25.03.

2024

Singurul om care este educat e acela care a

învățat cum să învețe și cum să se schimbe.
Carl Rogers

Metode de
analiză a genelor

Expresia genelor
ADN → ARNm → Proteină → Caracter
5’-ATTGCAAGATTACCATGT-3’ Catena codogenă (netranscrisă)
3’-TAACGTTCTAATGGTACA-5’ Catena anticodogenă (transcrisă)
Transcripţie
5’-AUUGCAAGAUUACCAUGU-3’ ARNm

Translaţie
Leu – Ala – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptid
Maturizare
Caracter fenotipic normal

1
 25.03.2024

Expresia genelor
ADNmut →ARNmmut → Proteinăan → Caracteran

5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’ mutaţie G4→A

3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
Transcripţie
5’-AUUACAAGAUUACCAUGU-3’ ARNmmut

Translaţie
Leu – Thr – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptidan

Caracter fenotipic anormal

Analiza genelor
ADN ARN Proteine

Secvențiere Northern-
Western-blot
NGS, WGS, WES blot

PCR
AS-PCR, Q-PCR, RT-PCR Secvențiere
Multiplex

Southern- Hibridarea Analiza

blot in situ histochimică

Hibridarea Analiza
in situ funcției

Utilizarea tehnicilor de analiză a acizilor

nucleici în medicină

Testarea ADN pentru Diagnostic precis al bolilor

prezența mutațiilor

Terapie de substituție
Tratament adecvat Terapie de blocare a genei patologice
Terapie genică

Identificarea ADN-ului Diagnosticul precis al infecţiilor

străin

Identificarea
analiza filiației
polimorfismelor identificarea persoanelor
individuale

Pașaportul genetic Inregistrarea predispoziţiei la anumite boli

2
 25.03.2024

Utilizarea tehnicilor de analiză a acizilor

nucleici în medicină

Analiza ADN:
• depistarea mutaţiilor genice → diagnostic precis al bolilor
genetice (prenatal, postnatal precoce);
• identificarea polimorfismului individual → dactiloscopie
genomică (analiza filiaţiei);
• depistarea ADN străin (bacterian, viral) → diagnosticul bolilor
infecţioase şi gradului de infectare.

Analiza ARNm:
• analiza expresiei genice ţesut-specifică;
• evaluarea gradului de expresie a genei normale / patologice;
• depistarea agenților infecțioși (ribovirusuri). 7

Studiul
genelor

Identificarea
Identificarea
variațiilor în expresia
variațiilor în ADN
genelor

Variații în secvența Variații cantitative /

Modificări Variații cantitative /
de nucleotide / calitative ale
epigenetice calitative ale ARNm
mutații proteinei

polimorfisme polimorfisme polimorfisme

blocarea / activarea
patologice patologice patologice
unei gene
de susceptibilitate de susceptibilitate de susceptibilitate

Metode: Metode: Metode: Metode:

Studiul genelor

Orice celulă Țesut cu expresie

nucleată / țesut probabilă a genei

Izolarea ADN
Izolarea ARN
nuclear

Analiza genei Izolarea genei Analiza ARNm Izolarea ARNm

Depistarea mutațiilor:
Secvențiere Inserarea în vector Stabilirea structurii
de clonare Obținerea ADNc
PCR Stabilirea cantității
Terapia genică
RFLPs
9

3
 25.03.2024

Izolarea acizilor nucleici

ADN
Colectarea materialului biologic
• (celule nucleate din orice ţesut)

Izolarea nucleilor (opţional)

• prin lezarea celulelor în soluţii hipotonice

Lezarea celulelor (nucleilor)

• prin acţiunea detergenţilor

Deproteinizarea:
• prin acţiunea proteazelor, urmată de prelucrarea
cu solvenţi organici (fenol, cloroform)

Precipitarea acizilor nucleici

• în prezenţa alcoolilor şi a sărurilor (70% etanol)

10

Izolarea acizilor nucleici

ARN
Colectarea materialului biologic
• din ţesutul de interes la stadia de interes

Lezarea celulelor
• în prezenţa detergenţilor şi a inhibitorilor de ARN-aze

Deproteinizarea
• cu utilizarea solvenţilor organici

Precipitarea selectivă a ARN

• în prezenţa sărurilor (LiCl, CH3COONa)

Precipitarea ARN
• în prezenţa alcoolului.

