22/04/2021

CULTIVAREA VIRUSURILOR

Cultivarea virusurilor
• sunt parazite intracelulare absolute,
• se cultivă numai în culturi celulare, embrioni de găină, animale
de laborator sensibile.
• Culturi celulare- celule provenite din ţesuturi animale sau
umane, adulte sau embrionare, normale sau neoplazice, plasate
intr-un mediu adecvat (nutrienţi, pH, temperatură) rămân
viabile şi se multiplică
• Aceste culturi de celule se clasifică în:
• culturi primare de celule,
• tulpini de celule diploide (obtinute din tes. embrionare)
• linii permanente de celule (provin din tumori canceroase sau
mutante).

1
 22/04/2021

Medii pentru culturi celulare

• Sunt medii de creştere (Hanks, Eagle).
• Toate sunt soluţii apoase care conţin:
• nutrienţi (aminoacizi, vitamine, glucoza, săruri minerale);
• au un sistem tampon la pH- 7,4;
• un indicator, roşu fenol, pentru monitorizarea pH- lui, se incubează
la 37° C, 24-48 ore. [Pentru inocularea culturii de celule cu virus, mediul de
creştere este îndepărtat, iar pe filmul celular spălat, se depune produsul patologic
prelucrat (omogenizare, îndepărtarea debriurilor celulare şi bacteriilor prin
centrifugare şi apoi tratat cu antibiotice). După absorbţia virusului pe receptorii
celulari, surplusul din inocul este îndepărtat, iar filmul celular va fi acoperit cu un
mediu de întreţinere.]

Culturi de organe
• Sunt mici fragmente de trahee sau bronhii, intestin subţire proximal,
trompe uterine, etc., menţinute în mediu de cultură adecvat , păstrându-
şi structura şi funcţiile mai multe zile.

2
 22/04/2021

Urmărirea replicării virale în culturi celulare

• Efectul citopatic este urmărit microscopic (rotunjire, sinciţii)
• Apariţia în supernatant a unei hemaglutinine (virusurile gripale, paragripale,
arbovirusurile) care aglutinează hematiile anumitor specii de animale sau păsări în
condiţii de pH, temperatură sau a unui antigen fixator de complement (virusurile
rujeolic, poliomielitic).
• Hemadsorbţia- adsorbţia eritrocitelor pe membrana modificată a celulelor care au
replicat un virus, poate fi mai precoce decât efectul citopatic, iar uneori este singura
modalitate de depistare a virusului în culturi celulare.
• Incluziile virale - sunt urmărite prin coloraţia hemaulan-eozină, Giemsa.
• Coloraţia imunoflorescentă depistează antigenele virale în celulele infectate.
• Interferenţa virală- Unele virusuri ca: virusul rubeolic, adenovirusuri, nu determină
efect citopatic. Depistarea lor se face indirect prin incapacitatea celulelor infectate
de a replica un virus sigur citopatogen (virusul ECHO)
• Transformarea celulelor normale în celule canceroase (transformare malignă) printr-
un virus oncogen (v. SV 40, v. sarcomului Rous), se traduce prin pierderea inhibiţiei
de contact cu focare de aglomerări celulare.

Embrionii de găină
• Ţesutul embrionar de găină în vârstă de 6-14 zile, ca şi membranele embrionare
permit cultivarea virusurilor, rickettsiilor, chlamidiilor, după inoculare, pe membrana
chorioalantoidă (poxvirusuri, v. herpetice), în cavitatea alantoidiană sau în cavitatea
amniotică (v. gripale, paragripale, urlian, rujeolic), sau în sacul vitelin (rickettsii,
chlamidii). Viabilitatea embrionului este verificată cu ovoscopul în cameră obscură.
• Embrionii vii se inoculează, se incubează la 35 C timp de 3- 5 zile şi se refrigerează
peste noapte la 4° C (pentru a se evita hemoragia în cursul recoltării )
Creşterea virusului în embrion poate determina:
• moartea acestuia,
• apariţia de peteşii pe membrana chorioalantoidă,
• acumularea de hemaglutinmă in lichidul amniotic sau alantoidic (v. gripale).

3
 22/04/2021

Animale de laborator
• Se folosesc numai când receptivitatea celorlalte gazde de laborator
este nesatisfăcătoare (v. rabic, arbovirusurile).
Replicarea virală este demonstrată prin:
• boala manifestă a animalului, eventual decesul;
• urmărirea virusului în organele ţintă (bogate în celule receptive pentru
virusul inoculat);
• prin hemaglutinare (arbovirusurile);
• infecţiozitatea omogenatelor (v. Coxsackie);
• examene histopatologice care pot depista leziuni inflamatorii,
degenerative, dar mai ales incluzii virale, uneori caracteristice
(corpusculii Babeş-Negri, în neuronii infectaţi cu virus rabic).

4
 LUCRAREA 1
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR

Nr.crt. VIRUSOLOGIE
METODE
DIRECTE
1 Recoltarea Diferita in functie de pp recoltat
produsului
patologic
2 Examenul 1. examen macroscopic-nu
direct al
produsului 2. examen microscopic
patologic o evidenţierea incluziilor
virale – microscopie optică
o microscopie electronică

3. reacţii antigen-anticorp
(evidenţierea antigenului)

4. detectarea ADN-ului - reacţii de hibridizare, amplificare genică

(PCR)
3 Cultivare Cultivarea virusurilor

 culturi celulare, linii celulare

 animale de laborator
 oul de găină embrionat
4 Identificare Identificarea virusului izolat

1.prin examen microscopic

2. modificările caracteristice
apărute pe
 culturile celulare,
 OGE
 animale de experienţă

3. reacţii antigen-anticorp

1
 4. detectare a ADN–ului -reacţii de hibridizare, amplificare genică (PCR)
METODE
INDIRECTE
5 1. detectarea anticorpilor din
serul bolnavilor
o Seroconversia: cresterea
titrului de anticorpi în probele de ser recoltate la interval de 10-14 zile
o (demonstrarea unei infecţii
recente, actuale

2
 22-Apr-21

Caractere generale ale

virusurilor; infectia cu virusuri
gripale, hepatitice si HIV.
Diagnosticul de laborator in
infectiile virale

Virusurile
• reprezintă structuri acelulare cu potenţial
infecţios, cu dimensiuni de ordinul nm (20-400
nm).
• Genomul viral este constituit dintr-un singur
tip de acid nucleic ( ADN sau ARN).
• Virusurile sunt lipsite de metabolism propriu,
fiind paraziţi obligaţi intracelulari.
• Nu cresc şi nu se divid, se reproduc în celule
vii, nu pot fi cultivate pe medii artificiale.
• Manifestă rezistenţă naturală la antibiotice.

1
 22-Apr-21

Clasificarea virusurilor
• după tipul AN (cu genom ARN/ADN);
• după dimensiuni (mici: 20-50 nm; medii: 50-150 nm, mari:
peste 150 nm);
• după tipul de simetrie a capsidei (helicoidală, cubică,
mixtă);
• după compoziţia chimică:
-virusuri simple constituite din acid nucleic (AN) şi
înveliş proteic - capsida (ansamblu numit nucleocapsidă);
-virusuri complexe alcătuite din nucleocapsidă şi un
înveliş extern, lipoglicoproteic (supercapsidă, peplos);
• după gazdă (om, animal, insectă, bacterie);
• după sensibilitatea în mediul extern, la substanţe chimice,
etc.

Diagnosticul hepatiei virale A

• a fost descoperit în anul 1972, familia PICORNAVIRIDAE (aparţine genului
HEPARNAVIRUS)
• se prezintă sub forma unei particule sferice de 27 nm care conţine ARN ss
nesegmentat, simetrie cubica, neanvelopat.
• Hepatita A este cea mai uşoara formă de hepatită, se vindecă în 99% din cazuri,
• se transmite pe cale orală prin apă şi alimente infectate, mâini murdare, alimente
crude consumate nespălate;
• Incubatie medie: 25 saptamani
• virusul se elimina prin materiile fecale; de obicei, boala se vindecă rapid şi complet,
nu duce la hepatită cronică.
• După o scurtă perioadă de incubaţie, virusul este excretat în fecale, fazele
preicterică şi icterică apărând la aproximativ două săptămâni.
• Forme usoare sau anicterice se intalnesc frecvent la copii.
• Încă de la debutul acestor faze apar de regulă şi IgM anti-HAV şi cresc
transaminazele (citoliza hepatica).
• Nivelurile crescute ale IgM anti-HAV sunt prezente doar în faza acută şi dispar în
aproximativ 10 săptămâni
• Din acest moment, apar IgG anti-HAV care conferă protecţie.
• Profilaxia nespecifica se realizează prin izolarea bolnavilor şi controlul contacţilor,
educaţie sanitară, protecţia apei şi alimentelor, controlul igienico-sanitar.
• profilaxia specifică – administrarea de gamaglobulină (pre si post expunere)
• - imunizare activa prin vaccinare (vaccin inactivat)

2
 22-Apr-21

Diagnosticul hepatiei virale A

Produs patologic:
• sânge, salivă - pentru evidenţierea anticorpilor;
• materiile fecale;
• biopsie din ficat pentru evidenţierea virusului.
Examen direct (nu se practică de rutină) se face din biopsie hepatică prin
reacţii imunohistochimice şi din materii fecale prin reacţii antigen-anticorp
Izolare: nu se practică de rutină; deşi virusul poate creşte pe linii celulare.
Diagnosticul serologic urmăreşte dinamica apariţiei anticorpilor:
• - IgM: apar odată cu primele simptome de boală - ajung la titru maxim în 1-
3 săptămâni, dispar în 3-6 luni;
• - IgG: apar după aproximativ o lună de la infecţie, ajung la titru maxim în 3-6
luni, apoi persistă la un nivel detectabil toată viaţa;
• - anticorpii se detectează prin ELISA.
• Diagnostic molecular: prin RT-PCR (epidemiologie)

Diagnosticul Hepatitei virale B

• este o boală de natură infecţioasă, agentul patogen fiind virusul hepatitei B
(HBV).
• Virusul este de tip ADN (adenovirus) (aparţine familiei Hepadnaviridae), iar
boala mai este cunoscută şi sub denumirea de hepatită serică.
• Particula virală de 27 nm este alcătuită dintr-o anvelopă lipoproteică care
conţine antigenul HBs şi o nucleocapsidă centrală (miez) care conţine ADN
circular şi ADN-polimerază. Capsida formează antigenul central (HBc) căruia îi
este asociat (sub formă mascată) antigenul HBe.
• Virusul hepatitei B este prezent în sange şi în ţesuturi, se elimină prin salivă,
lacrimi, secreţii genitale, spermă, sînge menstrual, care sunt şi principalele
elementele de transmitere a bolii;
• se poate transmite de la mamă la copilul nou născut în timpul sarcinii;
• din 100 de bolnavi adulţi cu hepatită acută B, 93 se vindecă, 5 fac hepatită
cronică şi 2 mor prin complicaţii ale hepatitei cronice (ciroză sau cancer de
ficat);
• dacă hepatita acută B a fost făcută în copilarie, sub vârsta de 5 ani, riscul de a
deveni purtator este de cca 90%, iar cel de cronicizare este de 25-80%.
• Dacă hepatita acută a fost contractată în perioada de adult, riscul de
cronicizare este mult mai mic de 3-10%.

3
 22-Apr-21

Diagnosticul Hepatitei virale B

Produs patologic:
• - sânge pentru detectarea markerilor virali (antigene şi anticorpi);
• - ţesut hepatic - detectarea antigenelor virale;
• - virusul se mai elimină prin secreţii genitale, salivă.
Izolare: virusul HBV nu este cultivabil.
Diagnostic:
• Cei mai utilizaţi markeri virali în aprecierea evoluţiei sau nu a infecţiei cu
virus B sunt:
Antigenul HBs (Ag HBs) o proteina de la suprafaţa virusului B al hepatitei:
• - apare la 4 săptămâni de la contactul cu virusul B;
• - în hepatita cronică persistă mai mult de 6 luni;
• - dispare în caz de vindecare dar uneori persistă în organism chiar dupa
vindecare, situaţie numită de “purtător sănătos (inactiv) de virus B
hepatitic”.
Anticorpii HBs (Ac HBs) sunt anticorpii impotriva proteinei S a virusului:
• - apar atunci când se elimină virusul din corp, dar şi în cazul vaccinării;
• - prezenţa sa în organism, nu înseamna că ai virusul, ci ca ai anticorpi
împotriva virusului, obtinuţi prin vindecarea unei hepatite sau în urma
vaccinarii împotriva virusului B;
• - cine are acesti anticorpi, este imun la virusul hepatitei B.

Diagnosticul Hepatitei virale B

Anticorpii impotriva HBc (Anti-HBc) sunt anticorpii impotriva proteinei C, prezenţa lor
nu înseamnă vindecarea hepatitei, decât dacă se asociază şi cu prezenţa AcHBs.
Sunt doua tipuri de anticorpi anti HBc: Anti HBc IgM, care arată un contact recent
cu virusul hepatitei B (infecţie acută) de cel mult 6 luni; Anti HBc IgG, care arată o
infecţie veche (cronică) cu virusul hepatitei B şi faţă de cel anterior, persistă toată
viaţa (nu numai 6 luni).
Antigenul HBe (Ag HBe) este o proteina a virusului hepatitei B:
• - se găseşte în sînge doar dacă este prezent şi virusul;
• - de obicei dispare la vindecarea bolii;
Anticorpii impotriva HBe (Anti HBe) sunt anticorpii împotriva proteinei E a virusului B:
• apariţia lor într-o hepatită acută înseamnă vindecarea bolii;
• persistă o perioadă îndelungată în sânge;
• apariţia lor într-o hepatită cronică poate însemna vindecarea sau lipsa de înmulţire
a virusului.
Acidul nucleic al virusului B (AND-VHB):
• - detecţia sa în sânge înseamnă prezenţa virusului;
• - în funcţie de concentraţia sa, se poate spune că persoana are:
• hepatită cronică cu virus B, dacă concentratia >2.000 UI/ml;
• purtator inactiv de virus B, dacă concentraţia <2.000 UI/ml;

4
 22-Apr-21

Diagnosticul Hepatitei virale B

Markeri virali detectabili din sânge prin ELISA:

• - Ag HBs, Ac anti HBs;

• - Ag HBe, Ac anti HBe;
• - Ag HBx, Ac anti HBx (cercetare);
• - Ac anti HBc;
• - din sânge se mai poate evidenţia ADN-ul viral
prin PCR.

Dinamica apariţiei markerilor virali în sânge

5
 22-Apr-21

Profiluri serologice posibile în hepatita virală B

Prezenţa AgHBe = infectivitate:

• - AgHBs + IgM antiHBc = hepatită acută;
• - AgHBs + Ig totale antiHBc (> 6 luni) = infecţie persistentă;
• - AgHBs + Ig totale antiHBc + AgHBe (> 6 luni) = hepatită
cronică.

