Tehnica ELISA

Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay

Biochimie Medicina dentara

ELISA

•Ce este ELISA?

•Tipuri

•Aplicatii

•Principiu

Biochimie Medicina dentara

ELISA

• Evaluarea prezentei si concentratiei anticorpilor si

Ce este?
antigenilor dintr-o proba

• Primele studii au fost facute in 1971 folosita pentru

screeningul HIV

• O tehnica biochimica folosita in special in imunologie

• Primul si cel mai comun test folosit pentru detectarea

unui patogen dintr-o proba

• Avantaje - sensitiva (0.01-10ng/ml)

- cantitativa
- reproductibila
- format de kit

Biochimie Medicina dentara

ELISA

Tipuri • ELISA Calitativa

- rezultatele sunt pozitive sau negative
• ELISA Cantitativa
- densitatea optica a probei este comparata
cu un standard

• ELISA - indirecta
- competitiva
- sandwich (directa)

Biochimie Medicina dentara

ELISA

Aplicatii • Evaluarea cantitativa/calitativa a anticorpilor si antigenilor

dintr-o proba

• Medicina: metoda de diagnostic - HIV, holera, boli

venerice, gripa aviara sau porcina, hormoni (sarcina)

• Industria alimentara: detectarea alergenilor din mancare

lapte, alune, oua

• Toxicologie: detectarea drogurilor

• Cercetare

Biochimie Medicina dentara

ELISA Epitop

Antigen

Principiu •Ce este un antigen?

•Ce este un anticorp?

Anticorp

•Enzyme-linked immunosorbent assay: numele sugereaza

3 componente
Anticorp - permite detectia analitului de interes
Faza solida - suportul unde are loc adsorbtia
Enzima - determina schimbarea de culoare-semnalu

Biochimie Medicina dentara

ELISA ELISA-sandwich
direct

1 Primul anticorp
Principiu

2 Antigenul

Al doilea anticorp
3
conjugat cu enzima

Biochimie Medicina dentara

ELISA
substrat

Principiu

produs

proba

standard

Biochimie Medicina dentara

Tehnica PCR
Polymerase Chain Reaction

Biochimie Medicina dentara

PCR

•Ce este PCR?

•Tipuri

•Aplicatii

•Principiu

Biochimie Medicina dentara

 PCR • Polymerase Chain Reaction (Reactia in lant a
polimerazei)

• Mullis & Faloona – Specific synthesis of DNA in

vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction,
Ce este? 1987

• Mullis: Premiul Nobel, Chimie, 1993

• Amplificarea cu ajutorul unei enzime (ADN-

polimeraza) a numărului de copii ale unei regiuni
specifice dintr-un lanţ ADN
Kary Mullis

Biochimie Medicina dentara

 PCR

Tipuri • Exista multe variatii ale acestei tehnici: long PCR, late PCR
in situ PCR, colony PCR, single cell PCR

• Cele mai folosite:

- standard PCR
- RT-PCR ( real-time)

Biochimie Medicina dentara

 PCR
•Testarea unor mutatii (ex.: fibroza chistica, gene tumorale)

•Testare prenatala (si screening preimplantare)

Aplicatii
•Infectii virale (HIV), bacteriene (BK)

•Teste de histocompatibilitate

•Medicina legala

•Teste de paternitate

•Identificarea de persoane

•Cladistica
clade

Biochimie Medicina dentara

 PCR
Materiale

•ADN de amplificat: Sange, Sperma, Par, Periuta de

dinti, Insecte (in chilhlimbar), Mumii, Amprente, Urina
Principiu
•Primeri (oligonucleotide, amplimeri) : 20-30 de
dezoxiribonucleotide complementare extremitatilor
5’ sau 3’ ale fragmentului de amplificat

•ADN-polimeraza : enzima care catalizeaza

polimerizarea dTNP in catene ADN (elongarea
primerilor)
Colectare probe ADN
•dNTP (dezoxiribonucleotid trifosfati)

•Solutie tampon

Biochimie Medicina dentara

 PCR

Principiu Etapele PCR

• Denaturarea ADN-ului dublu catenar

• Cuplarea primerilor de ADN-ul simplu

catenar

• Extensia primerilor

Biochimie Medicina dentara

 PCR Denaturarea ADN
• 94-98 ºC, 20-30 de secunde
• ADN-ul este desfasurat in doua
lanturi ADN simplu-catenare
complementare

