiile meningo- encefalitice
frecvente în rujeolã, oreion, varicelã, (semnele clinice caracteristice afecțiunii de bazã
orienteazã diagnosticul etiologic), precum și cazurile rare determinate de virusuri exotice
(virusul coriomeningitei limfocitare - arenavirus transmis de la rozãtoare) etiologia cea mai
frecvent incriminatã este rezumată în tabelul următor.

Sindrom Etiologie posibila Produs patologic Izolare Detectie directa Serologie


Meningita  Enterovirusuri LCR, materii De Rt-PCR (metode Nu
aseptica (ECHO, fecale, SNF, urina electie multiplex pentru
Coxackie A, pentru enterovirusuri)
B) enterovir
 v. Urlian usuri In suspiciunea de
 Arbovirusuri etiologie herpetica
(v. PCR pt ADN HSV,
West Nile) VZV sau IF

 rar: v. CML,
VZV, HSV,
CMV,
paragripale
Encefalita  Herpesvirusuri biopsie cerebrala Da PCR sau Rt-PCR De electie
acuta (HSV 1 si 2, (pentru HSV si pentru
Meningo- VZV, EBV, rabic) arbovirusuri
encefalita, CMV) singe si LCR
Encefalo-  Arbovirusuri (pentru Arbo)
mielita (Toga si Flavi) saliva, amprente
 V. rabic dermice ,
 Postinfectioas corneene (pentru
e: rabic)
VZV, v.rujeolos,
v. urlian, v.
gripale
Leuco- Papovavirusul JC Biopsie cerebrala, PCR
encefalopatia LCR
progresiva
multifocala

Produse patologice
Produsele patologice recolate difera in functie de agentul etiologic suspicionat pe baza
datelor clinice, epidemiologice si imagistice (este cunoscuta predilectia HSV 1 si 2 pentru
aparitia de modificari imagistice la nivelul lobului temporal).
Lichidul cefalorahidian (LCR) este un produs patologic bun pentru diagnostic in
meningite, cu toate ca in lipsa unui infiltrat inflamator important, celularitatea redusa nu sustine
replicarea virala. Se obtine prin efectuarea punctiei lombare sau suboccipitale.
Câteva recomandări specifice privind recoltarea LCR:
- Volumul colectat trebuie să fie suficient pentru determinări multiple sau repetate,
- Volumul minin recoltat este de 0,5 ml, volume mai mari cresc șansa de izolare,
- După puncție se recoltează mai multe tuburi cu LCR, primul se va utiliza pentru
determinări biochimice, iar celelalte sunt procesate virusologic.
- Pentru meningitele cu lichid clar se recomandă recoltări secvențiale,
- LCR colectat nu se îngheață,
- Clinicianul trebuie să furnizeze informații privind agentul suspicionat.
Materiile fecale sunt utile pentru pentru enterovirusuri, iar aspiratul nazofaringian in
primele 2 -3 zile de boala ofera sanse bune de cultivare atit in cazul virusului urlian, cit si in cel
al enterovirusurilor. Enterovirusurile se gasesc 1-2 saptamani in tract respirator, 4-6 saptamani
in marteriile fecale, cateva zile in lichid cefalorahidian si perioade variabile in inima, lichid
pericardic, ficat. De aceea in boli in care se suspecteaza etiologia enterovirala este recomandat
sa se obtina probe multiple dintre cele mentionate mai sus. Totusi datorita frecventei mari a
excretiei de enterovirusuri la persoane sanatoase, cu infectii asimptomatice semnificatia
diagnostica cea mai mare intr-o meningita o are un izolat din LCR. Este important de precizat
ca in cazul encefalitei herpetice, a poliomielitei sau poliradiculonevritelor, LCR nu este o sursa
potrivita pentru izolare virala.
Biopsia cerebrala este produsul patologic optim in encefalite pentru izolarea virusului
herpes simplex I, cu conditia transportarii intr-un mediu adecvat sau a inghetarii rapide la -70
C.
Urina este potrivita pentru virusul citomegalic si pentru arenavirusuri de tipul LCM.
Singele si LCR sunt produsele patologice cele mai bune in encefalitele arbovirale.
Multiple produse patologice pot fi utilizate pentru diagnosticul rabiei umane: saliva,
amprente dermice, amprente corneene si tesut cerebral recoltat la autopsie. Mai frecvent insa se
recolteaza intreaga carcasa cerebrala de la: mamifere suspecte de turbarare pentru care este
documentata muscatura, zgarietura sau alta posibila expunere umana sau de la animale
domestice aflate sub ingrijirea unui veterinar la care se testeaza rabia in cadrul diagnosticului
diferential al unei afectiuni neurologice. Organele animalelor rabigene se preleveaza aseptic, se
taie în fragmente de 1-2 mm3 care se îngheatä pe zapada carbonica. Ulterior, se taie la microtom
sectiuni de 0,004 mm, se fixeaza cu acetona 10 minute si se coloreaza. Nu se accepta animale vii
in laborator.

1. Meningita virala

Meningitele virale reprezinta inflamatia leptomeningelui ca o consecinta a infectiei


virale. Etiologia meningitelor este cel mai frecvent reprezentata de virusuri, iar dintre acestea,
in Romania, enterovirusurile constituie agentul etiologic in 80-90% din cazuri. Restul de 10-
20% din cazuri sunt determinate de herpesvirusuri, arbovirusuri, virusul urlian, virusuri gripale
si paragripale, virusul rujeolos, virus rubeolos, virusul coriomeningitei limfocitare, HIV.
Pentru orientarea diagnosticului etiologic sunt extrem de importante datele
epidemiologice. Meningitele virale determinate de enterovirusuri au uneori incidențã epidemicã
si afecteaza in special copii. La fel, arbovirusurile (in Romania, virusul West-Nile) care necesita
transmitere vectoriala au o incidenta corelata cu lunile si arealul de activitate al vectorului.
Manifestarile clinice in meningite sunt reprezentate de febra (in general peste 38,5 grade
Celsius), cefalee intensa, varsaturi “in jet”, fotofobie, somnolenta, greata, iritabilitate (in special
la copii). Extrem de importanta pentru suspiciunea clinica de meningita este redoarea de ceafa,
prezenta in special la adulti, la copii mici aceasta fiind dificil de obiectivat. Astfel, pentru sugari
bombarea fontanelei, iritabilitatea si bradicardia in prezenta febrei constituie semne sugestive
pentru afectarea meningeala.
Manifestarile clinice de meningita sunt comune diverselor etiologii astfel incat stabilirea
agentului cauzal necesita de cele mai multe ori diagnostic de laborator prin recoltare de produse
de la pacient.

2. Encefalita virala

Encefalita virala reprezinta o infectie neurologica severa cu morbiditate si mortalitate


importante cu afectarea sistemului nervos central la nivelul encefalului. Cel mai frecvent
implicate in etiologia encefalitelor virale sunt herpesvirusurile (in special HSV 1 si 2),
arbovirusurile (in Romania, virusul West-Nile si mai rar virusul encefalitei de capusa),
enterovirusurile, virusurile gripale, virusul rabic, virusul rujeolos, virusul rubeolos,
adenovirusuri, HIV.
Encefalitele determinate de arbovirusuri sunt limitate ca distribuție la nisa ecologica a
insectei vectoare. Omul este o gazdã incidentala pe parcursul ciclului natural al unor infectii
arbovirale care pot afecta și mamifere sãlbatice sau domestice. Pe teritoriul României au fost
izolate virusul west Nile (transmis de țânțari din specia Culex pipiens,) care a determinat o
epidemie de meningoencefalita in 1996 si virusurile encefalitei transmise de cãpușe (în zonele
împădurite).
Encefalita herpeticã este determinatã de tipul HSV1 la adulti,de obicei in reactivarile
infectiei latente si de HSV2 la nou nascut, prin transmitere materno-fetala. Prezența leziunilor
herpetice genitale la gravidele la termen impune operația cezariană.
Manifestarile clinice in encefalite constau in alterarea statusului mental care poate fi
usoara cu somnolenta, scaderea capacitatii de concentrare, obnubilare sau poate avea
manifestari severe cu dezorientare temporo-spatiala, modificarea comportamentului, letargie,
ajungand in unele cazuri pana la coma. Pacientii pot prezenta de asemenea febra, convulsii,
manifestari neurologice de focar. In encefalite mult mai frecvent decat in meningite se pot
identifica modificari sugestive ale afectarii cerebrale la examene imagistice de tip CT/RMN.
Diagnosticul etiologic necesita recoltare de produse patologice de la pacient si
diagnostic de laborator.
Encefalomielitele postinfecțioase sau postvaccinale sunt complicații demielinizante cu
mortalitate mare sau cu leziuni sechelare ireductibile. Mai multe alternative patogenice inclusiv
reacțiile autoimune pot fi luate in discutie.
Douã entitãți clinice apãrute la distanțã de infecții virale acute au atras atenția
neurologilor: sindromul postviral de obosealã cronicã și sindromul post-poliomielitic cu
astenie, fasciculații musculare, durere muscularã.