Prezenţa Ac anti HBs = vindecare:

• - Ac anti HBs + IgM anti HBc (titru crescut) = infecţie
recentă, vindecată;
• - Ac anti HBs + Ig totale antiHBc (titru scăzut) = infecţie în
antecedente, vindecată;
• - Ac anti HBs (fără alţi markeri) = imunitate postvaccinală;
• - Persistenţa AgHBs după 6 luni = infecţie persistentă

Diagnosticul Hepatitei virale C

• Virusul hepatitei virale C (HCV) este denumit şi virusul posttransfuzional,
descoperit 1989.
• Aparţine familiei Flaviviridae şi se prezintă sub forma unei particule cu
diametrul de 50-60 nm care conţine o anvelopă lipidică (ce ecraneza
antigenitatea) cu proteine transmembranare şi ARN ss.
• Majoritatea subiecţilor infectaţi cu HCV prezintă modificări clinice minime
şi doar câţiva necesită spitalizare.
• Perioada de incubaţie este de 3-150 zile (cel mai frecvent fiind de 8
săptămâni).
• Mai mult de 60% din cazurile infectate prezintă niveluri uşor crescute ale
transaminazelor pe o perioadă mai mare de un an, iar biopsia hepatică
arată în majoritatea cazurilor caracteristici de afectare hepatică, iar în 10%
din cazuri ciroză.
• Debutul formei acute este nespecific şi la 25% din cazuri este urmat de
icter.
• Boala nu poate fi diferenţiată de hepatita B doar prin examen clinic.
• Virusul este prezent în sânge şi ţesuturi, care reprezintă principalele
elemente de transmitere;
• transmiterea prin contact sexual şi de la mamă la copil în timpul sarcinii
sunt foarte rare; poate să evolueze către hepatită cronică mai frecvent
decât hepatita B - 80% din cazuri, aceasta putând să se complice cu ciroză
sau cancer de ficat.

6
 22-Apr-21

Diagnosticul Hepatitei virale C

• Seroconversia dupa infectie este tardivă (4-10 saptamani),
aceasta”fereastra serologica” mentine riscul transmiterii
VHC prin transfuzii.
• prezenţa anticorpilor este caracteristică mai ales perioadei
de convalescenţă şi hepatitei cronice.
• Doar în 55% din cazuri anticorpii apar în prima lună; 15%
din cazurile de hepatită C sunt seronegative.
• De asemenea, există reacţii fals pozitive obţinute prin
utilizarea truselor ELISA anti-HCV.
• Cea mai sigură metodă de diagnostic este determinarea
ARN VHC din plasmă prin PCR (polymerase chain reaction)
la subiecţii pozitivi în urma unui test ELISA.
• În prezent, sângele donatorilor este testat prin ELISA
pentru HBV, HCV şi HIV.

Diagnosticul Hepatitei virale C

Produs patologic:
• - sânge;
• - ţesut hepatic.
Examen direct: evidenţierea acidului nucleic din sânge
(viremie) prin PCR.
Izolarea nu se practică.
Diagnostic serologic:
• - detectarea anticorpilor anti VHC prin ELISA,
metode radioimune folosind antigene recombinate;
Metode de detectie a ARN viral prin:
- tehnici de amplificare a tintei(RT-PCR)
- tehnici de amplificare a semnalului (Quantiplex HCV
RNA)

7
 22-Apr-21

Diagnosticul hepatiei virale D

• Virusul hepatitei D (HDV) a fost descoperit în 1976 şi se mai numeşte şi agentul delta.
• Este un virus hepatotropic defectiv, întrucât replicarea şi infectivitatea sa se realizează
doar în prezenţa HBV de care depinde sinteza anvelopei externe.
• Calea de transmitere este cea parenterală.
• Infecţia cu HDV este acută sau cronică.
• Există două forme de infecţie acută:
- coinfecţia cu HBV. Ea se poate asocia cu cazuri de hepatită fulminantă. Este
sugerată doar de serologie (apariţia anticorpilor anti-HDV);
- suprainfecţia cu HDV a unor cazuri de hepatită B cronică; în 80-90% din cazuri se
trece la cronicizarea infecţiei, cu persistenţa HDV în ficat.
• Infecţia cronică are un prognostic prost pentru bolnav. 70-80% din aceste forme
evoluează spre ciroză (15% în mai puţin de doi ani).
• În practică, serologia determină doar IgM anti-HDV. Evoluţia favorabilă este dată de
scăderea rapidă a titrului de anticorpi.
• De asemenea, se mai pot determina (mai greu şi nu curent) antigenul HDV şi ARN
viral, utile în cazurile de cronicizare.

Produs patologic:
• - sânge;
• - ţesut hepatic.
Diagnostic serologic:
- evidenţierea anticorpilor anti HDV prin ELISA.
Diagnostic molecular
• - evidenţierea ARN-ului viral din sânge

Diagnosticul hepatitei virale E

• Virusul hepatitei E(HEV) a fost descoperit în 1988 şi
aparţine familiei calicivirusurilor.
• Nu prezintă anvelopă externă, are dimensiuni de 32-34
nm şi conţine ARN.
• Infecţia are o cale de transmitere oro-fecală şi se
întâlneste în regiuni ale lumii a treia cu condiţii precare
de igienă (Africa de Nord, Orientul Apropiat şi Mijlociu).
• Are o perioadă de incubaţie de 21-42 de zile, iar boala
survine, de obicei, acut şi nu se însoţeşte de icter.
• De menţionat este însă gravitatea bolii la gravide,
mortalitatea cazurilor infectate ajungând la 20%. În
rândul populaţiei generale mortalitatea este de 1-2%.
• Virusul hepatitei E se transmite enteral, determinând
forme uşoare de boală, cu excepţia femeilor gravide la
care boala poate avea o evoluţie letală.
• Nu s-au descris cazuri la noi în ţară.

8
 22-Apr-21

Hepatita F
• Hepatita F (hepatita non-A-E) a fost raportată
recent în cazuri izolate din Europa de Vest, S.U.A. şi
India.
• HFV a fost izolat din fecalele subiecţilor infectaţi,
unde apare sub formă de particule cu dimensiuni de
27-37 nm care conţin o moleculă de ADN
dublucatenar de aproximativ 20 kb.
• poate fi pus în evidenţă în urma examinării prin
microscopie electronică a scaunului pacienţilor.
• Sunt suspecte de a prezenta infecţia acele cazuri de
hepatită a căror etiologie nu poate fi determinată în
urma testării pentru celelalte virusuri.

Diagnosticul de laborator în gripă

• Gripa este o boală infecţioasă acută foarte contagioasă,
obişnuit autolimitată, febrilă, cauzată de virusul gripal.
• Virusul gripal (Myxovirus influenzae):
• - aparţine familiei Orthomyxoviridae;
• - are o forma sferică, cu diametrul de 80-120 nm;
• - conţine un lanţ unic negativ ARN compus din 8 fragmente
care codifică 10 proteine virale;
• - la suprafaţa virusului se află structurile superficiale:
hemaglutinina (hemaglutinina asigura capacitatea virusului de
a se uni cu celula receptor) şi neuraminidaza (răspunde de
capacitatea particulei virale de a pătrunde în celula gazdă şi de
a ieşi din celulă după multiplicare);
• - structurile superficiale (hemaglutinina şi neuraminidaza) au
specificitate de subtip şi de tulpină; determină diferitele tulpini
ale unui tip de virus. Există 16 subtipuri antigenice ale
hemaglutininei (H1-H16) şi 9 ale neuraminidazei (N1-N9).

9
 22-Apr-21

Diagnosticul de laborator în gripă

Virusul gripal A:
• produce îmbolnăvirea de gravitate medie sau mare;
• infectează atât omul cât şi unele animale domestice (calul,
porcul, păsările);
• este responsabil de apariţia pandemiilor şi a epidemiilor
extinse;
Virusul gripal B:
• este capabil să îşi modifice structura antigenică;
• este prezent numai la om şi are manifestări epidemice
moderate, cu o evoluţie lentă.
Virusul gripei C:
• este destul de puţin studiat;
• infectează doar omul;
• simptomele bolii sunt foarte uşoare sau nu se manifestă
deloc;
• nu produce epidemii şi nu duce la urmări serioase;
• este cauza unor îmbolnăviri sporadice, în special, la copii;

Diagnosticul de laborator în gripă

Gripa prezintă periodicitate sezonieră, cazurile apărând în sezonul rece,
de obicei, iarna-primăvara:
• incubaţia: 18-36-72 de ore;
• debutul este brusc, uneori brutal cu frisoane, febră 39-40°C, mialgii,
cefalee, astenie;
• perioada de stare este dominată de semne toxice generale; sunt
prezente:
• - febra înaltă 3-5 zile, faciesul uşor congestionat, cefalee, dureri în
globii oculari, mialgii, astenie marcată, tulburări de somn, apatie,
iritabilitate;
• - manifestări respiratorii: catar nazal, enantem difuz, durere sau arsură
retrosternală (traheite), tuse uscată;
• - manifestări viscerale diverse: cardiovasculare, digestive;
• perioada de convalescenţă în care persistă manifestări ca astenie,
subfebrilitate, tuse, irascibilitate.
• Diagnosticul virusologic este necesar în cazul unei epidemii într-o
colectivitate (institut) sau când rezultatul poate influenţa decizia
terapeutică.

10
 22-Apr-21

Diagnosticul de laborator în gripă

Produs patologic:
• - secreţie faringiană, nazală sau nazofaringiană;
• - lichid de spălătură nazofaringiană;
• - aspirat bronşic;
• - ţesut pulmonar - diagnostic postmortem;
• - sânge:
Examen direct:
• - evidenţierea antigenelor virale: prin ELISA
• - se pot diferenţia tipurile A si B prin metode rapide (15-30 minute) -
imunocromatografice;
• - rezultatele negative se verifică prin metoda de cultivare;
• - evidenţierea acizilor nucleici virali RT - PCR.
Izolare şi identificare:
• Izolarea virusului este singura metodă care permite caracterizarea specifică a
subtipurilor circulante prin cultivare pe culturi de celule:
• efect citopatogen discret;
• replicarea virală se evidenţiază prin hemadsorbţie;
Diagnostic serologic:
• - evidenţierea seroconversiei: RFC;
• - reacţia de hemaglutinoinhibare

Diagnosticul de laborator în infecţiile cauzate de

rhinovirusuri
- agenţi etiologici ai răcelii comune.
Produs patologic:
• - lichidul de spălătură nazală - recoltat în perioada de
început a bolii, cînd excreţia virală este maximă.
Examen direct:
• - detectarea antigenelor virale în lichidul de spălătură
nazală - reacţia ELISA.
Izolarea şi identificarea:
• - linii celulare HeLa sau culturi de fibroblaşti umani;
• - efectul citopatic - rotunjirea celulelor.
Diagnostic serologic:
• - detectarea anticorpilor prin: reacţia de virus-
neutralizare; reacţia ELISA.

11
 22-Apr-21

Diagnosticul de laborator în infecţiile cauzate de virusul sinciţial

respirator (VSR)
• virusul sinciţial respirator face parte din familia Paramyxoviridae;
• afectează persoane de toate vârstele, în special copii până la 2-3 an;
• produce epidemii iarna;
• - simptome asemănătoare răcelii;
• - pneumonie;
• - bronşiolită (gravă la pacienţi imunodeprimaţi).
• Produs patologic:
• - lichid de spălătură nazofaringiană;
• - sânge.
• Examen direct:
• - evidenţierea antigenelor virale prin ELISA;
• - evidenţierea ARN prin RT-PCR.
• Izolare şi identificare:
• - cultivare pe linie HeLa sau HEp-2 - evidenţierea efectului citopatogen.
• Diagnostic serologic:
• - evidenţierea seroconversiei: RFC, ELISA.
•

Diagnosticul de laborator în infecţiile

cauzate de adenovirusuri
• determină apariţia unor infecţii cu localizări multiple:
• - infecţii respiratorii inferioare şi superioare;
• - conjunctivită;
• - cistită hemoragică;
• - gastroenterite;
• - infecţii la pacienţi cu transplant de organe.
• Produs patologic:
• - exsudat faringian, nazal, nazofaringian;
• - spută;
• - secreţie conjunctivală;
• - urină;
• - materii fecale;
• - sânge.
• Diagnostic direct:
• detectarea antigenelor virale prin RIF
• Izolare şi identificare:
• - linii celulare: efect citopatogen (aglomerarea celulelor în ciorchine), incluzii nucleare;
• - unele adenovirusuri enterice nu sunt cultivabile.
• Diagnostic serologic:
• determinarea seroconversiei:
• - RFC - detectează anticorpi specifici de grup;
• - RHAI - anticorpi specifici de tip.

12
 22-Apr-21

Diagnosticul de laborator în infecţia HIV

• HIV reprezintă prescurtarea în limba engleză a Human
Immunodeficiency Virus (Virusul Imunodeficienţei Umane).
• Aceste virusuri fac parte din categoria retrovirusurilor.
Virusurile HIV se împart în două grupe:
• grupa HIV-1 care cuprinde trei subtipuri M, N şi O. Virusurile
din subtipul M, cu răspâdirea cea mai largă în lume, se împarte
la rândul lui în subtipurile A şi B. Subtipul B este cel mai
răspândit în Europa de vest şi în America de Nord;
• grupa HIV-2 se împarte la rândul său în subtipuri. Cele mai
frecvente sunt subtipurile A şi B. Această subgrupă este
prezentă preponderent în Africa de vest, dar care se
răspndeşte însă şi în Europa; 15% din persoanele nou infectate
în Portugalia în 2005 au fost infectate cu virusul HIV-2.
• HIV-1 şi HIV-2 se aseamănă din punct de vedere al evoluţiei şi
simptomelor clinice a infecţiei. Evoluţia HIV-2 se pare că este
mai lentă decât HIV-1. Ambele virsuri au aceeaşi prezentare
sub microscopul electronic, dar se deosebesc prin greutatea
moleculară a proteinelor şi ordinea genelor.

Contaminarea
• Virusul HIV (HIV) se transmite prin sânge, spermă, secreţii
genitale, lichid cefalo-rahidian (LCR) şi lapte matern. Porţile de
intrare cele mai frecvente sunt rănile proaspete, sângerânde
din mucoasă (oculară, bucală, vaginală, anală) sau rănile
nevindecate sau insuficient protejate de pe oricare parte a
pielii corpului.
• Căile de transmitere:
• - vaginale sau anale datorate nefolosirii prezervativelor şi
practicilor sexuale aberante;
• - intravenoase prin folosirea în comun de toxicomani a acelor
de seringă;
• - transfuzii de sânge şi produse preparate din sânge;
• - intrauterine sau la naştere în timpul travaliului, cînd HIV se
poate transmite de la mamă la făt (în 10-30% din cazuri);
• - prin înţepături, tăieturi sau contactul direct pe pielea lezată,
neprotejată corespunzător în cazul personalului sanitar care
poate veni în contact cu secreţiile şi sângele pacientului
infectat.

13
 22-Apr-21

Virusului HIV

Stadii în evoluţia infecţiei cu HIV:

• - stadiul I: infecţie lipsită de simptomatologie sau cu simptome
ce pot fi întâlnite şi în alte afecţiuni infecţioase sau
neinfecţioase: dureri de cap, dureri musculare şi articulare,
febră, greţuri, scăderea poftei de mâncare, umflarea
ganglionilor (simetrică);
• - stadiul II: infecţie asimptomatică cu excepţia umflării
ganglionilor;
• - stadiul III: apar simptome ce reflectă prezenţa unor infecţii
fără gravitate: dureri de cap, febră, transpiraţii nocturne,
oboseală cronică, diaree, afecţiuni ale pielii, leziuni ale
mucoasei bucale;
• - stadiul IV: infecţie simptomatică: boli gastrointestinale, boli
pulmonare, boli neurologice;
• - stadiul V: pierdere de greutate, debilitate pronunţată,
afectarea sistemului nervos central.
• O infectare cu HIV-1 şi HIV-2 duce după o perioadă lungă de
incubare, de ani, chiar zeci de ani, la declanşarea bolii SIDA
(sindromul imunodeficienţei dobândite) letală.