11

Vizualizarea acizilor nucleici

Colorare Hibridare
Bromură de
Fuxină bazică Sonde calde Sonde reci
etidiu
(in situ) (radioactive) (fluorescente)
(în geluri)

Necesită cantități mari Necesită cunoașterea

de material secvenței analizate

12

12

4
 25.03.2024

PCR – reacția de polimerizare în lanț

Ţinta cercetrii
• ADN genic şi extragenic

Materialul biologic cercetat

• Orice celulă nucleată a individului testat / material biologic potențial infectat

Scopul cercetării
• Amplificarea specifică a unei secvenţe de ADN
• Identificarea variantei genei (normală sau mutantă)
• Identificarea polimorfismului ADN
• Marker individual (dactiloscopie genomică)
• Marker al unei gene patologice
Aplicaţii în medicină
• Depistarea mutaţiilor genice
• Deleţii nucleotidice
• Inserții nucleotidice
• Substituţii nucleotidice
• Diagnosticul precis şi precoce a bolilor genetice:
• Boli monogenice (prenatal / postnatal / presimptomatic)
• Boli poligenice (predispoziția)
• Boli infecțioase (calitativ și cantitativ)

!!!Limite

13

Componentele necesare pentru

clonarea in vitro (PCR):
• ADN de cercetat
• 2 primeri specifici, complimentari extremităților
secvenței clonate
• Taq-polimeraza – ADN-polimerază termostabilă
• Dezoxiribonucleozidtrifosfaţi (dNTPs)
• Instalație de modificare ciclică a temperaturii:
• - tº de denaturare ADN
• - tº de renaturare (ADN+primer)
• - tº de polimerizare (extinderea catenelor noi
de ADN)
14

14

PCR – reacția de polimerizare în lanț

Principiile PCR → clonarea in vitro = amplificare

• Replicare semiconservativă, repetată
• Specificitatea primerilor sintetici pentru gena–ţintă
• Hibridizarea ADN-ţintă – primer complementar:
• Denaturare termică a ADN - de cercetat
Modificarea ciclică a temperaturii:
• Denaturare
• Renaturare
• Sinteză

15

15

5
 25.03.2024

Etapele tehnicii PCR

A. Pregătirea amestecului cu toate componentele reactante

B. Repetarea automată a procedurilor de denaturare-

renaturare-elongare de 30-35 ori
•Denaturarea ADN la 96oC
•Răcirea până la temperatura de renaturare a primerilor
•Elongarea catenelor ADN la 72oC

C. Analiza produşilor PCR

- electroforeza
- colorarea
- interpretarea rezultatelor

16

16

Extragerea ADN Pregătirea Amplificarea

componentelor pentru
ADN-ţintă
PCR

Electroforeza Colorarea și Interpretarea

produselor PCR vizualizarea rezultatelor
produselor PCR 17

17

18

18

6
 25.03.2024

19

19

20

20

Avantajele PCR
• Metodă rapidă
• Metodă ieftină
• Utilizarea cantităților mici de material analizat
• Nu necesită izotopi radioactivi
• Interpretarea ușoară a rezultatelor

Dezavantajele PCR
• Necesitatea cunoașterii secvenței nucleotidice
amplificate
• Necesitatea primerilor sintetici, specifici secvenței
analizate
21

21

7
 25.03.2024

Utilizarea PCR
• Identificarea inserțiilor/diluțiilor nucleotidice
• Identificarea mutațiilor punctiforme
(substituțiile nucleotidice)
• Identificarea expresiei genice (RT-PCR)
• Dactiloscopia genomică (filiație)
• Identificarea agenților infecțioși
• Identificarea gradului de infecție (quantitative
PCR)
• Identificarea produselor PCR în timp real
(Real-Time PCR)

22

22

Identificarea inserţiilor / deleţiilor

23

23

Identificarea agenţilor infecţioşi

24

24

8
 25.03.2024

25

25

Stabilirea paternităţii (filiaţiei)

26

26

Optimizarea condiţiilor de desfăşurare a PCR

Concentraţiile critice ale substanţelor pentru inhibarea activităţii Taq-polimerazei

Substanţa Concentraţia critică

SDS >0.005% (m/v)

Fenol >0.2% (v/v)
Etanol >1% (v/v)
Isopropanol >1% (v/v)
CH3COONa >5 mM
NaCl >25 mM
EDTA >0.5 mM

Dependenţa cantităţii de produse amplificate de concentraţia ADN genomic utilizată în PCR.

S-a utilizat ADN în cantitate de: 1 – 0,5 μg, 2 – 0,25 μg, 3 – 0,1 μg, 4 – 0,02 μg

27

27

9
 25.03.2024

Optimizarea condiţiilor de
desfăşurare a PCR
Caracteristica primerilor utilizaţi în PCR

Gena Secvenţa Lungimea, baze % G+C Tm, oC

5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’ 24 54 59
ACE
5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’ 25 48 58
5’-CTGGCTCCTTGCTGGTGTGG-3’ 20 65 58
AT1 R
5’-GGGCAAGCGTATATTTTCTGGTG-3’ 23 48 55
5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3' 22 55 57
NOS
5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3' 24 54 59

Dependența cantității produselor PCR de temperatura de renaturare a primerilor.