Diagnostic de laborator in infectii cu enterovirusuri

Agent etiologic Sindrom Produs patologic Diagnostic de electie

Enterovirusuri Menigita (mai rar LCR Rt-PCR

encefalita)

Izolarea virala este mult mai sensibila decat testele ce vizeaza evidentierea antigenelor.
Virusurile poliomielitice - atat tulpinile salbatice cit si cele atenuate (dupa vaccin antipolio
trivalent oral) cresc rapid pe celule de embrion uman sau linii Hep 2, HeLa, Vero. Tropismul
celular larg si cresterea rapida ajuta identificarea virusului polio, care determina distructie
celulara asociata cu picnoza. Totusi, diagnosticul de infectie cu virus polio trebuie obligatoriu
confirmat prin seroneutralizare si izolatul viral trebuie trimis centrului de referinta pentru
diferentiere intratipica. Virusurile Coxackie si ECHO cresc mai greu, incet si cateodata deloc
in culturi de celule, identificarea fiind costisitoare si complexa. Virusurile Coxackie A (cu
exceptia Coxackie A9) nu cresc pe culturi celulare si se izoleaza optim pe soarece nou nascut
inoculat intraperitoneal, la care determina producerea de paralizii flasce si generalizate.
Virusurile Coxackie B cresc cel mai bine pe celule de rinichi de maimuta sau embrion uman,
sau in liniile mentionate la virusurile polio, determinind liza si picnoza. Pot fi izolate si pe
soarece nou nascut la care dau paralizii spastice, in focar. Identificarea enterovirusurilor se
realizeaza prin virus neutralizare in laboratoare de referinta, folosind pooluri de seruri (ex:
amestecurile de referinta A-H Lym Benyesh- Melnick, care identifica 42 de serotipuri) si
confirmare cu seruri monospecifice.
Serologia nu are valoare diagnostica, fiind limitata de numeroase cross-reactivitati si de
frecventa infectiilor asimptomatice. Au fost introduse in practica truse ELISA de captura pentru
detectia anticorpilor anti Coxackie B 1-5, care apar in ser la 3 zile de la debutul
simptomatologiei si persista pentru perioade intre 1-6 luni.
Metodele moderne de diagnostic de tip Rt-PCR sunt extrem de utile astazi, izolarea
virala si reactia de seroneutralizare necesitand laboratoare specializate si personal cu experienta.
Avand in vedere numarul mare de enterovirusuri s-au realizat truse pentru PCR multiplex care
au capacitatea de identificare simultana a mai multor tipuri de enterovirusuri, metoda utilizata
si in identificarea virusurilor herpetice.

Diagnostic de laborator in infectii arbovirale

Agent etiologic Sindrom Produs patologic Diagnostic de electie

Arbovirusuri (v. West- Encefalite (mai rar Sange, LCR Diagnostic serologic
(anticorpi tip IgM)
Nile, V. encefalitei de meningite)

capusa)

Izolarea se realizeaza numai in conditiile unor laboratoare de biosecuritate nivel 4 (de


interdictie maxima), sau daca acestea nu sunt disponibile, in laboratoare de interdictie nivel 3,
respectind tehnicile si precautiile specifice nivelului superior. Virusurile pot fi izolate din
biopsie cerebrala, singe sau LCR, inoculate intracerebral la soarecele nou nascut. In cazul in
care apar paralizii in termen de 20 de zile se preleva creierul soricelului si se procedeaza la
identificarea virusului, prin hemaglutinoinhibare sau mai bine prin tehnici ELISA.
Este important de precizat posibilitatea izolarii virale din vectori (tintari) demonstrata si
in epidemia de meningoencefalita cu virusul West Nile din Romania din 1996. Sezonalitatea
transmiterii arbovirale este variabila si depinde de expunerea geografica, ciclul specific de
transmiterea arbovirusului, conditii climaterice locale. Raportarea trebuie sa specifice
etiologia.
Pentru precizarea etiologiei arbovirale este recomandat sa se respecte criteriile
formulate de CDC (Center of Disease Control, Atlanta) care include in definitii urmatoarele:
Caz probabil de encefalita arbovirala: caz compatibil clinic care apare in timpul unei perioade
in care transmiterea arbovirala este probabila, cu serologie de tip: titrul stabil crescut de
anticorpi specifici unui arbovirus: >320 prin HI; >128 prin RFC; >256 prin IF; >160 prin RSN;
>400 prin EIA pentru IgM.
Caz confirmat de encefalita arbovirala este un caz compatibil clinic ce indeplineste
urmatoarele criterii de laborator pentru diagnostic:
1. Cresterea de cel putin 4 ori a titrului anticorpilor specifici serici.
2. Izolarea virala din tesuturi; sange, LCR sau alte fluide sau demonstrarea prezentei acidului
nucleic viral
3. Detectia ac IgM prin ELISA de captura in LCR sau ser. Prezenta anticorpilor specifici IgM
exclusiv in ser trebuie confirmata de demonstrarea prezentei ulerioare a anticorpilor IgG
prin o alta metoda serologica (seroneutralizare sau hemaglutinoinhibare).
Virusurile transmise de insecte (flavi-, togavirusuri) care provoacă frecvent neuroviroze se
diagnostichează serologic prin EIA pentru anticorpi de tip IgM. Anticorpii de tip IgM persistă
uneori mai multe luni iar rezultatele pot fi fals pozitive dacă ne aflăm în zone endemice sau date
anamnestice sugerează vaccinarea recentă anti febră galbenă. Meningoencefalita West Nile se
diagnostichează prin evidențierea anticorpilor IgM sau IgG în LCR. Raportul între titrul
anticorpilor din LCR (sintetizați intratecal) și din ser este util pentru precizarea diagnosticului
și pentru monitorizarea permeabilității barierei hemato-encefalice. Diagnosticul molecular prin
teste AANV este rareori pozitiv în LCR datorită titrurilor virale mici. La fel tentativele de
izolare a virusului din LCR.