14
 22-Apr-21

Diagnosticul de laborator în infecţia HIV

Produs patologic:
• sânge (pentru examen direct şi serologic):
• ser;
• plasmă pe EDTA;
• sânge integral;
• secreţii genitale, salivă, urină, LCR, lapte de mamă,
unde poate fi identificat HIV;
• lapte de mamă şi salivă, unde pot fi găsiţi anticorpii
specifici.
În cursul diagnosticului infecţiei cu HIV se evidenţiază:
• antigene virale;
• ARN viral, ADN proviral din limfocite;
• anticorpi: Ac. anti core, Ac. antienvelope.

Dinamica producerii markerilor virali

• Antigenul p24:
• - se găseşte în serul persoanei infectate;
• - detectabil în infecţiile recente, înainte de apariţia anticorpilor;
• - dispar după apariţia anticorpilor anti p24;
• - reapar în stadiile tardive de boală (SIDA), semnificând replicare
virală intensă şi un prognostic grav.
• Anticorpii anti p24:
• - apar la 3-12 săptămâni de la infecţie. Perioada de la infecţie până
la apariţia lor se numeşte “fereastră imunologică”.
• Anticorpii anti gp120:
• - nu au rol protector;
• - sunt folosiţi ca marker de diagnostic.

15
 22-Apr-21

Protocolul standard de diagnostic HIV

Teste rapide de diagnostic („point-of-care”, „bedside” tests): Se bazează pe 4
principii: aglutinare, immunodot, imunofiltrare sau imunocromatografie. Se
pot efectua din sânge capilar/venos. Rezultatele se obţin în 15-30 min.
Dg. de triaj
• se evidenţiază anticorpii prin metoda ELISA, prima etapă de diagnostic a
infecţiei HIV (screening), având sensibilitate de aproape 100% şi specificitatea
de 99,5%:
• - generaţia I: se foloseşte lizatul total viral de pe culturi de limfocite.
• - generaţia II: se folosesc antigene clonale;
• - generaţia III: se folosesc antigene recombinate;
• - generaţia IV: metode combinate care testează simultan prezenţa anticorpilor
anti HIV şi a antigenului P24; Metodele de generaţie III şi IV au sensibilitate şi
specificitate ridicate, dar este posibilă şi apariţia unor rezultate false:
• - fals negative [„fereastra imunologică”, diferite tipuri virale (HIV-1, HIV-2) şi
subtipuri (HIV-1-N, HIV-1-O, HIV-1-M)];
• - fals pozitive (probe de sânge alterate, incorect etichetate sau schimbate,
greşeli de laborator, contaminarea probelor).
• Rezultatul pozitiv al testării ELISA se raportează ca „ser reactiv” şi nu confirmă
diagnosticul pozitiv de infecţie HIV.
• În cazul pozitivării se face o retestare printr-o metodă cel puţin la fel de
sensibilă din aceeaşi probă de sânge (determinare ELISA la centre de
referinţă).

16
 22-Apr-21

Protocolul standard de diagnostic HIV

Dg. de confirmare
• RT- PCR (DETERMINAREA VIREMIEI)
Dg. pentru monitorizarea incarcarii virale
- Se face din mononuclearele periferice sau din plasma prin: PCR
(polymerase chain reaction), b-DNA (branched DNA), NASBA
(nucleic acid sequence-based amplification), LCR (ligase chain
reaction).
- Initierea timpurie a terapiei se realizeaza atunci cand
incarcarea virala creste >50.000 copii ARN HIV/ ml, iar
limfocitele CD4 < 350/ml
- Se urmareste scaderea incarcarii virale <400 copii/ ml
(preferabil <50 copii/ ml)
- - Incarcarea virala se detrmina de cel putin 2 ori/an
Izolarea virusului:
- rezervată pentru cazuri speciale, se face în laboratoare
specializate;

17
 LUCRAREA 5.
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR

Nr.crt. BACTERIOLOGIE VIRUSOLOGIE PARAZITOLOGIE

METODE
DIRECTE
1 Recoltarea Diferita in functie de pp Diferita in functie Diferita in functie de pp
produsului recoltat de pp recoltat recoltat
patologic
2 Examenul 1. examen 1. examen Examen
direct al macroscopic macroscopic-nu coproparazitologic:
produsului
patologic 2. examen microscopic 2. examen 1. examen
– microscopie optică microscopic macroscopic
o preparat nativ o evidenţierea
o coloraţie negativă incluziilor 2. examen microscopic
o coloraţie simplă virale – o metode directe
o coloraţii compuse microscopie optică preparat nativ, în ser
o microscopie fiziologic
3. evidenţierea electronică preparat nativ în
antigenelor bacteriene soluţie lugol
prin metode serologice frotiu colorat
o metode de examinare
4. detectarea ADN-ului 3. reacţii antigen- în strat gros
microbian (reacţii de anticorp o metode de
hibridizare, amplificare (evidenţierea concentrare
genică – PCR) antigenului) o metode larvoscopice
o amprenta anală
4. detectarea
ADN-ului - reacţii 3. detectarea ADN-ului
de hibridizare, - reacţii de
amplificare genică hibridizare, amplificare
(PCR) genică
(PCR)
3 Cultivare Izolarea germenului în Cultivarea Cultivarea paraziţilor
cultură pură virusurilor  însămânţarea se
 însămânţarea si face
cultivarea pe  culturi pentru paraziţii
medii de celulare, unicelulari pe medii
cultură linii încălzite la 37°C, 1sau
 inoculare la celulare mai multe zile
animale de  animale de  animale de
laborator laborator laborator
 oul de
găină

1
 embrionat
4 Identificare Identificarea Identificarea
germenului izolat din virusului izolat
cultură pură
1. cercetarea 1.prin examen
caracterelor de microscopic
cultură si
morfotinctoriale
2. modificările
2.cercetarea caracteristice
caracterelor apărute pe
biochimice si de  culturile
metabolism celulare, 1.reacţii antigen-
 OGE anticorp
 animale de
experienţă

3.determinarea 3. reacţii antigen-

structurii antigenice anticorp
prin: 2. tehnici de detectare
reacţii de aglutinare a ADN
reacţii de precipitare microbian
reacţii de umflare a
capsulei
4. detectare a
4. tehnici de detectare ADN–ului -reacţii
a ADN de hibridizare,
microbian amplificare genică
(PCR)

5. Determinarea
patogenităţii
germenului izolat
prin:
o teste in vitro
o teste in vivo (boala
experimentală)
5 Antibiograma DA
METODE
INDIRECTE
6 1. detectarea 1. detectarea 1. Detectarea
anticorpilor din serul anticorpilor din anticorpilor din serul
bolnavilor (anticorpii serul bolnavilor bolnavilor
se urmăresc în o Seroconversia: o anticorpii se urmăresc
dinamică) cresterea în
titrului de anticorpi dinamică

2
 în probele de ser reacţii biologice
recoltate la interval cutanate de diagnostic
de 10-14 zile (IDR) - rar
o (demonstrarea
unei infecţii
recente, actuale

Alt model schema simplificata:

Caractere generale:
Diagnosticul de laborator consta in:
I. Diagnosticul bacteriologic
1. Recoltarea produselor patologice;
2. Examnarea macroscopic si microscopic (prin examen direct) al produsului patologic;
3. Insamintarea si izolarea;
4. Citirea si interpretarea rezultatelor;
5. Cercetarea caracterelor de patogenitate:
- teste de patogenitate ” in vitro”;
- teste de patogenitate “in vivo”.
6. Cercetarea sensibilitatii la actiunea bacteriofagilor;
7. Cercetarea sensibilitatii la antibiotic si chimioterapice.
II. Diagnostic imunologic

3
LP 6 Parazitologie
Examen coproparazitologic
Examenul coproparazitologic reprezintă analiza parazitologică a materiilor fecale în vederea
depistării paraziţilor intestinali. Examenul este indicat pentru diagnosticarea parazitozelor
intestinale şi monitorizarea răspunsului la tratamentul antiparazitar (la 3-4 săptămâni după
finalizarea tratamentului în cazul infestării cu protozoare şi la 1-2 săptămâni în cazul
infestării cu helminţi). Examenul coproparazitologic evidenţiază elementele parazitologice
atât macroscopic, cât şi microscopic.
Examenul coproparazitologic este recomandat:
a. persoanelor cu semne şi simptome sugestive pentru o parazitoză intestinală:
- tulburări gastrointestinale: inapetenţă, greaţă, vărsături, eructaţii (râgâit), flatulenţă,
dureri şi crampe abdominale, diaree, prurit perianal;
- tulburări neurologice, anemie, scădere în greutate sau stagnare staturoponderală la
copii, subfebră;
b. pacienţilor asimptomatici (purtători sănătoşi) care au un context epidemiologic pozitiv.
Principalii paraziţi incriminaţi în apariţia de parazitoze sunt:
- protozoare: Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Trichomonas intestinalis.
- nematode: Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis (oxiuri), Trichiurius
trichiura, Strongyloides stercoralis;
- trematode: Fasciola hepatica;
- cestode: Taenia solium (porc), Taenia saginata (vită), Diphyllobotrium
latum(determină anemia de tip Bierman (pernicioasă), în cazul consumului de peşte
răpitor şi icre: ex. ştiucă, biban), Hymenolepis nana si diminuta, Echinococcus
granulosus şi multilocularis.
Material patologic: materii fecale vizând îndeosebi zonele de scaun cu modificări (sânge,
mucus, puroi).
Recoltarea probelor. La un scaun de constipaţie recoltarea se face atât din porţiunea dură, cât
şi din porţiunile mai moi. De obicei, chisturile (elemente de rezistenţă şi de înmulţire ale
parazitului) se găsesc în toate părţile scaunului, dar mai ales în cele dure, pe când elementele
vegetative se găsesc în cele moi.
Se recomandă următoarele:
- scaunul nu trebuie să fie contaminat cu urină (urina poate distruge elementele
parazitare vegetative), cu substanţe de contrast (sulftat de bariu, gastrografin) sau
cu ulei;
- recoltarea trebuie să se facă în condiţii de regim alimentar obişnuit;
- anterior recoltării, pacienţii nu trebuie să fi efectuat o investigaţie radiologică a
tractusului gastrointestinal cu substanţe de contrast baritate (în ultimele 24 de ore);
nu trebuie să fi luat medicamente cu bismut, uleiuri minerale, tetraciclină,
metamucil, magneziu, antiamoebiene, antidiareice, antiacide (în ultima
săptămână).
Recoltarea se face într-un recipient steril cu volumul de 30 ml prevăzut cu spatulă/lopăţică
ataşată de capac (coprorecoltor). Se recoltează 5-15 g materii fecale (sau 10-15 ml materii
fecale moi). Probele înainte de transport la laborator pot fi păstrate timp de 2-4 ore la
temperatura camerii sau 24 de ore la temperatura de refrigerare 2-8oC.
Analiza macroscopică a probei de materii fecale. Se urmăreşte aspectul, consistenţa şi
prezenţa elementelor parazitare: proglote de tenie, larve de Ascaris lumbricoides, Enterobius
vermicularis.
– proglote de Taenia spp.
Proglotele (1000-2000) de Taenia saginata (rar vizibile in materiile fecale, deoarece se
elimina prin orificiul anal intre defecatii) sunt dreptunghiulare de 2 cm lungime/0,5 cm
latime, au uterul bine dezvoltat, prevazut cu 20-30 de ramificatii dicotomice, pline cu
oua(100.000) si au miscari periodice caracteristice.

Proglotele (1000) de Taenia solium au dimensiuni de 2 cm lungime/6-8mm latime, uterul lor

prezinta 7-13 ramificatii dentritice (pline de oua -80.000. Se elimina odata cu scaunul fecal.

– viermi adulti de Ascaris lumbricoides.

Au corpul cilindric, de culoare roz-albicioasa si prezinta striuri discrete longitudianle. Se va
preciza sexul viermelui eliminat. Femelele au 20-30 cm lungime/5-6 mm grosime. Masculii
sunt mai mici, au 15-20 cm lungime si extremitatea posterioara incurbata.

Examenul microscopic direct implică examinarea între lamă şi lamelă a unui preparat
proaspăt de materii fecale cu ser fiziologic sau cu soluţie Lugol.
Materiale necesare:
- ser fiziologic, soluţie de clorură de sodiu 8,5o/oo (8,5 g NaCl se dizolvă în 1000 ml
apă distilată);
- soluţie Lugol (10 g iodură de potasiu şi 5 g iod metalic se dizolvă treptat în 100 ml
apă distilată);
- lame microscopice;
- lamele microscopice;
- pipete Pasteur.

Tehnica de examinare în cazul examenului direct în ser fiziologic:

- se pune pe lama microscopului 1 picătură de ser fiziologic;
- cu spatula ataşată de capacul coprorecoltorului (sau cu o baghetă de sticlă) se
recoltează din proba de fecale un mic fragment;
- se disociază şi se omogenizează prin mişcări circulare fragmentul respectiv în
picătura de ser fiziologic de pe lama microscopică;
- se acoperă lama cu probă cu o lamelă;
- se examinează la început cu obiectiv de 10x, 20x si de 40x. Nu se face examinarea
cu obiectiv de imersie (90/100);
Examinarea directă la microscop a lamei se face în vederea detectării chisturilor de
protozoare, ouălelor de helminţi, trofozoiţilor sau larvelor. Pentru detectarea ouălelor de
helminţi (Ascaris lumbricoides, Trichiurius trichiura, Taenia solium, Taenia saginata) este
necesar să se aplice un strat gros de materii fecale.
Prin observare atentă se pot evidenţia eventualele mişcări active ale pseudopodelor
amoebelor. Aceste mişcări pot fi mai bine evidenţiate dacă serul fiziologic şi lama au fost în
prealabil încălzite la 37oC.

Tehnica de examinare (colorare) în cazul examenului direct în soluţie Lugol:

- se pune pe lama microscopului 1 picătură de soluţie Lugol;
- cu spatula ataşată de capacul coprorecoltorului (sau cu o baghetă de sticlă) se
recoltează din proba de fecale un mic fragment;
- se disociază şi se omogenizează prin mişcări circulare fragmentul respectiv în
picătura de soluţie Lugol de pe lama microscopică;
- se acoperă lama cu probă cu o lamelă;
 - se examinează cu obiective uscate de 10, 20 şi de 40 şi nu cu obiective cu imersie
de 90/100.
Această tehnică permite evidenţierea unor elemente de structură ale formelor vegetative sau
chistice ale protozoarelor, precum şi ouăle de helminţi, dar nu permite evidenţierea
eventualelor forme de mişcare, de asemenea, se poate observa că amidonul digerat se
colorează în roz, nedigerat în violet.
Se recomandă ca examenul în ser fiziologic sau în soluţie de Lugol să fie efectuat pe 2-3
lame, materialul fiind recoltat din mai multe zone ale materialului fecal.
Un rezultat complet nu se poate obţine decât în urma concentrării probelor.