Principiu
Cuplarea primerilor

• 50-65 ºC, 20-40 de secunde

• Lant dublu-catenar hibrid –
primeri si ADN de amplificat

Extensia primerilor
• ADN-polimeraza: Se leaga de
lantul hibrid „Citeste”
secvenţa lantului ADN-tinta;
Alungeste primerii prin
adaugarea de dNTP, pe baza
regulii complementaritatii

Biochimie Medicina dentara

 PCR

Amplificarea
Principiu

Vizualizare produsi de amplificare

MW: dimensiuni cunoscute

1: ~1850 bp
2: ~800 bp
3: nu s-a amplificat
4: ~800 bp
5: benzi multiple

Biochimie Medicina dentara

 2. PRINCIPIUL SEPARĂRII CROMATOGRAFICE

Principiul de bază al separării cromatografice constă în distribuţia inegală

a componentelor unui amestec între faza mobilă şi faza staţionară. Acest
amestec străbate sistemul cromatografic, fiind antrenat de către faza
mobilă.
Distribuţia inegală este determinată fie de afinitatea diferită a
componentelor amestecului faţă de cele două faze, fie de capacitatea
diferită de a difuza în acestea.
Acest principiu este ilustrat în Figura 1, pe un exemplu din cromatografia
de gaze pe coloane capilare. Aceste coloane se caracterizează prin faptul că
faza staţionară se găseşte depusă în strat foarte subţire pe pereţii coloanei.
 Moleculele celor doi compuşi, 1 şi 2 care
se găsesc în momentul iniţial ametecate,
într-un volum restrâns, vor avea
tendinţa de a se transfera continuu din
faza mobilă în faza staţionară şi invers,
din cauza agitaţiei termice. Deoarece
moleculele compusului 2 au o afinitate
mai mare faţă de faza staţionară, ele
vor fi mai puternic reţinute în această
fază.
Drept urmare, după un anumit interval
de timp se va înregistra o rămânere în
urmă a acestei componente, comparativ
cu componenta mai slab reţinută 1.
Trebuie remarcat faptul că această
separare are loc în timpul deplasării în
coloană, deci este in proces dinamic.

Fig.1.- Principiul separării cromatografice

4. SCHEMA DE PRINCIPIU A CROMATOGRAFULUI

1 - rezervor fază
mobilă
2 - dispozitiv de
reglare şi măsurare a
debitului
3 -dispozitiv de
introducere a probei
4-coloană
cromatografică
5 - detector
6-înregistrator sau
integrator
Fig. 2.- Schema de principiu a cromatografului
 ELECTROFOREZA PROTEINELOR IN GEL

Proteina Proteina + SDS SDS-PAGE Curent electric

1 2 1 2
S

SD
SD

SDS

1 2 3 4
Proteina de SDS confera o Proteina se incarca pe gel. Proteinele migreaza
determinat sarcina negativa 1: proteine marker in campul electric
uniforma proteinei 2: proteina de determinat in functie de dimensiune
 ELECTROFOREZA BI-DIMENSIONALA

(+) (-)

Punct isoelectric (pI)

Greutate moleculara

Curent electric
(-) (+)

Extract proteine Focalizare Electroforeza SDS-PAGE

izoelectrica
 CENTRIFUGAREA

g=600 g=15000 g=100000 g=300000

10’ 15’ 60’ 120’

Extract celular Nucleu Mitocondrie Membrana plasmatica Ribozom

Citoschelet Lizozom Reticul endoplasmic Macromolecule
ADN Proteine

Centrifugarea schema: componentele subcelulare pot fi separate folosind forte

centrifuge diferite ( vezi g) pentru anumite perioade de timp ( exprimate in minute)
Centrifuga cu spirală (an 1905)
Folosita pentru urina, apa şi lapte
(2-3000 rotaţii pe minut) si pentru
sânge şi sputa (10-12000 rotaţii
pe minut)
Centrifuga digitala cu sistem de
refrigerare ( an 2010)
Pentru extragerea si purificarea
acizilor nucleici, procesarea probelor
de sange sau probelor PCR