Diagnosticul de laborator al rabiei umane

Agent etiologic Sindrom Produs patologic Diagnostic de electie

V. Rabic Rabie Saliva IF, Rt-PCR


Biopsie cerebrala IF, corpii Babes-Negri

Necesita detectia antigenelor rabice in biopsia cerebrala prin imunofluorescenta directa


sau izolare virala (optim pe soarece adult inoculat intracerebral sau pe culturi de celule diploide
umane). Identificarea se bazeaza pe evidentierea incluziilor citoplasmatice acidofile
patognomonice corpii Babes Negri.
Pentru IF, pot fi preparate amprente din hipocamp (cornul Ammon) si din bulb. Lamele
cu amprente se usuca, se sterilizeaza prin iradiere cu ultraviolete 5 minute si se fixeazä cu
acetona la -20 C, timp de 10 minute. Atît tehnica indirecta de imunofluorescenta cît si cea
directa pot fi aplicate, însa IF directa serveste, în plus, la titrarea anticorpilor neutralizanti
obtinuti prin imunoprofilaxie.
Testarea pentru anticorpi antirabici nu este recomandata in practica. Desi exista tehnici
serologice bazate pe identificarea unui titru de anticorpi antirabici > 5 prin seroneutralizare in
ser sau LCR la o persoana nevaccinata, acestea nu sunt utilizate decit cel mult pentru
monitorizarea profilaxiei pasive postexpunere. In cazul in care o persoana imunizata deja are
din nou un contact presupus a fi rabic este obligatorie revaccinarea si indiferent de titrul de
anticorpi nu se recomanda retestare.
DIAGNOSTIC DE LABORATOR IN INFECTIA CU HIV

Sindrom Etiologie Produs Izolare Detectie directa Detectie


patologic indirecta
(serologie)
Infectia Virusul - plasma Utilizata mai - ARN viral Detectie de
HIV/SIDA imunodeficientei - ser mult in scop plasmatic (cel mai anticorpi
umane (HIV) - saliva, de cercetare bun test direct) sau specifici anti-
urina (rar) detectia ADN HIV
proviral în limfocite
Diagnostic de
- Dozarea rutina
antigenemiei p24

Existenta unor teste simple si performante pentru identificarea infectiei HIV este esentiala pentru
diagnosticul precoce si pentru monitorizarea tratamentului.

1. Diagnosticul serologic, diagnosticul de rutina al infectiei HIV, include:


a. tehnici de triaj
b. tehnici de confirmare

a. Triajul serologic se realizeaza cu:


• truse ELISA de competitie sau ELISA indirecte.

TEHNICA ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)


- test imunoenzimatic realizat pe suport solid (placuta cu godeuri)
- utilizat pentru detectia fie a antigenelelor virale, fie a anticorpilor antivirali folosind
marcarea cu o enzima (peroxidaza); aceasta este pusa in contact cu substratul său,
urmand sa apara o reactie de culoare care este citita in final la spectrofotometru.

ELISA INDIRECTA pentru detectia anticorpilor antivirali


Etape:
1. Incubare ser pacient 1h la 37ºC in godeuri peliculizate cu antigene virale
2. Spalare
3. Incubare conjugat (Ac anti IgG uman cuplati cu enzima)- 1h la 37ºC
4. Spalare
5. Incubare substrat – 30 min la temp camerei; solutie de stopare (acid sulfuric)
6. Citire la spectrofotometru – se apreciaza densitatea optica a probelor, martorii, cut off
(valoare prag), zona gri (rezultate indeterminate).
Orice trusa de diagnostic ELISA contine un set de martori negativi si pozitivi. Acestea sunt
controalele interne care sunt esentiale pentru masuratori calitative si trebuie obligatoriu lucrate
la fiecare efectuare a testului, indiferent de numarul de probe testate.

Valoarea cut off (valoarea prag) se calculeaza conform formulei:


CO = Media aritmetica a martorilor negativi + Deviatia standard
- apreciaza pozitivitatea sau negativitatea probelor: rezultatele pozitive (cu densitate
optica mai mare decat CO) si rezultatele negative (cu densitate optica mai mica decat
CO)

Elisa detecteaza prezenta anticorpilor anti HIV1/2, ce apar insa dupa fereastra serologica. Durata
intervalului de fereastra serologica, adica de lipsa a anticorpilor între momentul infectiei si
seroconversie este in medie 4-6 saptamâni. Exista insa si studii controversate, care raporteaza
seroconversie tardiva de pâna la 4 ani, în timp ce altele reduc intervalul la 2-3 saptamâni. Testele
serologice pot da rezultate fals-negative in fereastra serologica, riscul de transmitere a infectiei
HIV este insa extrem de ridicat. Acest element trebuie luat în considerare în hemovigilenta, în
recrutarea donatorilor, în special în tarile cu endemie ridicata.

Se apreciaza ca sensibilitatea truselor comerciale este mai mare de 99,7%, specificitatea insa
este mai redusa (peste 98,5%), putand sa apara rezultate fals- pozitive. Cauzele rezultatelor
fals- pozitive la testele de screening HIV includ:
- Infectia cu virusul Epstein-Bar
- Sarcina
- Boli autoimune
- Hipergamaglobulinemie
- Hiperbilirubinemie
- Erori tehnice
Performantele truselor au fost ameliorate pe masura ce au fost utilizate antigene mai corect
purificate pentru peliculizarea godeurilor în care se executa reactia imunoenzimatica:
a) trusele de prima generatie foloseau lizate virale obtinute în urma cultivarii
virusului întreg pe limfocite umane
b) trusele de generatia a 2-a folosesc proteine virale recombinante (produse de genele
env si gag)
c) trusele de generatia a 3-a folosesc si peptide sintetice; aceste peptide corespund ca
secventa de aminoacizi segmentelor înalt conservate, comune tuturor subtipurilor
HIV, din proteinele virale gp41 env si p24 gag. Utilizarea antigenelor virale
purificate si standardizate - proteine recombinante si peptide sintetice- reduce
reactiile nespecifice cauzate de contaminantii celulari ai antigenel-or de prima
generatie. Trusele de generatia a 3-a detecteaza anticorpi de tip IgG si IgM;
specificitatea lor atinge 99,9% si, în plus sunt capabile sa detecteze seroconversia
în urma infectiei primare cu 5-7 zile mai devreme.
d) trusele de generatia a 4-a folosesc peptidele sintetice si proteinele recombinante
utilizate de trusele de generatia a 3-a pentru a detecta anticorpii de tip IgG si IgM,
si in plus includ anticorpi monoclonali pentru detectia antigenului p24. Detectia
acestui antigen HIV permite diagnosticarea timpurie a infectie HIV inainte de
apritia seroconversiei.

In scop diagnostic (figura 1):


1. o proba initial non-reactiva pentru anticorpi anti HIV este raportata ca negativa pentru HIV
2. o proba initial reactiva pentru anticorpi anti HIV se repeta tot intr-un test imunoenzimatic
(recomandabil, pe o proba recoltata din nou) în duplicat, cu truse de principiu diferit (exemplu:
ELISA indirecta si de competitie) sau fabricate de producatori diferiti
3. in cazul in care se utilizeaza teste de triaj folosind combinatii HIV 1/HIV 2 si probele sunt
pozitive se va executa un test de confirmare- Western blot pentru HIV 1:
• daca rezultatul este pozitiv, proba va fi raportata ca fiind reactiva pentru HIV 1
• daca rezultatul va fi negativ sau indeterminat se va recomanda o testare pentru
HIV 2, initial prin ELISA si apoi Western Blot.

• tehnici rapide- care se bazeaza pe aglutinarea unor particule de latex sau de aur coloidal
care au fost cuplate cu antigene virale.
Tehnicile rapide nu necesita echipament de laborator complicat si pot fi executate în cabinete si
ambulatorii de medicina generala sau de pacientii însisi. Reactiile se citesc în mai putin de 20 de
minute. Reactiile pozitive trebuie confirmate obligatoriu.

Exista metode de triaj serologic care nu se adreseaza probelor de ser, ci altor produse biologice
(saliva, urina etc.), care pot fi recoltate prin procedee noninvazive. Rezultatele procedurilor
noninvazive de diagnostic care evidentiaza prezenta anticorpilor în saliva sau în transudatul
gingival crevicular pot atinge specificitatea de 98%, dar sensibilitatea este între 85-90%.
Au fost dezvoltate si teste rapide de generatia a 4-a care identifica pe langa anticorpii anti-
HIV1/anti-HIV2, si prezenta antigenului p24, permitand diagnosticarea timpurie a infectie HIV.

b. Confirmarea probelor reactive repetat în ELISA se poate realiza prin urmatoarele metode:
• Western-Blot (WB)
• Imunofluorescenta (IF)

Reactia WB este cea mai utilizata tehnica de confirmare; are o specificitate inalta, data de faptul
ca determina anticorpi anti HIV defalcati pe grupe antigenice (testul ELISA determina masa
generala de anticorpi anti HIV).