La examinarea microscopica se pot depista diferite specii de paraziti.

Giardia lamblia
Poate apare sub doua forme: trofozoit (forma vegetativa) si chist. Forma vegetativa se
intalneste exceptional, doar in scaunele apoase, in stadiul acut al bolii, mai ales la copii (in 5-
10% din cazuri). Trofozoitul este piriform de 15 µm lungime/6-10 µm latime. Are corp cu
simetrie bilaterala cu 2 nuclei, 4 perechi de blefaroplasti si 4 perechi de flageli, un disc adeziv
si un axostil.

Fig. 1 chist/ trofozoit de Giardia lamblia (www.dpd.cdc.gov)

Chistul este ovalar are 9-13 µm lungime / 6µm latime. Are o membrana externa fina, dubla, 4
nuclei si un manunchi de flageli. Nucleii au o dispozitie variabila, frecvent sunt grupati la o
extremitate a celulei.
In axul chistului se observa resturi flagelare cu dispozitie sinuoasa, in forma de S.
Fig. 2 Chisturi de Giardia lamblia (preparat nativ in solutie salina )

Fig. 3 Chist de Giardia lamblia (preparat nativ in solutie Lugol, – imagine de

la www.dpd.cdc.gov)

Entamoeba histolytica
Chistul matur este rotund, cu dimensiuni de 10-20 µm si cu un numar constant de 4 nuclei;
continutul chistului este relativ compact, fiind intalnite 1-4 baghete cu capete rotunjite,
denumite corpi siderofili sau cromatoizi.
Fig. 4 Chist de Entamoeba histolytica (preparat nativ – imagine de la www.dpd.cdc.gov)

Entamoeba coli
Chistul matur are dimensiuni variabile (10-30 µm), cu un perete gros, dublu-lamelar si un
continut granular uniform ce îi confera in preparatele proaspete o coloratie gri-cenusie;
numarul nucleilor este constant de 8, asezati in acelasi plan sau in planuri diferite.

Fig. 5 Chist de Entamoeba coli (preparat nativ – imagine de la www.dpd.cdc.gov)

Blastocystis hominis
Forma vacuolara (considerata de unii drept chist) este sferica sau elipsoidala si are in medie
8-10 µm. Poate prezenta o capsula proeminenta; contine o vacuola mare centrala, clara,
delimitata de o banda subtire neregulata din citoplasma, la nivelul careia se gasesc nucleii si
granulele dispuse periferic.
Detine in general un nucleu, dar uneori poate avea 2-4 nuclei sau chiar mai multi. La formele
binucleate, nucleii pot fi dispusi la cei doi poli, iar la formele tetranucleate la periferia celulei.

Fig.6 Blastocystis hominis – forma vacuolara (preparat nativ in solutie salina – imagine de la
www.dpd.cdc.gov)

Ascaris lumbricoides.

Oul este oval, de 65-80 µm/ 50 µm. Prezinta un invelis dublu: un invelis extern, gros, cu
aspect mamelonat caracteristic si un invelis intern de natura chitinoasa, neted, transparent,
stratificat.
Oul neembrionat prezinta in interior celula-ou, inconjurata de masa vitelina, retractata, lasand
un spatiu liber intre ea si invelisurile externe. Forma si dimensiunile oului embrionat sunt
asemanatoare cu ale celui neembrionat, dar in interiorul lui se dezvolta o larva cilindrica de
250 µm, rasucita in jurul sau, in forma literei S, ocupand in intregime interiorul oului.

Fig. 7 Ou de Ascaris lumbricoides (preparat nativ in solutie salina )

Trichiuris trichiura (Tricocefalul).

Oul este oval, brun, de 50 / 22 µm. Prezinta un invelis extern gros si in interior celula-ou
inconjurata de masa vitelina. La cei doi poli exista dopuri albuminoase transparente, care
confera oului un aspect caracteristic de lamaie.

Fig. 8 Ou de Trichuris trichiura (preparat nativ in solutie salina )

Strongyloides stercoralis.
Deoarece ouale eclozeaza imediat dupa emisie si elibereaza larve in lumenul intestinal, in
materiile fecale se vor evidentia doar larve.
Larvele rabditoide masoara 250-300 µm, au un esofag “bicameral” (o portiune proximala
cilindrica de calibru redus si un segment distal globulos “in bulb de ceapa”) si o extremitate
posterioara ascutita.

Fig. 21.4.8.9 Larva rabditoida de Strongiloides (preparat nativ in solutie salina)

Fasciola hepatica
Ouale sunt neembrionate, cu dimensiuni de 140/ 80 µm, culoare galben bruna, prezentand la
exterior o coaja subtire, deformabila, cu un opercul la un pol, iar in interior celula ou
inconjurata de masa vitelina.

Fig. 10 Ou de Fasciola hepatica (preparat nativ in solutie salina – imagine de

la www.dpd.cdc.gov)

Taenia solium si Taenia saginata.

Ouale sunt embrionate, rotund-ovalare, avand dimensiuni de 30-50 µm. Prezinta o coroana
periferica striata caracteristica, alcatuita din trei membrane embrionare; contin in interior o
substanta vitelina galben-maronie si un embrion hexacant, cu 6 carlige dispuse in perechi.

Fig.11 Ou de Taenia spp. (preparat nativ in solutie salina )

Hymenolepis nana.

Ouale sunt transparente, avand dimensiuni de 47/37 µm. Prezinta un embrion hexacant (cu
trei perechi de carlige) si un invelis dublu alcatuit dintr-o membrana externa fragila si o
membrana interna densa, cu doua proeminente care-i confera aspect de lamaie si de la nivelul
carora pornesc 4-8 filamente dispuse intre cele doua membrane ale oului.

Fig.12 Ou de Hymenolepis nana (preparat nativ in solutie salina – imagine de

la www.dpd.cdc.gov)

Diphylobothrium latum.

Ouale sunt neembrionate, au aspect oval, culoare bruna si dimensiuni de 70/45 µm. Prezinta
un invelis extern dedublat, cu un opercul la unul din poli si o mica proeminenta (carena) la
polul opus; in interior se gaseste celula-ou inconjurata de masa vitelina.

Fig.13 Oua de Diphylobothrium latum (preparat nativ in solutie salina)

 Tehnici de concentrare

Tehnica de concentrare prin sedimentare: principiul tehnicii are la bază greutatea specifică a
chisturilor şi oochiştilor protozoarelor mai mare decât cea a mediului în care sunt suspendate
materiile fecale (apă sau ser fiziologic). Din acest motiv, chisturile şi oochiştii protozoarelor
au tendinţa de a se depune.
Separarea şi depunerea elementelor parazitare poate fi accelerată prin tratament chimic şi
centrifugare uşoară, care permit înlăturarea resturilor nedigerate din materia fecală.

Sedimentarea cu formol 10% şi eter/acetat de etil

Materiale necesare:
- formol cu concentraţia de 10% (formalină);
- eter/acetat de etil;
- apă distilată;
- ser fiziologic;
- soluţie Lugol;
- sită din material textil (teflon);
- tuburi de centrifugă cu fund conic;
- pipete Pasteur;
- lame şi lamele microscopice.
Mod de lucru
Prepararea soluţiei de formol 10%: se introduc 100 ml de formol într-un flacon de 1000 ml,
se adaugă 900 ml apă distilată, se agită. Soluţia de formol este uşor de preparat şi poate fi
folosită o perioadă lungă de timp (cel puţin 2 ani). Formolul este un bun fixator, nu interferă
cu unele chituri de diagnostic, nu interferă cu coloraţiile acide; elementele prelevate
parazitate sunt inactivate de formol (formolul nu contaminează).
Tehnica de sedimentare propriu-zisă:
- se recoltează din mai multe zone o cantitate de materie fecală de dimensiunea unei
nuci de mărime medie;
- se omogenizează şi se suspendă în 10 ml ser fiziologic;
- se filtrează printr-o sită din material textil într-un tub de centrifugă cu fund conic;
- se centrifughează filtratul obţinut la o turaţie de 2000 rpm;
- se decantează supernatantul, iar sedimentul se reia tot cu 10 ml ser fiziologic;
- se centrifughează din nou. Spălările se repetă până când supernatantul rămâne
limpede;
- sedimentul rezultat după ultima spălare se reia cu 10 ml formalină (soluţie de
formol 10%);
- sedimentul şi soluţia de formol se omogenizează prin agitare, după care se lasă în
repaus câteva minute pentru sedimentare;
- se adaugă 1-2 ml acetat de etil, se închide tubul şi se agită puternic;
- se efectuează ultima centrifugare la 1500 rpm. La sfărşitul centrifugării se observă
în tub 4 straturi:
1. stratul de la suprafaţă format din acetat de etil;
2. un strat închis la culoare care conţine resturi nedigerate;
3. un strat care conţine soluţia de formol 10%;
4. sedimentul;
 - se desprinde cu grijă de pereţii tubului al doilea strat cu ajutorul vârfului unei pipete
şi apoi se înlătură;
- se decantează celelalte straturi;
- se repartizeză cu ajutorul unei pipete Pasteur sediment pe lama microscopică în căte
o picătură de ser fiziologic/soluţie Lugol;
- se acoperă lama cu o lamelă şi se examinează la microscop.
Această tehnică de sedimentare poate fi folosită şi în cazul probelor fixate în PVA (polivinil
alcool). Lamele cu material de examinat trebuie pregătite cel mai târziu într-o oră pentru a
evita uscarea materialului. Totuşi, există o posibilitate de a preîntâmpina uscarea materialului
adăugându-se o picătură de formol 10% peste sediment. Atunci când nu se foloseşte o
cantitate corespunzătoare de materii fecale (cantitate prea mare sau prea mică) pot să apară
erori în rezultatele obţinute.

Alte tehnici de concentrare prin sedimentare

- sedimentare cu HCl şi eter. Principiul de bază şi modul de lucru sunt asemănătore
cu cele descrise la tehnica de sedimentare cu formol 10% şi eter/acetat de etil, cu deosebirea
că formolul este înlocuit cu soluţie de HCl 10%;
- sedimentare cu soluţie aceto-acetică şi eter. Principiul de bază şi modul de lucru
sunt asemănătore cu cele descrise la tehnica de sedimentare cu formol 10% şi eter/acetat de
etil, cu deosebirea că formolul este înlocuit cu soluţie aceto-acetică, preparată din:
- 15 g acetat de sodiu cristalizat;
- 3,5 ml acid acetic;
- 1000 ml apă distilată.

Tehnica de concentrare prin flotare

Principiul de bază constă în faptul că ouăle de helminţi şi chisturile protozoarelor cu greutate

specifică mai mică pot fi recoltate de la suprafaţa unui lichid de suspensie cu greutatea
specifică mai mare.
Materiale necesare:
- soluţie saturată de NaCl 40%;
- recipiente cu deschidere mare pentru a primi o lamelă cu dimensiunile 18/18 mm;
- lame de microscopie şi lamele;
- baghetă de sticlă.
Mod de lucru:
- se introduc câteva mici fragmente din bolul fecal într-un recipient cu deschidere
largă;
- se adaugă o mică cantitate din soluţia saturată de NaCl;
- se disociază bolul fecal cu ajutorul unei baghete de sticlă;
- se adaugă în continuare soluţie de NaCl până la limita superioară a recipientului;
- se depune o lamelă de microscopie cu ajutorul unei pense pe suprafaţa lichidului.
Depunerea se face cu grijă pentru ca lamela să nu se scufunde. După aproximativ
30 minute cu ajutorul unei pense lamela se ridică păstrându-se paralelismul cu
suprafaţa lichidului şi se depune pe lama de examinare;
- se examinează la microscop.
Metoda nu este eficientă în depistarea ouălelor operculate de botriocefal. Depăşirea timpului
de flotare în condiţiile în care are loc un proces de evaporare la suprafaţa lichidului poate
favoriza depunerea cristalelor de NaCl şi îngreunarea ouălelor care se vor scufunda şi astfel
nu mai pot fi vizualizate.
LP 7 Parazitologie

Coprocultura pe mediul Loeffler

Coprocultura pe mediul Loeffler este utilizată pentru identificarea, izolarea şi cultivare unor
protozoare cu localizare intestinală, precum Entamoeba histolytica şi Trichomonas vaginalis.
Protozoarele sunt puse în condiţii favorabile de creştere şi de înmulţire, favorizându-se astfel
diagnosticul.
Materiale necesare:
- ser de bou coagulat în plan înclinat;
- ser fiziologic;
- amidon de orez;
- streptomicină;
- pară de cauciuc;
- lame şi lamele;
- termostat.
Mod de lucru
- se scot tuburile cu mediu Loeffler cu câteva ore înaintea însămânţării de la
frigider, unde se păstrează pentru a nu se usca şi se pun în termostat pentru a
ajunge la temperatura de37oC;
- se pune în termostat la 37oC şi serul fiziologic;
- se recoltează într-un recipient cu ajutorul unei baghete de sticlă câteva fragmente
din materialul fecal ce urmează a fi investigat. Se recoltează din zonele mucoase,
eventual cu striaţii de sânge;
- se adaugă puţin ser fiziologic şi se omogenizează;
- se recoltează cu ajutorul unei pipete Pasteur cu pară de cauciuc o cantitate din
suspensia rezultată;
- se depun câteva picături din această suspensie pe mediul Loeffler;
- se adaugă puţin amidon de orez (un vârf de ansă) şi puţină streptomicină (un vârf
de ansă);
- se adaugă ser fiziologic astfel încât coloana de lichid formată să nu depăşească
limita superioară a serului coagulat;
- se păstrează la termostat la temperatura de 37oC cel puţin 3 zile, examinarea fiind
realizată din 24 în 24 de ore;
- după 24 de ore se scot tuburile de cultură de la termostat şi se înlătură cu ajutorul
unei pipete Pasteur cu pară de cauciuc faza lichidă a mediului, păstrându-se
sedimentul;
- se recoltează câteva picături de sediment cu ajutorul pipetei Pasteur prin raclarea
suprafeţei coagulului de ser;
- se pune o picătură între lamă şi lamelă şi se examinează la microscop cu
obiectivul de 40.
Entamoeba histolytica poate fi recunoscută uşor după:
- aspectul refringent al citoplasmei;
- aspectul nucleului care are un nucleol fin central şi cromatină fină dispusă la
periferie;
- aspectul pseudopodelor formate exploziv şi de obicei câte unul într-o singură
direcţie.
Se adaugă din nou în cultură ser fiziologic, streptomicină chiar şi amidon şi se păstrează în
continuare la termostat la 37oC alte 48 de ore.
O cultură bogată în ameobe face ca amidonul de orez să fie consumat repede. În absenţa
amidonului cultura poate fi pierdută. Ameobele fără amidon fagocitat şi cele care emit în
dezordine pe suprafaţa corpului mai multe pseudopode indică un declin al culturii.

Coprocultura pe cărbune

Principiu. Această tehnică de diagnostic este utilizată atunci când examenele clinice şi de
laborator arată valori mari ale eozinofilelor periferice şi datele epidemiologice sugerează
posibilitatea unei infecţii cu ancylostoma, necator şi strongyloides.
Cultura pe cărbune permite:
- formarea şi eclozarea larvelor rhabditoide de tip ancylostoma şi necator;
- năpârlirea lor şi trecerea în stadiul de larve strongyloide;
- evoluţia larvelor rhabditoide de strongyloides către stadiul adult şi înmulţirea
acestora prin eliberarea altor generaţii de larve.
Coprocultura pe cărbune se bazează pe tactismul larvelor, geotropismul negativ şi
higrotropismul pozitiv.
Materiale necesare:
- cărbune medicinal;
- plăci petri;
- recipiente din material plastic asemănătoare plăcilor petri obligatoriu cu capac
transparent;
- baghete de sticlă.
Mod de lucru:
- se recoltează cu ajutorul unei baghete de sticlă câteva fragmente din proba de
fecale ce urmează a fi examinată;
- se amestecă până la omogenizare cu o cantitate de cărbune medicinal;
- se intoduce amestecul în cutia petri modelându-se o formaţiune conică al cărui
vârf să fie turtit de capac. Peste capac se pune o bucată de vată umedă;
- se păstrează de obicei la temperatura camerii, având grijă ca permanent vata să fie
umedă. Prin evaporarea apei din vata umedă cutia petri se răceşte uşor astfel încât
apa din materialul fecal se condensează pe faţa interioară a capacului.
Larvele existente, prin geotropismul lor negativ au tendinţa de a se îndepărta din părţile
inferioare ale cărbunelui către vârf şi având higrotropism se vor aduna în picătura de apă
condensată. Examinarea se face cu o lupă prin transparenţa capacului care va permite
vizualizarea larvelor care pot fi recunoscute uşor datorită mişcărilor lor active.
În cazul unei probe pozitive sunt 2 situaţii. În primele 48 de ore pot fi surprinse larve
strongyloide provenite prin năpârlirea celor rhabditoide şi ancyloide. În zilele următoare pot
să apară adulţi de strongyloides şi noi generaţii de larve rhabditiode. Ancylostoma şi necator
vor rămâne sub formă de strongyloide. Deoarece larvele rhabditoide se transformă foarte
repede în larve strongyloide infectante este obligatorie folosirea mănuşilor de cauciuc la
manipularea materialului.
Tehnica coproculturii cu carbune Examen microscopic
larve strongiloide dezvoltate prin coprocultura pe
carbune

Strongyloides stercoralis

Morfologie
Parazitul adult
• extremitatea anterioară efilată
• extremitatea posterioară se termină cu o coadă scurtă conică

femela
• 2-3 mm
• se găsește în mucoasa intestinală a gazdei și în sol
• produce ouăle prin partenogeneză

masculul
• 750 μ
• Se găsește numai în sol
• extremitatea posterioară - un spicul

Formele larvare sunt de 2 tipuri

1. larvele rabditoide
• sunt foarte mobile, 250μ/15μ
• se găsesc în materii fecale, sol
• au o capsulă bucală scurtă
• au un esofag alcătuit dintr-o parte anterioară alungită, cilindrică, separată printr-o
strangulaţie de cea posterioară
• partea posterioară cu aspect bulbar (esofag rabditoid)
2. larvele strongiloide (filariforme)
• sunt mobile, deosebit de agile
• se găsesc în sol
• sunt subţiri, 500 μ
• esofag foarte lung, uniform calibrat, ocupă 1/2 din lungimea larvei
Ciclu de viață
• femela trăieşte în grosimea mucoasei duodenale şi jejunale și depune aproximativ 40 ouă
• larvele rabditoide
-eclozează în mucoasă
- îşi croiesc drum spre lumenul intestinal
- se hrănesc cu conţinutul intestinal
- îşi îndepărtează cuticula
- părăsesc organismul prin materii fecale
- majoritatea larvelor îşi păstrează caracterele de larvă rabditoidă.

Evoluţie directă
• la 15-18°C şi umiditate în 24-48 ore larvele rabditoide cresc rapid, transformându-se în
larve strongiloide
• acestea nu mai evoluează şi rămân în acest stadiu 2-3 săptămâni
• au tendinţa de
• a se orienta către căldură (termotropism)
• a se orienta către umezeală (higrotropism)
• a se ridica pe un suport umed (geotropism negativ)
• a fi atrasă de ţesuturile umane (histotropism)

-larvele strongiloide străbat tegumentele umane→ vase sanguine→plămâni, rup capilarele

pulmonare→ urcă în căile respiratorii până la faringe→sunt înghiţite→ se opresc în duoden
sau jejun→aici năpârlesc de 2 ori, până ajung la maturitate→ femela pătrunde în mucoasa
intestinală, după 2-3 săptămâni depune ouă sau direct larve rabditoide, eliminate odată cu
scaunul in mediul extern.

Evoluţia indirectă
• parte din larvele eliminate pe sol nu se transformă în larve strongiloide infectante, ci suferă
câteva năpârliri
• se transformă în adulţi liberi (femele şi masculi), care se reproduc pe sol
• creează astfel un rezervor de infecţie independent de gazda umană
• dau naştere unor larve rabditoide care se pot transforma în larve infectante sau adulţi liberi
Autoinfectarea externă
• larvele rabditoide eliminate cu materiile fecale rămân în regiunea perianală
• se transformă în larve strongiloide care pătrund prin tegument
• Autoinfectare internă
• unele larve însă se transformă în larve strongiloide
• pătrund imediat în peretele intestinal
• intră într-un vas sanguin
• încep acelaşi ciclu migrator ca şi cel al larvelor care pătrund din mediul extern prin piele.

Simptomatologie
• asimptomatic
• migrarea cutanată
- erupții urticariene la locul pătrunderii, pe fese și la nivelul taliei
- uneori aspect șerpuitor (larva migrans cutanată), la locul pătrunderii sau cu punct de
pornire din regiunea anală
• migrarea pulmonară
- tuse, hemoptizie, dispnee, bronhospasm
• migrarea intestinală
- diaree, malabsorbție, steatoree
-Inapetență, grețuri, vărsături, balonări
- ulcerații, melenă
• strongiloidoza diseminată
- dureri abdominale, distensie abdominală, icter
-peritonită dacă larvele străbat peretele intestinal
• Simptome generale
-Edeme (pierderi de proteine)
- Scădere ponderală
-eozinofilie

Epidemiologie
• în zonele tropicale și subtropicale
• uneori în zonele temperate
• la noi
- N-V Transilvaniei
- Moldova

• Profilaxie
- evitarea contactului cu soluri umede
- evitarea consumului de alimente contaminate
- folosirea încălțămintei de protecție la persoanele care intră în
-contact cu solul umed.

Tehnica “amprentei anale”

Tehnica este utilizată pentru evidenţierea ouălelor de Enterobius vermicularis. Formele de

oxiuri depun ouăle în pliurile mucoasei anale. Tehnicile de depistare a ouălelor direct din
produsul fecal sunt de obicei ineficiente. A fost imaginată tehnica “amprentei anale”/tehnica
baghetei de celofan.
Materiale necesare:
- bandă adezivă transparentă/celofan;
- baghetă de sticlă;
- eprubetă de sticlă;
- lame de microscopie;
- lamele;
- ser fiziologic;
- ulei de imersie;
- glicerină.
Pregătirea materialului:
- se acoperă unul din capetele baghetei de sticlă pe o distanţă de 1-2 cm cu bandă
adezivă/ celofan. Celofanul se prinde cu un inel de cauciuc;
- se introduce bagheta astfel preparată într-o eprubetă de sticlă;
- se acoperă eprubeta cu un dop de vată;
- dimineaţa se scoate bagheta din eprubetă, se apropie de zona perianală a
pacientului introducând capătul baghetei 1 până la 3 mm în anus;
- se roteşte uşor astfel încât eventualele ouă din pliurile mucoasei anale să poată fi
recoltate, să poată fi ataşate;
- se desprinde pelicula de celofan de pe baghetă şi se depune pe o lamă de
microscopie într-o picătura de ser fiziologic, ulei de cedru/glicerină;
- se acoperă cu o lamelă;
- se examinează cu obiectivul mic de 10.
Recoltarea se face înaintea utilizării toaletei şi fără a spăla, în prealabil, zona anală. În situaţia
unui rezultat pozitiv se recomandă investigarea şi a celorlalţi membrii ai familiei mai ales a
copiilor.
Enterobius vermicularis – oua, recoltate prin tehnica „amprenta anala”
LP 8 Parazitologie

Examenul parazitologic al sangelui (frotiu si picatura groasa)

In sangele periferic se pot decela Plasmodium, Trypanosoma, microfilarii, Toxoplasma (extrem

de rar), Leishmania, Trichinella (foarte rar).Decelarea parazitilor direct din sange se poate face prin
metoda frotiului colorat Giemsa sau a picaturii groase.
Agentul etiologic al malariei : P. malariae, P. vivax, P. ovale, P. falciparium.
Ciclul biologic al parazitului se desfasoara in 2 gazde diferite : etapa sporogonica in tubul
digestiv al femelei Anopheles si etapa schizogonica care are loc in hepatocite (fazele exoeritrocitare)
si in hematiile omului (faza eritrocitara). Stadiile rezultate in timpul schizogoniei eritrocitare : inele,
amoebe (trofozoiti), prerozete, rozete, macro si microgametociti.

Semnificatie clinica
Formele clinice de manifestare ale malariei :
- malaria primara – periodicitatea acceselor malarice depinde de tipul de Plasmodium :
- P. malariae 72 ore.
- P. vivax si P. ovale 48 ore.
- P. falciparum 24-48 ore.
Perioada acceselor malarice consta intr-o succesiune la intervale de timp regulate a unor stari
clinice caracteristice : frison(1 ora), hipertermie(2-3 ore), sudoratie.
- malaria cronica- caracterizata prin spleno-hepatomegalie, subicter si anemie accentuata.
- malaria de recadere – persistenta unor stadii eritrocitare in sangele din capilarele unor viscere,
mai ales ale splinei si ficatului.
- malaria congenitala.
- malaria de transfuzie

Principiul metodei
Diagnosticul de certitudine se face prin examen hematologic; se depisteaza parazitul in sangele
periferic ( frotiu si picatura groasa, ambele colorate Giemsa), se apreciaza aspectul parazitului, stadiul
de evolutie, marimea si aspectul hematiei parazitate.

Mod de lucru:
Frotiu de sange
Recoltarea sangelui se face din pulpa degetului, dupa o prealabila dezinfectare cu alcool si uscare.
Prima picatura de sange se indeparteaza cu vata uscata, iar din a doua picatura se intind frotiuri de
sange care se usuca si se noteaza.
Se coloreaza May Grunwald Giemsa :
- se fixeaza cu solutie May Grunwald 3 min.
-se varsa fixatorul si se acopera lama cu solutie Giemsa preparata
extemporaneu (2-3 picaturi Giemsa la 2 ml apa distilata)
- se lasa 25-30 min.
- se spala cu apa de robinet,se usuca
-se examineaza la microscop cu imersie
Plasmodium falciparum (frotiu sange periferic) – hematii multiparazitate

Picatura groasa
Se recolteaza din pulpa degetului, se pun pe lama 2 – 3 picaturi de sange. Cu coltul altei lame se
omogenizeaza cele 3 picaturi prin miscari circulare, pentru defibrinare. Rezulta un strat uniform de
sange cu diametru de 1 cm.
Se usuca ( fara fixare) 3 – 4 ore, apoi se face hemoliza acoperind cu apa distilata toata suprafata lamei
pana la hemoliza completa (culoarea alb cenusie a picaturii de sange). Colorare cu solutie Giemsa ( 2-
3 picaturi la 1 ml apa distilata) 25-30 min. Se spala la un jet slab de apa si se usuca. Se examineaza la
microscopul cu imersie.

Plasmodium falciparum – picatura

groasa

Se examineaza la microscop cu imersie frotiul / picatura groasa colorate May Grunwald

Giemsa.
P. vivax P. ovale P. malariae P. falciparum
Egale sau mai Nemodificate ca
Aspectul Marite de volum,
Marita de volum mici decat cele dimensiuni; pot fi
hematiei alungite, franjurate
normale multiparazitate.
 Mare, cu Multiple inele intr-
Mic, cu o hematie,
Mare, cu citoplasma bogata
Inel citoplasma unele pot fi
citoplasma bogata (mai mic decat la
putina. binucleate, unele
P. Vivax)
periferice.
Mare, ocupa
Mare, ocupa Apar in sangele
aproape toata Aspect tipic de
aproape toata periferic numai in
Amoeba hematia, citopl. “banda
hematia, citopl. formele
Puternic ecuatoriala”
vacuolizata. comatoase.
vacuolizata.
Aspect
Apar in sangele
muriform(16-24 16 – 12 6-12 merozoiti
periferic numai in
Rozeta merozoiti dispusi merozoiti(de dispusi in
formele
in mai multe obicei 8) ‘margareta”
comatoase.
straturi)
Forma de
Mare,ocupa Mare,ocupa Mic,ocupa semiluna
Gametocit hematia in hematia in hematia in caracteristica,
intregime intregime intregime uneori hematia are
aspect de cosulet.
Granulatii Granulatii
Granulatii ‘
Granulatii “SCHUFFNER” “SCHUFFNER” Uneori granulatii
MAURER”, mici,
specifice Mari, rosii, Mari, rosii, “ZIEMANN” fine
maronii
portocalii. portocalii.
Observatii In sangele In sangele In sangele In sangele
periferic apar toate periferic apar toate periferic apar periferic apar
stadiile eritrocitare stadiile eritrocitare toate stadiile numai stadiile de
eritrocitare inel si gametocit,
toate celelalte
stadii se gasesc
numai in capilarele
viscerale
profunde. Apar in
sangele periferic
numai in formele
comatoase

Interpretarea rezultatelor
Testul permite identificarea parazitului in functie de stadiile de evolutie prezente in hematie.
Modul de exprimare a rezultatelor
Rezultatul se exprima prin absenta / prezenta si tipul de Plasmodium.
LP 9
Coloraţia Ziehl – Neelsen
Cryptosporidium parvum este o specie de protozoare şi un parazit obligat intracelular care nu
poate supravieţui fără o gazdă şi care determină criptosporidioza intestinală, o boală parazitară a
tractului intestinal.
Semne şi simptome ale criptosporidiozei: crampe abdominale, diaree (de obicei apoasă, de volum
mare şi de multe ori pe zi), indispoziţie, malnutriţie şi pierdere în greutate (în cazurile severe),
greaţă şi febră.
Diagnosticul în cazul infestării cu Cryptosporidium parvum constă în teste serologice şi în
evaluarea microscopică a oochiştilor din scaunul pacienţilor prin utilizarea coloraţiei Zeih -
Neelsen.
Materiale necesare:
- fuxină fenică (fucsină fenică);
- formol 10%;
- HCL-etanol;
- soluţie glicerol verde malahit/ albastru de metilen;
- soluţie HCl-etanol;
- apă distilată.
Prepararea soluţiei de fucsină fenică
Reactivi necesari: fuxină bazică 10 g; etanol absolut 100 ml; fenol 50 g; apă distilată 1000 ml.
Fuxina bazică se introduce într-un flacon de 1,5 L, se adaugă 100 ml etanol absolut, se agită uşor
până la dizolvarea colorantului; se dizolvă separat fenolul în puţină apă distilată. Se adaugă
fenolul dizolvat peste colorant şi se agită. Se adaugă restul de apă şi se agită. Reactivul, astfel
obţinut, poate fi folosit indefinit.
Formol 10% pentru conservarea materialului fecal: 10 ml de formol se diluează până la un
volum de 100 ml cu apă distilată, se agită.
Soluţia HCl-etanol: 100 ml etanol 95% se introduc într-un flacon de 250 ml care poate fi închis
ermetic. Se adaugă 1 ml acid clorhidric concentrat şi se agită.
Soluţia de glicerol verde malahit/ albastru de metilen
Reactivi necesari: glicerol 100 ml; 1 ml verde malahit/albastru de metilen soluţie apoasă 3% de
verde malahid/albastru de metilen; apă distilată 100 ml.
Într-un flacon se introduc 3 g de verde malahit/albastru de metilen peste care se adaugă 100 ml
apă distilată. În alt falcon se introduce 1 ml din soluţia de verde malahid 3% preparată anterior
peste care se adaugă 100 ml glicerol şi 100 ml apă distilată. Se amestecă cele două soluţii înainte
de utilizare.
Soluţia de HCl- metanol: 2 sol: 3 ml HCl concentrat şi 100 ml metanol absolul. Se introduce
metanolul absolutul într-un flacon. Se adaugă 3 ml HCl concentrat, se amestecă şi se închide
ermetic flaconul.