TEHNICA WESTERN-BLOT (WB)

Testul Western blot reprezintă o tehnică utilizată pentru detecţia specifică a anticorpilor
antivirali în urma reacţiei cu antigenele ţintă imobilizate pe o membrană de nitroceluloză. Iniţial
proteinele virale sunt separate prin electroforeză in gel, în funcţie de greutatea lor moleculara.
Ulterior proteinele sunt transferate pe o membrană de nitroceluloză, păstrând acelaşi model de
separare ca şi pe gel. Se adaugă proba supusă diagnosticului şi, în cazul în care există anticorpi
specifici, aceştia se vor lega de antigenele virale împotriva cărora au fost sintetizaţi. Detecţia
anticorpilor fixaţi se realizează prin adăugarea anticorpului secundar (anticorp anti IgG uman,
aflat in conjugat) cuplat cu o enzimă (fosfatază alcalină sau o peroxidază) care nu poate fi
vizualizată în acestă etapă a reacţiei. Vizualizarea este posibilă în urma incubării probei cu un
substrat incolor pe care enzima ataşată in conjugat îl va converti într-un produs colorat vizibil.

ETAPE:
1.SDS-PAGE – electroforeza in gel de policacrilamida in prezenta unui detergent anionic
(sodium dodecyl sulphate).
2. BLOT - transferul antigenelor virale din gel pe o membrana de nitroceluloza
3.DETECTIA ANTICORPILOR din serul pacientului prin punerea in contact a serului de
cercetat cu membrana de nitroceluloza, si urmarirea aparitiei benzilor colorate induse de
prezenta anticorpilor si aparitia reactiei imunoenzimatice.
Orice trusa de diagnostic WB contine un set de martori negativi si pozitivi. Acestea sunt
controalele interne care sunt esentiale pentru masuratori calitative si trebuie obligatoriu lucrate
la fiecare efectuare a testului, indiferent de numarul de probe testate si se utilizeaza pentru
compararea si aprecierea numarului si distributiei benzilor rezultate din serul pacientului.

Profilul de benzi din Western Blot depinde de reactivitatile componentelor antigenice cu


anticorpii prezenti in serul pacientului (figura 1). Majoritatea truselor Western blot respecta
clasificarea CDC:
- un ser este considerat HIV-pozitiv in conditiile in care exista reactivitate pentru cel putin 3
din urmatoarele antigene: p 24, gp 41, gp 120/160
- un rezultat negativ este dat de absenta tuturor benzilor, desi OMS sugereaza ca pot fi raportate
ca negative si probe pentru care exista o reactivitate foarte slaba la nivelul benzii p 17
- in cazul in care apar reactivitati la unul sau la mai multe antigene, dar criteriul de pozitivitate
mentionat anterior nu este indeplinit, proba este considerata indeterminata. Acest profil poate
indica:
• infectie HIV timpurie
• existenta unor crosreactivitati (15 % din persoanele neinfectate HIV prezinta
astfel de reactivitati nespecifice in Western blot, in special la nivelul proteinelor gag (p
17, p 24 si p 55).
In cazul unor astfel de rezultate indeterminate, OMS recomanda retestarea pacientului dupa 2-
4 saptamani (alte organizatii sugereaza retestare la 1- 6 luni) sau realizarea unui test molecular.
In cazul retestarii pacientului, cele doua probe trebuie lucrate in paralel in aceleasi conditii,
pentru ca rezultatele sa poata fi comparate direct:
• daca a doua proba are un rezultat WB negativ sau daca profilul indeterminat al benzilor
ramane constant identic cu cel din proba initiala, infectia HIV poate fi exclusa
• daca profilele sunt diferite in sensul aparitiei mai multor benzi reactive sau a unei
intensitati crescute a benzilor, aceasta indica existenta unei infectii HIV timpurii.
Trebuie subliniata posibilitatea aparitiei unor reactivitati la nivelul benzii gp 160 la indivizii
care au participat voluntar in testari ale unor vaccinuri potentiale ce includ glicoproteina gp
160. Semnificatia unui rezultat Western blot indeterminat variaza functie de: factori de risc,
statusul clinc al pacientului si profilul reactivitatii in Western blot. Prezenta mai multor benzi
(ex. p 24 + p 17 + p 55) este mai sugestiva pentru o infectie timpurie. In general, exista o
concordanta foarte buna între rezultatele serologice (ELISA + WB) si tehnicile de detectie a
prezentei virusului.

Strategia de testare în infectia HIV este reprezentata în figura 1.

ELISA

POZITIV IN DUPLICAT

WESTERN BLOT

NEGATIV= POZITIV=
NEGATIV
INFECTIE HIV
ABSENTA INFECTIEI

INDETERMINAT =
- ARN HIV
- Antigen p24
Fereastra serologica
- ADN proviral
- Repetat la 2-4 saptamani
- Alt test de confirmare

In iunie 2014, CDC recomanda un nou algoritm de testare a infectiei HIV ce permite
diagnosticul infectiei acute cu 3- 4 saptamani mai devreme comparativ cu abordarea anterioara.
Noul algoritm include (figura 2):
1. Intr-o prima etapa se realizeaza un test imunoenzimatic combinat (denumit “test de
generatia a 4-a”), ce detecteaza anticorpii HIV-1 si HIV-2, precum si antigenul p24
HIV-1; astfel, acest test este mai sensibil in diagnosticarea timpurie a infectiei HIV-1,
deoarece pune in evidenta antigenul p24- antigen ce apare inaintea anticorpilor.
2. Pentru probele pozitive la testul de screening de generatia a 4-a se va realiza un test
suplimentar, ce diferentiaza anticorpii HIV1 de anticorpii HIV 2:
• daca rezultatul este pozitiv, proba va fi raportata ca fiind reactiva pentru HIV 1
sau HIV2
• daca rezultatul este negativ sau indeterminat, se va testa ARN HIV-1 pentru a
diferentia infectia acuta de un rezultat screening fals- pozitiv.
Testele WB HIV-1 si IF HIV-1, recomandate anterior pentru diagnosticul infectiei HIV, nu mai
sunt incluse in noul algoritm de diagnostic.

Figura 2. Noul algoritm de diagnostic al infectiei HIV (recomandat de CDC)

Test combinat antigen/anticorpi HIV-1/2

(+) (–)
Negativ pentru anticorpii HIV-1 si HIV-2
si pentru antigenul p24
Test pentru diferentierea
anticorpilor HIV-1/HIV-2

HIV-1 (+) HIV-1 (–) HIV-1 (+) HIV-1 (–) sau indeterminat
HIV-2 (–) HIV-2 (+) HIV-2 (+) HIV-2 (–)

Anticorpii HIV-1 Anticorpii HIV-2 Anticorpii HIV


detectati detectati detectati Test pentru detectia
acidului nucleic
HIV-1

(+) reactiv Test pentru detectia Test pentru detectia


(–) nonreactiv acidului nucleic HIV-1 acidului nucleic HIV-1
(+) (–)
Infectie acuta HIV-1 Negativ pentru HIV-1

Noul algoritm recomandat de CDC pentru testarea HIV era necesar deoarece:
• diagnosticheaza cu o mai mare acuratete infectia HIV acuta
• WB si IF indirecta utilizate pentru confirmarea testelor ELISA repetat reactive pot
determina rezultate fals-negative sau indeterminate in infectia HIV timpurie
• riscul de transmitere a virusului HIV este mult mai mare la persoanele cu infectie
acuta comparativ cu persoanele cu infectie cronica
• recent exista indicatii pentru initierea tratamentului antiretroviral la toate persoanele
infectate HIV, inclusiv la cele cu infectie acuta
• diagnosticheaza cu o mai mare acuratete infectia HIV-2
2. Izolarea virala. Izolarea virusului HIV se realizeaza prin cocultivarea limfocitelor pacientului
cu linii celulare limfoblastoide T sau cu limfocite de la donatori sanatosi stimulate 24 de ore
înainte cu fitohemaglutinina si IL-2. Metodele de izolare sunt rezervate laboratoarelor care dispun
de nise de biosecuritate clasa III si laboratoare de interdictie. Izolarea virusului poate întârzia
câteva saptamâni, dar este indispensabila caracterizarii subtipurilor antigenice si markerilor
fenotipici legati de virulenta si sensibilitate la antiretrovirale.

3. Detectia directa include:


(a) - dozarea antigenemiei p24 prin tehnici imunoenzimatice cu sisteme de amplificare cu
anticorpi biotinilati. Detectarea antigenemiei p24 se realizeaza prin metoda ELISA, cu ajutorul
standardelor nationale sau furnizate de laboratoare de referinta ce determina concentratii în
domeniul picogramelor. Disocierea complexelor antigen p24- anticorpi anti p24 prin tratamentul
acid al serurilor, creste de 5 ori sensibilitatea metodei.

(b) - detectia ARN viral plasmatic sau ADN proviral în limfocite prin PCR.
Detectarea ARN viral plasmatic sau ADN proviral se face dupa amplificarea cu primeri specifici
prin PCR, cu tehnici de hibridizare cu sonde specifice.

Amplificarea genica cantitativa pentru ADN proviral presupune extractia ADN-ului celular
din PBMC si amplificarea secventei tinta corespunzatoare unei portiuni conservate a genomului
(gag sau pol) simultan cu etaloane de calibrare cu numar cunoscut de copii provirale. Etalonul
este reprezentat de ADN extras din linia 8E5/LAV, care contine o singura copie de ADN
proviral per celula. Detectia se realizeaza prin hibridare cu o sonda marcata enzimatic cu
digoxigenina sau cu izotopi radioactivi.

Detectarea ARN HIV plasmatic se realizeaza prin amplificare genica dupa reverstranscriere (Rt-
PCR) si ilustreaza direct infectivitatea probelor pozitive.

PCR este o tehnica superioara izolarii virale, atât ca sensibilitate, cât si ca promptitudine. De
asemenea, tehnica PCR este mai putin costisitoare si mai putin laborioasä.
Sensibilitatea extrema a PCR face aceasta metoda de diagnostic indispensabila în:
• detectia infectiei înainte de seroconversie (fereastra serologica)
• detectia transmisiei materno-fetale a virusului
Detectia infectiei la nou nascutii din mame seropozitive este o problema extrem de complexa,
deoarece anticorpii anti-HIV IgG materni traverseaza placenta. Intervalul mediu pentru disparitia
anticorpilor transmisi transplacentar este de 10 luni. Copiii care prezinta anticorpi dupa vârsta de
18 luni sunt considerati infectati, pentru ca acesti anticorpi indica raspunsul imun la o infectie
productiva. Diagnosticul infectiei la copii trebuie intotdeauna confirmat prin tehnicile de
evidentiere a replicarii virale (detectia ARN HIV sau ADN HIV proviral de la nivel limfocitar).

Diagnosticul de infectie HIV se raporteaza in urmatoarele conditii:

Copil sub 18 luni este infectat când prezinta doua probe reactive pentru ARN HIV
prin metoda Rt-PCR pe esantioane recoltate la interval de câteva
saptamâni.

In unele cazuri, mai ales in scop de cercetare, se poate utiliza PCR


pentru detectia ADN proviral limfocitar

Copil peste 18 luni este infectat când prezinta probe repetat reactive în ELISA si WB.

Un copil sub 18 luni nascut din mama HIV pozitiva este considerat ca neinfectat daca nu
indeplineste conditiile de infectie HIV si are cel putin 2 teste negative pentru anticorpi anti HIV
pe probe separate la varsta de > 6 luni sau cel putin 2 teste directe HIV negative pe probe
separate testate la > 1 an si un test negativ care a fost realizat la > 4 luni si nu are nici o alta
evidenta clinica sau de laborator de infectie HIV.

• evaluarea raspunsului la terapia antiretrovirala si monitorizarea încarcarii virale.

Este important de precizat ca monitorizarea tratamentului se realizeaza prin corelarea datelor


virusologice privind incarcarea virala si numarul celulelor CD4 pozitive cu starea clinica a
pacientului. Incarcarea virala trebuie apreciata numai raportat la o valoare initiala de referinta
determinata pentru fiecare pacient inainte de initierea tratamentului. Scaderea incarcarii virale
plasmatice la nivelele nedetectabile indica eficacitatea tratamentului, dar orice scadere de
minim 3 log10 este considerata indicator de raspuns bun la terapia antiretrovirala. De asemenea,
trebuie mentionat faptul ca lipsa viremiei plasmatice, ilustrata prin scaderea incarcarii virale la
nivel nedetectabi, nu inseamna supresia totala a replicarii virale. Exista compartimente tisulare
in care virusul este detectat in continuare, chiar in conditiile absentei sale din plasma.
Compartimentele care pot servi drept sanctuare tisulare pentru HIV sunt ganglionii limfatici,
amigdale, sistemul nervos central si tractul genital.

Rezistenta la antiretrovirale este un factor major care contribuie la esecul terapiei.


Evaluarea sensibilitatii HIV la antiretrovirale trebuie realizata:
1. in momentul diagnosticului, indiferent daca se decide initierea terapiei sau nu (testare
genotipica)
2. la pacientii naivi la tratament, inainte de initierea terapiei (testare genotipica)
3. la pacientii cu esec terapeutic sau supresie virala incompleta in timpul cART (testare
genotipica si/sau fenotipica). Pentru pacientii cu supresie incompleta a replicarii virale,
se recomanda testarea in timpul tratamentului sau dupa intreruperea tratamentului de
mai putin de 1 an.
DIAGNOSTIC IN HEPATITELE VIRALE

Agentii etiologici cei mai frecventi ai hepatitelor sunt virusurile hepatitice: A, B, C, D si E.

DEFINITIA DE CAZ PENTRU HEPATITELE VIRALE implica:


1. criteriile clinice
2. teste biochimice
3. date epidemiologice
4. diagnosticul virusologic

1. Tabloul clinic este general valabil in hepatite, indiferent de cauza acesteia (icter,
hepatomegalie, urini hipercrome/scaune decolorate, astenie, greata, voma); de aceea
in definitia de caz pentru hepatitele virale criteriul clinic nu variaza de la o etiologie
la alta. Orientarea spre diagnosticul de hepatita virala mai include:
2. Teste biochimice - markerii necrozei hepatocitare (ALT, AST); markerii de
colestaza (bilirubina), markeri ai incapacitatii de sinteza a ficatului (proteinele
plasmatice - albumina si glubulinele serice)
3. Date epidemiologice - cale transmitere, perioada de incubatie, vaccinare (exista
vaccin doar pentru VHA si VHB)
4. Diagnosticul virusologic - detectia markerilor virali in plasma sau ser indica
etiologia!!)
- Detectia antigenelor virale (Ag) si a anticorpi antivirali (Ac)
- Diagnosticul molecular (detectia acidului nucleic viral)

1. Hepatita virala A
Hepatita virala A nu cronicizeaza! Diagnosticul virusologic – se pune pe prezenta Ac
anti VHA de clasa IgM in ser

Semnificatia prezentei serice a markerilor infectiei cu VHA este redata in tabel


Markeri de diagnostic
Anticorpi anti VHA IgM Indica infectia acuta cu virusul hepatitic A.
Apar odata cu debutul simptomelor si î n general
dispar dupa 1-3 luni.
Pentru a confirma diagnosticul de hepatita A, virusul
poate fi evidentiat î
n fecale prin
imunoelectronomicroscopie
Anticorpi anti VHA IgG Indica infectie vindecata VHA cu imunitate
consecutiva sau vaccinare pentru hepatita A

Folosind tehnici imuno-enzimatice sau de imunofluorescenta antigenele specifice VHA pot


fi detectate in fecale, ser, saliva sau probe prelevate din mediu.
ARN VHA poate fi detectat prin Rt-PCR. Desi diagnosticul molecular nu este folosit de
rutina, el poate juca un rol important in epidemiile de hepatita, la pacientii fara anticorpi
specifici anti-VHA sau in cazul hepatitelor acute de etiologie necunoscuta.