Mod de lucru:
- se execută frotiuri subţiri din materia fecală ce urmează a fi examinată;
- se usucă la aer şi se fixează cu metanol/HCl-metanol timp de 2-3 minute;
- se acoperă frotiul cu fuxină fenică rece timp de 5 până la 10 minute;
- se adaugă soluţie de HCl-etanol până cănd colorantul nu mai difuzează;
- se spală cu apă de la robinet;
 - se contracolorează cu soluţia albastru de metilen timp de jumătate de minut;
- se spală cu apă de la robinet;
- se usucă şi se examinează.
Pot fi observaţi oochiştii de Cryptosporidium parvum care apar coloraţi în roşu, fondul având
culoarea albastru.
Se recomandă examinarea cu obiectivul de imersie în scopul recunoaşterii unor particularităţi de
structură ale chiştilor.

Cryptosporidium parvum - specie de protozoare şi un parazit obligat intracelular care nu poate

supravieţui fără o gazdă şi care determină criptosporidioza intestinală, o boală parazitară a
tractului intestinal.
Calea de infectie – digestiva.
Localizare – intestinul subtire, la polul apical al microvilozitatilor enterocitelor. In
imunodepresia severa infectia cuprinde mucoasa intregului tub digestiv si disemineaza si in alte
organe.
Semne şi simptome
• La imunocompetenti : scaune diareice , insotite de un puternic disconfort local si general,
care se remit spontan.
• La imunodeprimati: crampe abdominale, diaree severa, trenanta (de obicei apoasă, de
volum mare şi de multe ori pe zi), indispoziţie, malnutriţie şi pierdere în greutate (în
cazurile severe), greaţă şi febră. O diaree cronica datorata lui C. parvum este un semn cert
al unei infectii cu HIV.
 Diagnosticul parazitologic al trichomonazei urogenitale

Deoarece leucoreea şi pruriul sunt principalele semne ale trichomonazei, care nu lipsesc nici în
alte boli genitale (ex. candidiza genitală şi gonoreea) este bine ca evidenţa parazitului să se
efectueze în secreţiile recoltate.
Se recoltează secreţia vaginală, secreţia uretrală şi sedimentul urinar.

Recoltarea secreţiei vaginale

Recoltarea secreţiei vaginale se face de preferinţă pre şi post menstrual. Se recoltează din fundul
de sac vaginal cât mai profund posibil. Se recoltează la 24-48 de ore după ultima toaletă intimă
profundă.

Recoltarea sedimentului urinar

Se recotează prima urină de dimineaţă din care prin centrifugare se obţine un sediment ce
urmează a fi examinat. Prin examinarea urinei mai pot fi evidenţiate şi alte elemente patologice
parazitare: ex. Schistosoma haematobium (larve), Enterobius vermicularis (ouăle care sunt
depuse de femele).

Recoltarea secreţiei uretrale

La bărbat se recoltează secreţia matinală (secreţia uretrală)/(picătura matinală), secreţia după
masaj prostatic, sedimenul urinar, lichidul spermatic. Este de preferat ca aceste secreţii să fie
examinate pe preparate prospete între lamă şi lamelă. Mişcarea paraziţilor uşurează foarte mult
recunoaşterea lor. În cazul în care examinarea imediată nu este posibilă se recomandă fixarea şi
colorarea ulterioară Giemsa. Examinarea secreţiilor poate da rezultate favorabile numai în
aproximativ 50% din cazuri, mai precis atunci când numărul paraziţilor depăşeşte 105/ml.
Secreţiile cu un număr mai mic de paraziţi se recomandă a fi inoculate pe un mediu de cultură în
scopul îmbogăţirii. Din acest motiv, însămânţarea pe medii de cultură a materialelor recoltate
reprezintă cea mai sigură metodă de diagnostic.
În scopul cultivării se utilizează de obicei un mediu care este un bulion nutritiv ce conţine
tripticază, extract de ciuperci cu adaos de Fe, ser fetal de viţel şi un amestec de vitamine.
Mai poate fi utilizat cu succes şi mediul Loeffler sau un mediu pe bază de ser de bou cu adaos de
factori nutritivi (ex. extractul de splină).
Trichomonas vaginalis
Morfologie
formă ovalară, 15/7 μ
• nucleu cu 5 cromozomi
• complex kinetosomal de la care pleacă:
– 3-5 flageli
– flagel recurent -> membrana ondulantă
– axostil
• costa
•lizozomi, aparat Golgi, hidrogenozomi
 Trichomonas vaginalis – preparat nativ Trichomonas vaginalis - coloratie Giemsa

Patogenie
Trasmiterea se face pe cale veneriană.
Este un parazit al căilor genito-urinare al ambelor sexe.
La pH acid normal (datorită lactobacililor vaginali), parazitul se poate găsi în secreţia vaginală, dar nu
aderă de celulele epiteliale, deci nu produce vaginită
Aderarea de celula ţintă are loc la pH neutru favorizat de: sarcină, menstruaţie, infecţiile cu
germeni anaerobi (care înlocuiesc lactobacilii vaginali) parazitul recunoaşte şi aderă de celula epitelială
prin intermediul unor adezine de pe suprafaţa lor.
Degenerarea epiteliului vaginal - celule epiteliale modificate, uneori cu aspect malign: celule binucleate,
nucleu hipertrofiat, hipercromatic.
Descuamarea epiteliului.
Apariţia leziunilor necrotice şi hemoragice.
Apariţia vaginitei.

Manifestari clinice
La femei
-purtător asimptomatic – vaginite severe
-debut cu prurit vulvar
-leucoree(spumoasă, fluidă, galben-verzuie, miros fad, se exacerbează postmenstrual şi în sarcină)
-netratată se cronicizează – sterilitate temporară.

La bărbaţi
- infecţie asimptomatică (90%)
- uretrită(secreţie purulentă, fluidă, senzaţie de arsură, durere la micţiune
- infecţie cronică.
 LP 10. Diagnosticul infectiilor produse de levuri si de fungii filamentosi

1. Diagnosticul de laborator in candidoza

Agentul etiologic: Candida spp.

Diagnostic direct:
Produse patologice: scuame din leziuni cutanate, raclat unghial, exsudate de la nivelul
mucoaselor, sputa, LCR, urină, sange, materii fecale.
Transportul probei: in maximum o ora de la recoltare.
Examen microscopic:
- preparat umed, lamă-lamelă (materii fecale, urină);
- preparat lama-lamela după clarificare cu solutie de KOH 20% (scuame din leziuni
cutanate sau unghiale);
- după colorare (frotiu, preparate histologice).
Se pot observa:
Levuri rotunde, cu diametrul de 2-6 μm, înmugurite
Pseudofilamente (excepţie C. glabrata)
Cultivare:
- cultivă pe mediul Sabouraud (cu/fara antibiotice), formând colonii albicioase, după 24-48 ore.
- temperatura de cultivare este de 26ºC sau 37ºC după localizarea superficială sau profundă a
infecţiei.

Candida albicans- colonii albe, cremoase, mari, cu suprafaţa mată

(Sursa: https://www.cdc.gov/fungal/diseases/candidiasis/invasive/diagnosis.html)
Identificare
- Se face pe baza caracterelor de cultura, microscopice, biochimice si genetice.

1
- Testul de filamentare (germ-tube test) este pozitiv pentru Candida albicans si Candida
dubliniensis.
Tehnica:
- ca medii se utilizeaza serul sanguin de cal, serul sanguin uman;
- se prepara suspensia levurica in ser fizziologic, densitatea acesteia ajustandu-se la 0,5 Mc
Farland (cca.105-106 celule /ml) ;
- in fiole cu capacitatea de 2 ml se pun in contact 0,5 ml suspensie levurica si 0,5 ml ser
sanguin de cal;
- fiolele se mentin apoi in baia de termostatare la 360C timp de 2h.
- ca martor al filamentarii, se utilizeaza de fiecare data o tulpina de Candida albicans;
- si alte levuri pot produce formatiuni similare de tipul pseudofilamentelor, insa ele se
diferentiaza de adevaratii tubi germinativi prin existenta unei strangulari la locul de
emergenta din blastospor.

(Sursa: https://quizlet.com/166474535/mycology-yeast-flash-cards/)

Candida albicans
Preparat nativ , 40x
Blastospori cu filamente
(Sursa: https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/micologie/levuri/calbicans.php)

2
 Candida albicans
Colorație Gram, 100x
Blastospori Gram pozitivi
https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/micologie/levuri/calbicans.php
- Testul ureazei negativ
- Caractere de cultură: pentru Candida albicans - colonii „S”, albe, cremoase, mari, cu suprafaţa
mată
- Izolarea pe medii cu substrat cromogen al unei enzime specifice pentru Candida albicans
- Detectarea antigenelor in infectii cu evolutie rapida (latexaglutinare)
Diagnostic indirect :
-identificarea anticorpilor serici (ELISA, IFI), in localizarile profunde
Antifungigrama:
- permite stabilirea sensibilităţii la antifungice: Fluconazol, Itraconazol, Amfotericina B,
Nistatina, Flucitozina, Ketoconazol, Miconazol, Econazol

2. Diagnosticul infectiilor produse de fungii filamentosi

Diagnosticul de laborator in aspergiloza

Agentul etiologic: Aspergillus spp.

Diagnostic direct:
Produse patologice: lavaj bronho-alveolar, LCR, fragmente de biopsie, sange, prelevate
superficiale- cutanate, sinusale, conjunctivale, unghiale, auriculare.
Transportul probei: se realizeaza imediat dupa recoltare.

3
Examen microscopic:
-direct- cu sau fara colorare (coloratie Giemsa), evidentiaza fragmente hifale, fine (3-12μm
diametru) regulate, septate, ramificate dicotomic in unghi ascutit 450.
-in hemoculturi filamentele speciilor de Aspergillus se intalnesc doar exceptional
-in prelevatele profunde se identifica doar fragmente hifale septate si ramificate (prezenta
conidiilor = contaminare)
-in prelevatele superficiale se pot intalni si formatiuni de fructificare cu conidii (capete
aspergilare)
Cultivare:
Aspergillus se dezvoltă pe mediu Sabouraud cu gentamicină sau cloramfenicol
Apariţia rapidă, în 2 – 3 zile, de colonii caracteristice, permite diagnosticul de gen.

Aspergillus fumigatus
(Sursa: https://mycology.adelaide.edu.au/descriptions/hyphomycetes/aspergillus/)

Incubare: 370C pentru prelevate profunde, 300C pentru prelevate superficiale

Aspergillus fumigatus: colonie albastra-verzui inchis, uneori pigment rosu , poate creste la 450C
Aspergillus flavus: colonie galben-verzuie, aspect granular
Aspergillus niger: suprafata coloniei neagra (datorita capetelor aspergilare), aspect granular
Identificarea
-identificarea speciei se face pe baza caracterelor microscopice si de cultura
-evidentierea antigenelor aspergilare circulante la pacientii cu risc crescut
Diagnostic indirect:
-detectarea anticorpilor specifici (ELISA, teste de imunodifuzie)

4
 Controlul microbiologic al aerului. Analiza microbiologica a apei.

Controlul microbiologic al aerului.

Recoltarea probelor din aer pentru determinarea numarului de germeni urmareste evaluarea
microorganismelor viabile vehiculate pe calea aerului.

Metoda de recoltare prin sedimentare(Koch)

• pentru fiecare incapere se folosesc cel putin 2 seturi de placi (una cu geloza singe si una
cu geloza simpla-ambele fara lichid de condensare)
• 1 set de placi se vor aseza in centrul incaperii si unul intr-un colt al camerei, ambele
seturi la inaltimea unei mese(60-100cm)
• Se ridica capacul placilor si se aseaza cu deschiderea capacului in jos, alaturi de placa.
• Timpul de expunere =10min.
• Placile vor fi incubate 24-48ore la 37°C
• Se numara coloniile crescute pe geloza simpla la 48ore
• Calcul(formula lui Omelianski) = nr.UFC/m^3 aer =Nx10000/SxK
• N=nr.colonii de pe placa
• S=suprafata placii Petri in cm2(63,5 cm2)
• K=coeficientul timpului de expunere(1 pt.5min,2 pt.10 min,3 pt.15 min)
• de pe geloza sange ne intereseaza coloniile hemolitice la 24 ore.
• Se raporteaza :-Nr.total de germeni/m3 de aer
• Interpretare:-nr.total de germeni sa nu depaseasca 500-1500/m3 aer, in functie de gradul
de activitate, inceputul sau sfirsitul zilei de lucru
• max.300UFC/m3 aer in sali de operatii, nou-nascuti, cu absenta florei hemolitice

Analiza microbiologica a apei.

Apele medicale sunt utilizate pentru pacienti, personalul medical sau materiale.
Apa sterila
Se utilizeaza pentru spalarea mainilor chirurgilor, spalarea endoscoapelor dupa dezinfectie.
Apa sterila se obtine prin tratamente fizice (caldura, UV, filtrare) sau chimice (clorinare). Apa
sterila obtinuta prin filtrare se utilizeaza imediat fara a fi stocata.
Periodic, apa sterile este controlata: probele sunt prelevate din flacoanele de apa sterile care
contin 5-10 mg tiosulfat de sodium pentru a neutraliza urmele de clor prezente in apa. Apa sterile
nu trebuie sa contina niciun microorganism in 100 ml.

Apa pentru hemodializă

Se prepară din apa potabilă prin osmoză inversă sau prin trecere pe rășini cu schimbători
de ioni. Circuitul poate fi contaminat accidental în urma intervențiilor umane, a defecțiunilor
tehnice. Contaminanții pot contamina conductele, mai ales dacă există zone de stagnare (brațe
moarte, cuve de stocare).
 Deși membranele de dializă sunt impermeabile pentru bacterii și virusuri, există riscul
contaminării microbiologice asociat cu unele defecte de etanșeitate sau trecerea toxinelor
bacteriene. Neoficial se admite prezența a 10 bacterii/ml, în instalațiile moderne, dar
enterobacteriile și Pseudomonas trebuie să fie absente.

Apa din piscinele de recuperare medicală

Această apă este menținută constant la temperatură ridicată (28° C) și este un mediu
favorabil pentru proliferearea microorganismelor.
Controlul apei trebuie făcut la interval de cel puțin o lună și normele de igienă impun
prezența microorganismelor în anumite limite:
- microorganisme aerobe mezofile < 100/ml;
- coliformi totali < 10/100ml,
- coliformi fecali 0/100ml,
- stafilococi coagulazo-pozitivi 0/100m1,
- absența bacilului piocianic în 100ml apă.
Apa sterilă pentru preparate injectabile
Standardele USP XXII specifică: ” Apa pentru injecții este purificată prin distilare sau
osmoză inversă. ” Nu conține substanțe adăugate. Apa purificată și apa pentru injecții nu este
distribuită în containere. Aceasta este repartizată în recipiente, în doză mică, dar nu în volum mai
mare de 1 litru. Conținutul în endotoxină provenită de la bacteriile Gram-negative nu trebuie să
depășească 0,25 unități endotoxină per ml (UE/ml).

Tehnici microbiologice

Cercetarea microorganismelor în apa pentru dializă

a. Tehnica plăcilor cu geloză
-Mediu de cultură - geloză tripo-caseină soia, repartizat în volum de 15ml per tub; când se
lucrează geloza trebuie menținută la 440 C ± 20 C
-Diluent – apa distilată sterilă.
- Proba de examinat

Mod de lucru

Se introduce in placa Petri sterilă din proba de analizat și conținutul tubului de geloză topită,
care nu trebuie să depășească 45° C. Se incubează 24h la 30-35°C apoi 48 la 20 -21OC. 1 ml
din probă sau din diluții trebuie să conțină în final maximum 300 colonii.
 Interpretarea:

Se numără după fiecare perioadă de incubare coloniile apărute. Se evaluează numărul de colonii
per ml apă, ținând cont de diluție.

b. Tehnica filtrării prin membrană- cea mai utilizată metodă pentru analiza microbiologică a apei
este filtrarea prin membrane filtrante cu dimensiunuea porilor de 0,45 µm sau 22 µm.
- Mediul de cultură: geloză tripto-caseină soia repartizată în plăci Petri
- Diluent: apă distilată sterilă.
- Proba de examinat.
Mod de lucru:
Se filtrează prin membrană cu dimensiunea porilor de 0,45µ un eșantion din apă sau din
diluțiile preparate pentru a obține în final maximum 100 colonii (Fig.1). Membrana filtranță se
depune în placa cu mediu agarizat și se incubează la 30-350 C, 24 ore apoi la 20-21 0 C încă 48
ore,
Intrepretarea:
Se numără coloniile după fiecare perioadă de incubare. Rezultatul se exprimă în număr
microorganisme per ml, ținând cont și de eventuala diluție a probei.

Fig.1 Membrane filtrante

 Cercetarea microorganismelor în apa sterilă, apa pentru farmacie

Se aplică tehnica filtrării prin membrană cu porozitatea de 0,45µ. Se depune membrana filtrantă
pe mediul agarizat repartizat în placa Petri și după incubare 24 ore la 370 C și 48 ore la 200 C se
numără și se identifică coloniile apărute.

Punerea în evidența a microorganismelor patogene sau condiționat patogene

Staphylococcus aureus. La 100ml mediu Chapman lichid se adaugă 10ml din diluția 1:10 a
probei analizate și se omogenizează. Se incubează 24-48 ore la 35-370 C, după care se fac treceri
pe mediu Chapman solid, repartizat în plăci; se incubează 24 ore la 35-370 C. Apariția de colonii
galbene în jurul cărora mediul a virat în galben, indică prezența tulpinilor de S. aureus.

Pseudomonas aeruginosa. La 100ml mediu cu clorură de trifeniltetrazoliu în apă peptonată se

adaugă 10m1 din diluția 1:10 a probei studiate. Se omogenizeaž și se incubează la 35-370 C timp
de 24 ore, după care se fac treceri pe mediu gelozat cu bromură de cetiltrimetilamoniu și se
incubează 24 -48 ore la 35-370 C.
Dacă pe acest mediu apar colonii de culoare verde se fac din nou pasaje pe mediu
pentru piocianină. Apariția coloniilor albastre indică prezența bacilului piocianic.

Escherichia coli. La 100ml de mediu bulion lactozat se adaugă 10ml din diluția 1:10 a probei
analizate și se omogenizează. Se incubează 24 -48 ore la 35 - 370C după care se fac subculturi pe
mediu agarizat MacConkey. Se incubează 18-24 ore la 43-450C. Apariția unor colonii roșii
indică prezența bacteriei E. coli.

Salmonella. La 100ml mediu selenit-cisteină se adaugă 10 ml din diluția 1:10 a probei

investigate și se omogenizează. Se incubează 24-48 ore la 370C, după care se face subculturi pe
mediu agarizat Istrati-Meitert. Apariția coloniilor de culoare verde-albăstruie sau neagră,
înconjurate de un halou deschis la culoare indică prezența bacteriilor din genul Salmonella.
Confirmarea se face prin teste biochimice și serologice.
.
 Controlul sterilității produselor farmaceutice

Microorganismele care contaminează produsele farmaceutice se împart în două grupe:

patogene și saprofite.
Microorganismele saprofite, prezente în mediul înconjurător, reprezintă cea mai mare parte a
gemenilor izolați din produsele farmaceutice, contribuind la degradarea medicamentului.
Obținerea medicamentului pe cale industrială favorizează contaminarea microbiană.
Contaminarea este favorizată și de capacitatea metabolică a microorganismelor de a se adapta la
valori diferite de temperatură, pH, de a utiliza anumite substanțe ca unică sursă de carbon sau
azot din medicament. Astfel, Pseudomonas spp. utilizează pentru creștere, ca sursă de carbon,
unii compuși cu acțiune antimicrobiană: cresol, acid benzoic, fenol, acid salicilic, acid galic,
hidrochinona.
Unii conservanți pot induce rezistența la boratul fenilmercuric și polimixina B (fenomen
observat la Escherichia coli, Staphylococcus aureus).

Sursa de contaminarea a produselor farmaceutice poate fi:

1. Materia primă folosită la prepararea produsului: substanțe sintetice, semisintetice,
compuși de origine animală sau vegetală, adjuvanți, apă;
2. Echipamentul și recipientele
3. Aerul și mediul înconjurător
4. Operatorul
5. Recipientele (ambalajele) pentru produsul final
6. Modul de manipulare a medicamentului

Principalele microorganisme izolate din produsele farmaceutice

Din produsele farmaceutice au fost izolate diferite specii aerobe, anaerobe, patogene
condiționat patogene sau nepatogene pentru om, dintre care:
- Bacillus spp. Citrobacter, Escherichia coli, Serratia, Hafnia, Shigella, Haemophillus
influenzae, Staphylococcus spp., Micrococcus din colire.
- Klebsiella spp.. Pseudomonas spp., Staphylococcus, Candida albicans, Saccharomyces
cerevisiae din unguente.
- Pseudomonas spp. din apa sterilă, aparatura pentru distilarea apei.
- Enterobacteriaceae, Streptococcus faecalis din pudre, supozitoare, extract tiroidian,
granule, comprimate, produse chimice, organice și minerale, produse de origine
animală,
- Clostridium perfrigens, din fiole cu ser fiziologic, cu adrenalină.
- Clostridium tetani din catgut, talc, alcool medicinal.
 - Candida albicans, Penicillinum notatum, Saccharomyces cerevisiae, Klebsiella spp., din
antibiotice.

Microorganisme specifice

- Farmacopeele indică absența microorganismelor specifice din materiile prime, produsele

intermediare și produsul final.
- Enterobacteriile sunt un indicator general pentru contaminarea mediilor umede.
Escherichia coli este un indicator pentru contaminarea fecală și unele tulpini sunt
patogene.
- Salmonella spp. este un patogen care sugerează contaminarea fecală.
- Staphylococcus aureus este un patogen care este prezent pe tegument și mucoase, dar
cel mai bun indicator pentru contaminarea din sursă umană este S.epidermidis.
- Psedomonas aeruginosa este un patogen, indicator pentru apa contaminată.
- Clostridium este un indicator pentru contaminarea anaeroba.

Calitatea microbiologică a preparatelor farmaceutice Norme pentru produsele

farmaceutice

În procesul de obținere, ambalare, păstrare și distribuire a preparatelor farmaceutice, trebuie

luate o serie de măsuri pentru asigurarea calității microbiologice a acestora. Produsele
farmaceutice trebuie să se încadreze, conform anumitor criterii în 4 categorii (European
Farmacopeia, 1997).

Categoria 1. Produse farmaceutice obligatoriu sterile, care nu trebuie să conțină nici un

microorganism (preparate parenterale și oftalmice).

Categoria 2. Preparate pentru uz local și pentru tractusul respirator, cu excepția celor care
trebuie să fie sterile:
- Numărul total de microorganisme aerobe viabile nu trebuie să depășească 102 per
miligram sau mililitru.
- Nu mai mult de 101 enterobacterii și anumiți Gram negativi per miligram sau mililitru.
- Absența speciei Pseudomonas aeruginosa (la lg sau lml). Absența speciei
Staphylococcus aureus (la lg sau 1 ml).
Categoria 3.
A. Preparate pentru administrare orală și rectală.
- Nu mai mult de 103 bacterii aerobe și 102 fungi per gram sau per mililitru.
 - Absența speciei Escherichia coli (la lg sau lml)
B. Preparate pentru administrare orală care contin materii prime de origine naturală
(pentru care nu se poate face un pretratament antimicrobian și pentru care se acceptă o
contaminare microbiană mai mare de 103 microorganisme viabile per gram sau mililitru). Sunt
excluse remediile pe bază de plante descrise în categoria 4.
- Numărul total de microorganisme aerobe să nu depășească 104 bacterii și 102 fungi per
gram sau per mililitru.
- Nu mai mult de 102 enterobacterii și anumite alte specii Gram negative per gram sau per
mililitru. Salmonella — absent (la 10g sau 10ml).
- Escherichia coli — absent (la lg sau lml).
- Staphylococcus aureus — absent (la lg sau lml).
Categoria 4. Remedii pe bază de plante:
A. Remediile pe bază de plante, peste care se adaugă apă la temperatura de fierbere, înainte
de utilizare:
- Nu mai mult de 107 bacterii aerobe per gram sau per mililitru.
- Nu mai mult de 102 Escherichia coli per gram sau per mililitru.
B. Alte remedii pe bază de plante
- Nu mai mult de 105 bacterii aerobe și 104 fungi per gram sau per ml
- Nu mai mult de 103 enterobacterii și alți anumiți Gram negativi per gram sau per
mililitru.
- Escherichia coli — absent (la lg sau lml).
- Salmonella — absent (la 10g sau I Oml).

Teste pentru controlul sterilitatii produsului examinat

Se poate efectua prin metoda filtrarii prin membrane sau prin inoculare directa in mediul de
cultura a produsului examinat.
Filtrarea prin membrane este adecvata pentru produsele apoase, slab alcoolice, uleioase,
unguiente, crème, care pot fid use in solutie cu diluenti serili, lipsiti de activitate antimicrobiana.

I. Filtrarea prin membrana

Membrana filtranta are porozitatea de cel mult 0,45 µm care poate retine microorganismele.
Membranele filtrante confectionate din nitrat de celuloza se folosesc in cazul solutiilor apoase,
uleioase si slab alcoolice, iar cele confectionate din acetat de celuloza- pentru solutii puternic
alcoolice.

Apa pentru preparatele injectabile si solutii apoase

Membrana filtranta se umezeste in conditii aseptice cu un volum de diluant steril, cum ar fi 1
g/l solutie neutra de peptone si se filtreaza. Se transfera in conditii aseptice volumele necesare
pentru controlul sterilitatii, utilizand volume din proba de analizat( exp. pt. lichide : daca fiola
are 1ml – se foloseste intregul continut). Membrana filtranta se transfera pe medii de cultura
diferite . Incubarea se face pentru cel putin 14 zile la 30-35°C pentru bacteria si 20-25°C pentru
fungi.

Pulberi solubile - cantitatea de pulbere (pana la 50 mg - se foloseste intregul continut) este

solvita in diluent steril si se procedeaza ca in cazul solutiilor apoase.

Uleiuri si solutii uleioase – pentru fiecare mediu de cultura se foloseste 5-10 ml din proba de
analizat. Dacă au vâscozitate redusă, pot fi filtrate, fără diluare, printr-o membrana uscată.
Uleiurile și soluțiile uleioase vâscoase pot fi diluate cu un diluent steril (ex. miristat de
izopropil). După trecerea prin membrană (prin aplicarea lentă a vidului sau presiunii) aceasta se
spală de cel puțin trei ori cu câte 100ml diluent steril și se procedează în continuare ca pentru
soluțiile apoase.

Unguente și creme. Pentru fiecare mediu de cultură se folosește 0,5-1g din proba de analizat.
Unguentele cu excipienți grași și emulsiile de tipul apă în ulei pot fi diluate, dacă este necesar, cu
un diluent steril (ex. miristat de izopropil a cărui activitate anlimicrobiană a fost verificată).
Filtrarea se face rapid după care se procedează ca în cazul uleiurilor și solutiilor apoase

II. Inocularea directă în mediul de cultură

Direct în mediul de cultură se introduce cantitatea din proba de analizat, astfel încât volumul
produsului să nu fie mai mare de 10% din volumul mediului.
Activitatea antimicrobiană a probelor de analizar se neutralizează prin tratarea cu o substanță
sterilă corespunzătoare sau prin diluare.
Mediile însămânțate se incubează 14 zile la 30-35°C pentru bacterii și la 20-25°C pentru
fungi. Examinarea tuburilor se face zilnic.
Fig. 1 Sistemul steritest pentru verificarea sterilității produselor farmaceutice ambalate în fiole

Lichidele uleioase. Proba examinată se introduce în medii de cultură care conțin polisorbat 80
sau un alt agent de emulsionare.

Unguente și creme. Proba se emulsionează într-un volum de diluent steril (ex. soluție neutră de
peptonă 1%), care conține, când este necesar, un agent de emulsionare pentru a obține o diluție
de 1:10. Emulsia se însămânțează în mediu de cultură fără agent de emulsionare. Mediul inoculat
se incubează pentru cel puțin 14 zile. Se examinează culturile zilnic.

Pansamente chirurgicale. Fragmente de aproximativ 1cm2 din fiecare probă de analizat se

introduc în tuburi cu 100ml mediu de cultură.

Fire resorbabile sterile și alte fire chirurgicale. Se deschide aseptic un număr de recipiente și
se scot firele. Volumul de mediu utilizat trebuie să acopere complet proba examinată (20-
150ml).
 Interpretarea rezultatelor

Periodic și la final se examinează mediul de cultură pentru a evidenția macroscopic creșterea

bacteriană.

Stadiul l. Proba de analizat se consideră sterilă dacă toate tuburile cu mediile de cultură
însămâțate își păstrează transparența inițială pe toată perioada de incubare.

Dacă se constată creșterea microbiană, dar se pot demonstra greșeli în asigurarea condițiilor
aseptice pe parcursul efectuării testului, stadiul 1 nu este valabil și se repetă.

Dacă se constată creșterea microbiană fără a exista motive de invalidare a stadiului 1, se trece la
stadiul 2.