2. Hepatita virala B
Hepatita virala B cronicizeaza la adult in ~5% dintre cazuri (la nou-nascut ~90%); de
aceea diagnosticul virusologic trebuie sa diferentieze:

• Hepatita B acuta
• Hepatita B cronica persistenta
• Hepatita B cronica activa / agresiva (cu posibilitate de evolutie
spre ciroza hepatica/ carcinom hepato-celular

Sistemele antigenice in infectia VHB sunt reprezentate de:


• Ag HBs <=> Ac antiHBs
• Ag HBc <=> Ac antiHBc
• Ag HBe <=> Ac antiHBe

Momentul aparitiei si semnificatia prezentei serice a markerilor infectiei cu VHB sunt


redate in tabel.
AgHBs Indica infectie cu VHB in desfasurare. Pacientul este considerat potential
infectios.
Este detectabil in:
- timpul perioadei de incubatie (cu 3-5 saptamani inainte de aparitia
semnelor biochimice
- faza acuta a hepatitei B
- infectia cronica VHB.
Persistenta peste 6 luni indica cronicizarea infectiei
Dispare la 4-6 saptamani la pacientii care se vindeca
AgHBe Semnifica replicare virala activa, cu risc mare de cronicizare a bolii. Provine
din proteoliza limitata a AgHBc, care nu se poate detecta in ser
In infectia acuta AgHBe poate fi detectat î n ser pentru o perioada scurta (zile-
saptamâni), la sfârsitul careia este eliminat de anticorpii corespunzatori (anti
HBe) care vor persista ani de zile.
Este prezent în hepatita cronica activa (agresiva) fiind markerul cel mai utilizat
pentru evaluarea contagiozitatii si infectivitatii purtatorilor cronici de AgHBs
AgHBc Nu apare niciodata in sangele periferic. Se gaseste doar in hepatocit!
Anticorpi Indica infectie acuta, recenta cu virus hepatitic B.
anti HBc Sunt prezenti de la debutul fazei acute si persista timp de maxim 6 luni, fiind
IgM ulterior inlocuiti de Ac anti HBc IgG.
Ocazional pot reaparea in titruri scazute in hepatita B cronica activa.
Anticorpi Sunt cei mai buni markeri ai trecerii prin infectia naturala cu VHB. Persista
anti toata viata, indiferent de evolutia infectiei, chiar si la cei cu vindecare completa,
HBcIgG dar nu sunt anticorpi protectori!!!
Testarea anti HBc nu este un indicator valabil pentru infectia perinatala pentru
ca anticorpii de tip IgG sunt transferati pasiv transplacentar de la mama si pot
persista pana peste 12 luni de viata.

Anticorpi Sunt singurii anticorpi protectori!!! (marker de vindecare si imunitate)


anti HBs Sunt detectabili in ser la 6 saptamani - 6 luni de la disparitia AgHBs. Apar in:

 hepatita B vindecata

 postvaccinare pentru hepatita B (testarea lor se practica obisnuit


pentru evaluarea raspunsului la vaccinarea antihepatita B (1-2 luni
de la terminarea schemei complete)

 dupa transferul pasiv de anticorpi specifici anti hepatita B in


cadrul imunoprofilaxiei
Anticorpi Apar odata cu disparitia din ser a AgHBe.
anti HBe Prezenta lor indica scaderea contagiozitatii si prognostic favorabil al infectiei,
semnaleaza reducerea cantitatii virusului infectios dar nu sunt protectori!!!
(sugereaza convalescenta in stadiul timpuriu sau infectie trecuta cu virus
hepatitic B, dar pot fi prezenti si la purtatorii cronici de antigen HBs.

ADN-VHB Semnaleaza prezenta de virioni infectanti î n ser - poate fi asimilata titrarii


particulelor virale complete, cu potential infectant.
Utilizat in: monitorizarea evolutiei hepatitei B (< 2000 IU/mL-prognostic bun),
initierea tratamentului si evaluarea raspunsului la terapie in hepatita cronica
VHB

Hepatita B acuta - diagnostic virusologic:

 Ac antiHBc de clasa IgM pozitiv


 Ag HBs pozitiv

Hepatita B cronica - diagnostic virusologic :

 Ac antiHBc de clasa IgG pozitiv si


 Ag HBs pozitiv (sau Ag HBe pozitiv / sau ADN VHB pozitiv)

Hepatita B cronica cu Ag HBe pozitiv si / sau ADN VHB pozitiv este considera hepatita
cronica activa (agresiva), cu posibilitate de evolutie spre ciroza hepatica/ carcinom hepato-
celular .

Hepatita B vindecata - diagnostic virusologic:


 Ac antiHBs pozitiv

 Ac antiHBc de clasa IgG pozitiv

Pacient vaccinat pentru hepatita B - diagnostic virusologic:


 Ac antiHBs pozitiv

 Ac antiHBc de clasa IgG negativ

In hepatita cronica B incarcarea virala ADN-VHB este folosita pentru:

 Monitorizarea evolutiei naturale a hepatitei B (pacientii cu prognostic bun nu


depasesc 2000 IU/mL)
 Initierea tratamentului in hepatita cronica B
 Evaluarea raspunsului la terapie in hepatita cronica VHB

Genotiparea VHB – prin secventiere sau mai frecvent cu teste comerciale, LiPA (Line
Probe Assay)- se foloseste pentru decelarea prezentei mutatiilor de rezistenta la
Lamivudina sau Tenofovir sau pentru determinarea genotipului infectant.

3. Hepatita virala C

Hepatita virala C cronicizeaza la adult in proportie de ~70-80 % dintre cazuri


Diagnosticul în infecţia VHC implică două tipuri de teste: testele serologice, de
detecţie a anticorpilor antiVHC (teste de screening), în cea de a doua etapă realizandu-se
diagnosticul molecular - pentru detecţia genomului viral.
Testul Semnificatia
ELISA Indica infectie recenta sau cronica, testele pozitive
trebuie confirmate
RIBA/Western Blot- HCV Folosit in trecut ca test serologic de confirmare; nu
semnifica contagiozitate
Rt PCR calitativ Detecteaza prezenta viremiei; confirma diagnosticul de
(prezenta/absenta ARN VHC) infectie cronica si contagiozitatea; monitorizeaza
pacientii sub tratament.
Rt PCR cantitativ (UI/ml ARN Determina nivelul viremiei; este un predictor al
VHC) probabilitatii de raspuns la tratament
Genotipare (hibridizare -LiPA; Diferentiaza cele 6 genotipuri si unele subtipuri
tratament cu enzime de este un predictor al probabilitatii de raspuns la tratament
restrictie - RFLP)

Testele serologice de screening bazate pe detecţia anticorpilor anti VHC au la


baza testul ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay); odată seroconversia produsă,
pacienţii rămân seropozitivi toată viaţa. Seroconversia apare in 4 - 10 săptămâni de la
contactul infectant. Testele care detectează anticorpii anti VHC au valoare predictivă
pozitivă scăzută in populaţiile cu prevalenţă mică a infectiei; din această cauză la
persoane cu test ELISA pozitiv pentru anti VHC sunt necesare teste suplimentare.
In prezent testele suplimentare sunt reprezentate de metodele de detecţie a ARN
viral. În funcţie de informaţiile necesar a fi obţinute, există câteva tipuri de teste
moleculare. Testele calitative Rt-PCR sunt folosite pentru confirmarea infecţiei VHC
active, în timp ce testele cantitative şi genotiparea sunt indicate pentru evaluarea bolii,
prin măsurarea încărcării virale, identificarea genotipului şi monitorizarea răspunsului la
terapie. Încărcarea virală este utilizata pentru evaluarea rezultatelor terapiei; pacienţii cu
încărcarea virală mare răspund mai rar la terapia cu interferon comparativ cu cei cu un
baseline de sub 600 000 UI/ml, acesta fiind un factor predictiv pentru obţinerea unui
răspuns virusologic susţinut după tratament.
Există câteva tehnici moleculare cantitative: RT-PCR cantitativ, TMA (reactia de
amplificare genica mediata de transcriere) şi bDNA (branched DNA). Sensibilitatea
acestor teste este de 50 până la 500 de copii ARN VHC/ml.

Metodele de genotipare sunt folosite pentru a da un prognostic asupra


răspunsului la terapie, deoarece genotipurile 2 şi 3 răspund mai bine la tratamentul cu
IFN decât genotipul 1. Comercial se foloseste testul de genotipare LiPA (line probe assay),
o hibridizare cu sonde moleculare cu specificitate pentru regiuni conservate din cadrul
genotipurilor si subtipurilor, care permite evidentierea profilului specific unui genotip
prezent in ampliconii din 5’NTR si core.
De asemenea, genotiparea este folosită şi în studiile de epidemiologie
moleculară. Metodele cele mai precise - secvenţierea nucleotidică- determină secvenţa
nucleotidică a diferitelor izolate VHC, dar acestea nu sunt practice în diagnosticul clinic
de rutină (laborioase si scumpe), existand şi metodele mai simple: RFLP (restriction-
fragment length polimorphism), type-specific PCR, şi LiPA (line probe assay).

Hepatita C acuta - diagnostic virusologic:

 Ac anti VHC pozitivi


 ARN VHC pozitiv (test molecular calitativ, cantitativ sau de genotipare) sau Ag
VHC (in unele tari sunt aprobate testele de detectie pentru Ag VHC)

Hepatita C cronica - diagnostic virusologic:

 Ac anti VHC pozitivi


 ARN VHC pozitiv (test molecular calitativ, cantitativ sau genotipare)
 Niciun criteriu de hepatita C in antecedente

Momentul aparitiei si semnificatia prezentei serice a markerilor infectiei cu VHC sunt


redate in tabel.
Anti VHC / ARN VHC Interpretare clinică
Absenţa infecţiei VHC
Anti VHC negativ, ARN VHC negativ
Infecţie VHC acută sau cronică (activă)
Anti VHC pozitiv, ARN VHC pozitiv
• Infecţie acută recentă în care nu a avut loc
Anti VHC negativ, ARN VHC pozitiv încă seroconversia (4 - 10 săptămâni)
• Infecţie cronică la un pacient
imunosupresat
Anti VHC pozitiv + ARN VHC negativ • Infecţie vindecată
• Viremie cu nivel redus sau fluctuantă,
intermitent negativă

4. Hepatita D (delta)
Hepatita delta nu poate fi prezenta decat la pacientii cu Ag HBs pozitiv, VHD avand
nevoie de VHB ca virus helper pentru intrarea in hepatocit.

Exista 2 situatii care pot fi detectate in practica:

Coinfectia B-D: diagnosticul virusologic se bazeaza pe: AgHBs (+), anti HBc IgM (+),
anti VHD IgM (+)

Suprainfectia B-D: diagnosticul virusologic implica: AgHBs (+), anti HBc IgG (+), anti
VHD IgM (+).
5. Hepatita E
Infectia VHE nu este frecvent intilnita in tara noastra; diagnosticul de hepatita acuta E se
pune prin ELISA pentru anticorpi anti VHE IgM si totali; ca test additional se poate
folosi Rt PCR pentru detectia ARN VHE in sange sau materii fecale.
Exista 4 genotipuri VHE cu evolutie diferita - genotipul 3 este singurul care poate
croniciza).

Hepatita E trebuie suspectata in epidemiile hidrice din tarile subdezvoltate, mai ales daca
simptomatologia este mai grava la femeile insarcinate si diagnosticul de hepatita A a fost
exclus.

Caracterele principale ale virusurilor hepatitice pot fi urmarite in tabel.

Transmitere Cronicizare Diagnostic DE RUTINA


Agent
etiologic
VHA ENTERIC NU Detectie de anticorpi anti
(fecal-oral) VHA IgM (ELISA de captura)

VHB Percutan/Permucos DA (la adult <5- - Detectie de antigene:


10%)
Sexual AgHBs, AgHBe (ELISA
Perinatal sandwich)
Contact direct - Detectie de anticorpi Ac
antiHBc IgM si IgG, Ac
antiHBe, Ac antiHBs (ELISA
indirecta)
- Detectie de acid nucleic
ADN-VHB prin PCR
VHC Percutan/Permucos DA (la adult 70- - Detectie de anticorpi prin Ac
antiVHC (ELISA indirecta)
(rar: 80%)
- Detectie de acid nucleic
sexual/perinatal)
ARN-VHC prin Rt PCR
VHD Doar in coinfectie DA Detectie de anticorpi Ac
sau suprainfectie
antiVHD IgM (ELISA
cu VHB
indirecta)
(Detectie de acid nucleic
ARN-VHD prin Rt PCR)
VHE ENTERIC genotipurile 3/4 Detectie de anticorpi Ac anti
fecal-oral pot croniciza
VHE IgM (ELISA indirecta)
(Detectie de acid nucleic
ARN-VHE prin Rt-PCR)

Indicatiile diagnosticului molecular in hepatitele virale


In hepatita cronica B incarcarea virala ADN VHB este folosita pentru:

 Monitorizarea evolutiei naturale a hepatitei B (pacientii cu prognostic bun nu


depasesc 2000 IU/mL)
 Initierea tratamentului in hepatita cronica B
 Evaluarea raspunsului la terapie in hepatita cronica VHB

In hepatita cronica C incărcarea virală ARN VHC este importantă pentru:

 Evaluarea rezultatelor terapiei –leziuni hepatice minime pot fi insa compatibile cu


o încărcarea virală mare. Totuşi, pacienţii cu încărcarea virală mare răspund mai rar
la terapia cu interferon comparativ cu cei cu un baseline de sub 600 000 UI/ml, acesta
fiind un factor predictiv pentru obţinerea unui răspuns virusologic susţinut după
tratament.
 Metodele de genotipare sunt folosite pentru prognosticul răspunsului la terapie,
genotipurile 2 şi 3 raspund mai bine la tratament - 24 de săptămâni decât genotipul
1 - 48 de săptămâni
 Genotiparea este folosită şi în studiile de epidemiologie moleculară, secvenţierea
nucleotidică putand determina gradul de inrudire filogenetica a diferitelor izolate
VHC.

Criteriile de evaluare a tratamentului in hepatitele virale:


 Virusologice: incarcarea virala (ADN VHB sau ARN VHC)
 Biochimice: nivelul transaminazelor
 Histologice: fibroza hepatica/activitatea necro-inflamatorie (in prezent se utilizeaza
indici non-invazivi: FibroScan™ (Elastografia) si FibroMax™.
DIAGNOSTIC DE LABORATOR IN INFECTIA CU HPV

Papillomavirusurile (HPV) includ o multitudine de genotipuri cu tansmitere sexuală


sau prin tegumentele si mucoasele cu microleziuni, care pot determina patologii diverse :
condilloma accuminata - tumori benigne ale mucoasei genitale vulvovaginale, cervixului
uterin, penian, uretral, iar infectiile persistente cu genotipurile HPV cu risc oncogen inalt (16,
18, 31 etc) pot fi la originea unor cancere in sfera genitala si oro- faringiana.
Recomandarile OMS pentru preventia cancerului de col uterin cuprind : screening
citologic, screening virusologic, vaccinare anti HPV, educatie sexuala, renuntare la fumat.