Stadiul 2. Se utilizează un număr dublu de tuburi față de stadiul l. Dacă este absentă creșterea,
proba de analizat este considerată sterilă. Dacă cultivarea este prezentă în unul sau mai multe
tuburi dintr-o serie, proba de analizat este necorespunzătoare.
 Controlul eficientei conservantilor antimicrobieni

Dacă preparatele farmaceutice nu au activitate antimicrobiană, în acestea sunt incorporate

agenți de prezervare, mai ales în preparatele apoase, pentru a preveni sau limita contaminarea
microbiană pe durata stocării și utilizării.
Conservanții incluși în mod special în recipientele multi-doze, protejează de o eventuală
infecție pacienții și previn contaminarea produsului.
Totuși agenții conservanți nu trebuie substituiți practicii bune de fabricație (Good
manufacturing practice).
Eficiența unui preservant antimicrobian poate fi amplificată sau diminuată de constituienții
activi ai preparatului, de formula în care este încorporat sau de containerul și sistemul de
închidere utilizat.

Testul pentru controlul eficienței prezervării antimicrobiene

Preparatul se inoculează, pe cât posibil în recipientul final cu o cantitate dintr-un
inoculum corespunzător și se menține la temperatura indicată. La anumite intervale de timp se
prelevă și se evaluează microorganismele din probă.
Proprietățile prezervantului din preparat sunt adecvate dacă, în condițiile testului, reduc
semnificativ sau nu permit creșterea numărului microorganismelor din preparatul inoculat după
intervalul și la temperatura indicată.
Criteriile admise, funcție de descreșterea numărului de microorganisme în timp, diferă
pentru diversele tipuri de preparate, conform gradului de protecție propus (tabelele 1,2 ,3).
Criteriul A exprimă eficiența recomandată care trebuie obținută. In anumite cazuri, când
criteriul A nu poate fi atins, de exemplu, din cauza riscului de creștere a reacțiilor adverse,
trebuie satisfăcut criteriul B.

Tabel 1 - Preparate parenterale și oftalmice (conform European Pharmacopeia.,1997)

Reducerea logaritmică
24h 7 zile 14 zile 28
6h
2 3 - Nerefacut
Bacterii A -
- 1 - Necrescut
Bacterii B 3
- - 2 - Necrescut
FungiA
- - - 1 Necrescut
Fungi B
Tabelul 2
Preparate topice ( conform European Pharmacopeia, 1997)
Reducerea logaritmică

2 zile 7 zile 14 zile 28 zile

Bacterii A 2 3 Necrescut
-
Bacterii B - - Necrescut
3
Fungi A - - 2 Necrescut

Fungi B - - 1 Necrescut

Tabelul 3 – Preparate orale( conform European Pharmacopeia, 1997)

Reducerea logaritmică

14 zile 28 zile
Bacterii 3 Necrescut
Fungi 1 Necrescut

Microorganismele test
Microorganismele test folosite pentru controlul eficienței conservanților antimicrobieni sunt
cele mai frecvent întilnite în procesul de fabricație, pe perioada conservării și utilizării
produselor, având risc crescut pentru contaminarea fpreparatelor farmaceutice. Perioada de
cel putin 28 de zile.
Testul se desfășoară în condiții care să evite contaminarea accidentală.
Microorganisme test:
Staphylococcus aureus A TCC 6538P
Pseudomonas aeruginosa A TCC 9027
Candida albicans ATCC 10231;
Aspergillus niger ATCC 16404.
 Pentru preparatele orale se mai folosește Escherichia coli, ATCC 8739, iar pentru
preparatele orale care conțin un procent ridicat de zahăr: Zygosaccharomyces rouxii.

Prepararea inoculului
Pe suprafața mediului de cultură solid se inoculează culturile stock ale
microorganismului test și se incubează la 30-350C (bacteriile), timp de 18-24 ore, respectiv
20-250C fungii, timp de 7 zile.
Pentru a obține suspensiile bacteriene și de Candida albicans, suprafața culturilor se spală cu
soluție sterilă izotonă de clorură de sodiu (9g/l NaCl) și se diluează până la concentrația de
aproximativ 108 microorganisme per mililitru. Pentru obținerea suspensiei de Aspergillus niger
se procedează la fel, cu mențiunea că soluția sterilă izotonă de NaCl conține polisorbat 80 -
0,05% m/U. Suspensiile se prepară înainte de folosire.

Tehnica de lucru
Evaluarea microorganismelor viabile inoculate în produsul de examinat se face pe medii
utilizate pentru cultivarea inițială a fiecărui microorganism.
Pentru fiecare 20ml sau 20g din proba de analizat se introduc 0,1ml inocul din suspensiile
microorganismului test, încât concentrația finală să fie de 105-106 per mililitru sau gram. Probele
se mențin la întuneric, la temperatura de 20-25°C.
Din probe se prelevă la intervale de 0h, 6h, 24h, 7 zile, 14 zile și 28 zile, câte lg sau lml.

Interpretarea rezultatelor
Conservantul antimicrobian este considerat eficient dacă numărul de microrganisme se
modifică conform tabelelor 1, 2, 3,
 Testul de pirogenitate
Din punct de vedere farmaceutic, pirogenele sunt substanțe responsabile de reacții febrile,
observate la om, în urma injecțiilor parenterale. Diverse substanțe produse de microorganisme,
se pot găsi în soluții injectabile și care trebuie eliminate în procesul de fabricație sau să se evite
prezența lor în soluții.
Substanțele pirogene introduse în produs în cursul fabricației provin mai ales de la
bacteriile Gram negative dar și alte microorganisme: ciuperci inferioare, levuri, virusuri, bacterii
Gram pozitive pot fi surse accesorii.
Activitatea pirogenică este asociată cu endotoxina peretelui bacteriilor vii sau omorâte. O
soluție poate fi sterilă dar pirogenă, dacă conține bacterii moarte sau fragmente din peretele
bacterian. Endotoxinele care provin de la bacteriile Gram negative sunt toxine
lipopolizaharidice cu greutate moleculară mare. Lipopolizaharidele (LPS) sunt macromolecule
constituite, de la exteriorul membranei spre interior din trei regiuni:
- un lanț poliosidic (antigenul 0 somatic, la bacteriile Gram negative responsabil de
specificitatea imunologică și serologică);
- un lanț poliosidic stabil (miezul);
- lanțuri de acizi grași asociați cu o glucosamină.
Acesta este lipidul A hidrofob toxic și cu activitate pirogenă, intercalat în membrana externă
a celulei bacteriene.

Contaminarea soluțiilor injectabile în timpul fabricării

In preparate, pirogenele pot avea trei origini:

- solventul — pentru volume mari acesta este exclusiv apa;

- substante solvite, de origine biologică (zaharuri, alcooli care derivă din ele, dextran,
aminoacizi, proteine plasmatice; sărurile minerale sunt mai rar pirogene);

- recipientele pot contine substante pirogene: endotoxine se absorb usor pe sticla sau
material plastic.
Metode de evidențiere a substantelor pirogene

Toate farmacopeele conțin specificații precise cu privire la substanțele pirogene prezente în

apă, soluții, pulberi, recipiente. Endotoxinele sunt cele mai frecvente pirogene prezente în
produsele farmaceutice.
 Testele pentru identificarea endotoxinei estimează concentrația endotoxinei bacteriene în
produsele farmaceutice.

a. Testul pe iepure
Controlul impurităților pirogene se bazează pe evaluarea temperaturii rectale a iepurilor,
după injectarea intravenoasă a soluției sterile sau a substanței de analizat.

Materiale necesare

- Termometre electrice pentru iepuri cu o sensibilitate de 0, 1 oC;

- Cutii de contenție care imobilizează animalele în poziție de repaus și permit scurgerea
urinii eliminate în cursul determinării;
- Seringi, ace, sticlărie, depirogenate după spălare, clătire cu apă pentru injecții și uscare,
prin căldură uscată (2500C, 30 minute sau 1800C, 2ore);
- Animale de experiență: iepuri maturi, sănătoși, menținuți în cuști individuale, la
temperatura ambiantă de 20 — 230C, cu regim alimentar normal și constant.
Greutatea acestora nu trebuie să fie mai mică de 1,5 Kg.
Trebuie eliminate perturbările care vin din exterior. Pentru acomodarea la aceste condiții sunt
necesare cel puțin 7 zile înainte de începerea testului.
Pentru controlul impurităților pirogene se admit numai animalele care răspund la testarea
reactivității termice (prin administrarea i.v. a l mg/kg corp ribonucleinat de sodiu soluție) cu o
modificare maximă de temperatură de 0,750C - 1,50C.
Animalele a căror temperatură inițială nu este cuprinsă între 38,80C și 39,80C sunt excluse
din test. Nu se utilizează animale care înainte cu 3 zile au fost utilizate în teste de pirogenitate
cu rezultat negativ sau înainte cu 3 săptămâni în teste de pirogenitate pozitive.

Tehnica de lucru
Testul se efectuează pe 3 iepuri (dacă nu se prevede altfel) într-o încăpere liniștită, a cărei
temperatură nu trebuie să difere cu mai mult de 30C față de încăperile de cazare.
In fiecare lot de 3 iepuri, diferența de greutate între animale nu trebuie să depășească 300gr.,
iar diferența între temperaturile inițiale să nu fie mai mare de 10C. Animalele se introduc în cutia
de contenție cu cel puțin o oră înaintea înregistrării primei temperaturi de control. Inaintea
administrării soluției de analizat se iau două temperaturi de control: prima, cu 30-40 minute
înaintea administrării și a doua imediat înaintea administrării.
Administrarea se face intravenos, în vena marginală a urechii, dacă nu se indică altfel, într-
un timp care să nu dapășească 4 minute. Pentru volume care depășesc 5ml/kg corp, soluțiile
administrate trebuie să aibă temperatura de aproximativ 38,50C. Volumul administrării nu trebuie
să fie mai mic de 0,5 ml dar să nu depășească 10 ml per kg corp. Dizolvarea sau diluarea
produselor de analizat se efectuează cu soluție 9 g/l NaCl apirogenă sau cu un alt lichid indicat.
După administrare, iepurii se mențin în aceleași condiții pentru 3 ore, timp în care se
măsoară de 4 ori temperatura, la intervale de 45 minute, dacă nu se indică altfel.

Interpretarea rezultatelor
Proba de analizat este corespunzătoare dacă suma modificărilor individuale maxime de
temperatură a celor trei animale din lot nu depășește 1,150C; dacă valoarea depășește 2,650C
proba este respinsă; dacă valoarea este cuprinsă între 1,150C și 2,650C, determinarea se repetă
pe alte trei animale, iar interpretarea se face conform tabelului 1. Dacă se obține din nou o
valoare cuprinsă între aceea la care proba poate fi admisă și aceea la care proba trebuie
respinsă, se repetă determinarea, în condițiile indicate anterior până se ajunge la un total de
maximum 12 animale.
Recent a fost pus la punct un test de pirogenitate care utilizează monocite umane sau
culturi de celule care , dupa validare, poate înlocui testul pe iepure.

b. Determinarea endotoxinelor bacteriene cu lizatul amoebocitelor de Limulus (testul

LAL)
Testul pentru endotoxinele bacteriene este utilizat în scopul detectării sau cuantificării
endotoxinelor provenite de la bacteriile Gram negative.
Tabel 1- Interpretarea creșterilor termice la iepurii utilizați pentru studierea substanțelor
pirogene ( după Farmacopeea Română X, 1993)

Număr de iepuri Produsul este corespunzător Produsul nu este corespunzător

dacă suma creșterilor maxime dacă suma de creșterilor
de temperatură nu depășește: maxime de temperatură
depășește:

3 1,150C 2,650C
6 2,800C 4,300C
9 4,450C 5,950C
12 6,600C 6,600C

Aceste endotoxine (lipopolisaharide) care contaminează produsele farmaceutice sunt cea mai
frecventă cauză a reacțiilor toxice. Activitatea pirogenică a acestora este mult mai intensă decât a
altor substanțe pirogene. Prezența endotoxinelor în produs poate fi mascată de factori care
interferă cu reacția dintre endotoxină și lizatul amoebocitic. Endotoxinele pot fi absorbite pe
suprafața tuburilor sau pipetelor confecționate din anumite tipuri de material plastic sau sticlă;
este posibil ca din aceste materiale să se elibereze substanțe interferente, Limita endotoxinei
pentru substanțe active administrate parenteral, definită pe baza unei doze este K/M unde K —
doza pirogenică limită de endotoxină per Kg corp într-un interval de o oră; M — doza maximă
recomandată a produsului per Kg corp într-un interval de o oră. Activitatea endotoxinică se
exprimă în unități endotoxinice (UE)/ml sau mg. Limita endotoxinei depinde de produs și de
calea de administrare, Valorile K sunt prezentate în tabelul 2. Doza maximă de 5 UE/Kg poate
cauza la om o stare febrilă ușoară la aproximativ jumătate din pacienți, dar nu determină șocul
endotoxinic sau moartea.
Limita de detectie a endotoxinei prin testul LAL este de 0,03 UE/ml.
Principiul metodei
Adiționarea unei soluții care conține endotoxina la o soluție de lizat amoebocitic produce o
turbiditate, o precipitare sau o gelificare a amestecului.
Viteza de reacție depinde de concentrația endotoxinelor, pH și temperatură.
Lizatul amoebocitic de l,imulus conține o proenzima si o protein coagulogena. In prima etapă
a reacției endotoxinele transforma proenzima în enzimă activată în prezența ionilor de Ca++.
Tabel 2 - Valorile K pentru diverse produse și căi de administrare
(conform European Farmacopoeia, ed.a IV-a, 2002)
Calea de administrare K (UI endotoxină per Kg corp.per oră)
Intravenos 5,0
Intravenos pentru
2,5
radiofarmaceutice
0,2
Intratecal

In a doua faza, enzima activată catalizează transformarea coagulogenului solubil într-o proteină
insolubilă (coagulina) și nu peptid solubil. In timpul trei al reacției, coagulina creează turbiditate;
gelul trebuie să rămână solid la 1800C.
Pentru soluțiile perfuzabile în cantități mari și într-un timp scurt (hemodializă, reanimare)
nivelul endotoxinelor trebuie să fie mai mic de 0,4 UE/ml și este indicat să coboare chiar sub
0,2UE/ml.
Metoda turbidimetrică este o variantă a gelificării; reactivul turbidimetric conține
coagulogen și produce o tulburare a soluției (nu un gel ferm) după combinarea cu enzima
gelifiantă. Intensitatea opacifierii este proporțională cu cantitatea de enzimă de gelificare și cu
cantitatea de endotoxină prezentă în soluția testată. După o incubare adecvată se citește
densitatea optică a reacțiilor soluțiilor etalon de endotoxină spectrofotometric la lungimea de
undă de 360nm), se construiește curba standard și prin extrapolare se determină concentrația de
endotoxină din probă. Este o metodă cantitativă, a cărei sensibilitate este de 0,005 UE/ml.
Metoda cromogenică a înlocuit enzima de gelificare (coagulogenul) cu un substrat
cromogenic ( un mic peptid sintetic care conține aceeași secvență de acizi aminici ca în proteina
gelifiantă. Substraturile disponibile care conțin paranitroanilida eliberează paranitranilină care
este colorată în galben. Absorbanța se citește la 405nm. Ca și în testul turbidimetric, se trasează
curba etalon plecând de la soluția standard de endotoxină.