A. Screeningul citologic se realizeaza prin testul Babes-Papanicolau (citologie


exfoliativa sau citologie cervico-vaginala).

În urma prelucrării şi examinării probei, rezultatul se elaborează conform Sistemului de


raportare a citologiei colului uterin Bethesda 2001 :

– modificări non-neoplazice – NILM;

– anomalii ale celulelor epiteliale scuamoase: ASC-US, ASC-H, LSIL, HSIL, SCC;

– anomalii ale celulelor glandulare-AGC, AIS, adenocarcinom.

Tehnica descrie anomalii ale celulelor epiteliale scuamoase si glandulare. In contextual


infectiei HPV sunt importante anomaliile scuamoase, deoarece HPV are tropism pentru
celula epiteliala scuamoasa.

Anomalii scuamoase:

 Celule scuamoase atipice: – cu semnificaţie nedeterminată (ASC-US); nu se poate


exclude HSIL (ASC-H);

 Leziuni scuamoase intraepiteliale de grad scăzut (LSIL) – includ modificări induse de


HPV; displazia uşoară; CIN1 ;
 Leziuni scuamoase intraepiteliale de grad înalt (HSIL) – includ leziunile: CIN2
(displazia moderată) şi CIN3 ( displazia severă şi carcinomul in situ).
 Carcinom cu celule scuamoase

Rezultatul Pap testului trebuie interpretat prin corelarea cu datele clinice ale
pacientelor precum şi cu alte investigaţii efectuate. Astfel, în funcţie de suspiciunea ridicată în
urma Pap testului, prin integrarea în contextul clinic de către medicul curant, se pot formula
recomandările privitoare la conduita terapeutică şi diagnostică ce trebuie urmată.

1
In ceea ce priveste leziunile premaligne LSIL si HSIL interpretarile sunt urmatoarele:

LSIL: – sugerează modificări ale celulelor epiteliale scuamoase compatibile cu o leziune


intraepitelială de grad scăzut. Termenul de leziune intraepitelială se referă la faptul că
modificările celulare sunt strict localizate la nivelul epiteliului de acoperire al colului uterin,
fără a depăşi membrana bazală, deci fără potenţial invaziv. Într-o leziune de grad scăzut
modificările atipice sunt prezente doar la unele dintre celulele scuamoase.

– în această categorie sunt încadrate modificările celulare induse de infectia productive cu


HPV (celule cu nuclei picnotici si cu halou perinuclear – koilocite) şi CIN1 (displazia
uşoară);

– reprezintă indicaţie pentru colposcopie cu biopsia leziunilor suspecte.

HSIL: – sugerează prezenţa unei leziuni intraepiteliale de grad înalt în care atipiile celulare
sunt mai mari şi afectează o proporţie mai mare din celulele epiteliale (celule mici, ratatinate,
anormale, cu nucleu dezvoltatat, citoplasma putina, raport nucleo-citoplasmatic supraunitar),
dar sunt încă limitate la epiteliul de acoperire al colului uterin fără a depăşi membrana bazală.

– apare ca urmare a persistenţei şi evoluţiei unei leziuni de etiologie HPV.

– include modificări CIN2 (displazia moderată) şi CIN3 (displazia severă şi CIS).

– conform recomandărilor, necesită confirmare imediată prin colposcopie şi biopsie.

Asociaţiile profesionale medicale din domeniu au elaborat o serie de recomandări


asupra atitudinii de urmat în funcţie de rezultatele Pap testului (Fig. 1 si Fig. 2).

Recomandari LSIL

2
Recomandari HSIL

B. Screening virusologic

Screeningul virusologic consta in detectia ADN/HPV si genotipare HPV (metoda de electie -


32 de genotipuri) .
Testele se pot realiza din leziune/raclat (regiunea anogenitală şi orală) sau din saliva :

Pot fi recoltate cu ajutorul unui tampon uscat:

 probe de la nivelul leziunilor (verucilor) din zona anogenitală şi orală, atât la femei cât
şi la bărbaţi;
 probe obţinute prin raclajul tegumentului şi mucoasei care acoperă penisul (gland, şanţ
balano-prepuţial, corpul penisului);
 probe obţinute prin raclajul mucoasei anale;
 probe obţinute prin raclajul mucoasei bucale şi faringelui;
 salivă prin badijonarea cavităţii bucale.

La barbat, raclatul uretral se obţine cu ajutorul periuţei Se inserează blând periuţa în uretră cca
2-4 cm, se roteşte 3-5 secunde, se retrage uşor şi se introduce în tubul de transport; se va rupe
tamponul în dreptul semnului astfel că numai capătul tamponului va rămâne în tubul de
transport ce va fi închis etanş cu capacul.

De asemenea pot fi trimise la laborator probe de ţesut proaspăt obţinute prin biopsia
leziunilor anogenitale, orale precum şi a papiloamelor laringiene; probele tisulare vor fi
transportate în recipiente cu ser fiziologic.

B1. Detectia ADN/HPV se poate realiza prin teste moleculare de tip PCR.

B2. Genotiparea HPV se poate realiza prin metoda LIPA (INNO-LiPA HPV),
pentru care exista truse comerciale, prin care sunt detectate 32 de genotipuri HPV

3
Unele laboratoare folosesc metoda de multiplexare (multiplex HPV PCR) prin
tehnologia xMAP (Luminex), facand detectia mai multor genotipuri HPV. Sunt detectate
următoarele tipuri HPV cu risc crescut: 16, 18, 26*, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53*, 56, 58, 59,
66*, 68, 73, 82 (* riscul oncogen nu este clarificat). De asemenea pot fi determinate şi
următoarele tipuri HPV cu risc scăzut: 6, 11, 42, 43, 54, 57, 70, 72, 90.

Unele studii considera metoda multiplex HPV PCR mai sensibila in detectarea
ADN/HPV fata de genotiparea INNO-LiPA. Valori de referinţă – ADN/HPV nedetectabil
pentru genotipurile analizate.

B3. Detectia calitativa a ARNm E6/E7 HPV pentru evalurea riscului de progresie si de
transformare maligna

Testele de detectie a ADN prezinta o limitare importanta prin faptul ca majoritatea infectiilor
HPV au un caracter tranzitoriu, iar valoarea predictiva pozitiva a unui rezultat ADN-HPV
pentru dezvoltarea leziunilor cervicale cu risc crescut este destul de scazuta.

Pentru a pune in evidenta activitatea oncogena HPV au aparut teste care se bazeaza pe
detectarea ARN-ului mesager pentru proteinele E6/E7 initial din 5 tipuri HPV cu risc crescut
(16, 18, 31, 33, 45) si apoi din 14 tipuri HPV oncogene: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,
58, 59, 66 si 68. Testele bazate pe ARN au valoare predictiva in ceea ce priveste riscul pentru
dezvoltarea cancerului cervical. S-a constatat ca nivelurile ARNm E6/E7 inregistreaza cresteri
proportionale cu severitatea leziunilor, astfel ca detectia produsului de transcriptie ar avea o
valoare prognostica mai mare si ar putea imbunatati specificitatea si valoarea predictiva
pozitiva a ADN-HPV in screening.

Detectia calitativa a produsului de transcriptie E6-E7 pentru tipurile HPV cu risc crescut poate
sa evalueze specific riscul de progresie si de transformare maligna in special la femeile cu
citologie ASC-US sau LSIL, precum si la cele cu citologie normala si ADN-HPV pozitiv.

Metoda utilizata este TMA (amplificare mediata de transcriptie) care realizeaza amplificarea
acidului nucleic folosind 2 enzime: ARN polimeraza si reverstranscriptaza. Tehnica are
avantajul unor rezultate rapide (se produc 100-1000 de copii pe ciclu de amplificare).

Un rezultat pozitiv pentru HPV E6/E7 ARNm are un alt impact clinic decat cel pentru HPV-
ADN, in sensul ca indica un potential crescut de transformare maligna a epiteliului scuamos
cervical.