În condițiile PCR s-a utilizat: 1 – toC optimală -5oC; 2 – toC optimală; 3 – toC optimală +5oC.
28

28

Analiza polimorfismului I/D pentru gena ACE

I
D

Analiza electroforetică în gel de agaroză de 2% a produselor PCR rezultate

din amplificarea ADN uman cu primeri corespunzători genei ACE.
M – marcher al lungimii; 1 – genotip I/D; 2 – genotip D/D; 3 – genotip I/I.

29

29

Analiza polimorfismului G/T pentru gena NOS

M 1 2 3

G
T

Rezultatele amplificării ADN uman cu primeri corespunzători genei NOS.

M – marcher al lungimii; 1 – genotip G/G; 2 – genotip T/T; 3 – genotip G/T.

30

30

10
 25.03.2024

Analiza polimorfismului A/C pentru gena AT1 R

Rezultatele amplificării ADN uman cu primeri corespunzători

genei AT1 R digerate cu ajutorul enzimei Dde I.
M – marcher al lungimii; 1 – genotip A/A; 2 – genotip A/C
31

31

Tehnica Real-time-PCR

32

32

Utilizarea tehnicii microarray

• Izolarea ARN din diferite ţesuturi
• Izolarea ARNm
• Amplificarea prin intermediul RT-PCR
• Marcarea cu agenţi fluorescenţi
• Hibridarea cu ADN fixat în micocipuri
• Analiza rezultatelor

33

33

11
 25.03.2024

Etapele microarray

34

34

Hibridarea acizilor nucleici

• Unirea complementară a fragmentelor
(moleculelor) de acizi nucleici:
• ADN de cercetat cu
• sonda oligonucleotidică
• În reacție participă molecule monocatenare
• Moleculele ADN-țintă sunt fixate
• Moleculele-sonde sunt marcate radioactiv
sau fluorescent
• Identificarea complexelor hibride se
realizează prin intermediul autoradiografiei
35

35

Tehnica Southern-blot
Ţinta cercetrii
• ADN genic şi extragenic

Materialul biologic cercetat

• Orice celulă nucleată a individului testat / țesut potențial infectat

Scopul cercetării
• Analiza Polimorfismului Lungimii Fragmentelor de Restricție (RFLPs)
• Identificarea variantei genei (normală sau mutantă)
• Identificarea polimorfismului ADN
• Marker individual (dactiloscopie genomică)
• Marker al unei gene patologice

Aplicaţii în medicină
• Depistarea mutaţiilor genice
• Substituții nucleotidice în SR
• Deleții nucleotidice mari (mici, dacă afectează SR)
• Inserții nucleotidice mari (mici, dacă afectează SR)
• Diagnosticul precis și precoce a bolilor genetice:
• Boli monogenice
• Boli poligenice
• Boli infecțioase

36

12
 25.03.2024

Tehnica Southern-blot
• Bazată pe RFLPs
• Hibridizare cu sonde marcate
• Cu transferul FR din gel-electroforeză pe un suport
solid (pe membrane de nitroceluloză)
Componente necesare
• ADN genomic
• Enzime de restricție
• Instalație electroforeză
• Membrană nailon
• Sondă marcată (radioactiv / fluorescent)
• Film fotosensibil

37

37

Obţinerea FR – fragmentelor de restricţie prin

acţiunea specifică a ER (enzimelor de restricţie)

38

38

RFLPs – polimorfismul FR la două persoane X şi Z

39

39

13
 25.03.2024

-
12 kb

10 kb 10 kb

8 kb

6 kb 6 kb
2,5 kb

10 kb 5 kb
6 kb 4 kb
5 kb
2,5 kb
2 kb

+
M

40

40

Tehnica Southern-blot

Extragerea ADN Restriţia ADN Electroforeza ADN

Denaturarea şi Hibridare cu sonda Autoradiografia

transferul ADN
pe membrane Vizualizarea şi
interpretarea
rezultatelor
41

41

42

42

14
 25.03.2024

Utilizarea tehnicii Southern-blot

• Identificarea inserțiilor / delețiilor mari
• Identificarea mutațiilor punctiforme ce
afectează SR
• Dactiloscopia genomică RFLPs

43

43

RFLPs şi analiza genotipului

Alela Normală cu 3 SR Alela mutantă cu 2 SR, mutaţie în SR2

A (NN)

B (Nm)

C (mm)

Electroforeza FR a 3 persoane A,B şi C

44

44

45

45

15
 25.03.2024

Avantajele Southern-blot
• Este metodă foarte precisă
• Nu necesită cunoaşterea secvenţei nucleotidice
analizate
• Nu necesită primeri sintetici

Dezavantajele Southern-blot
• Necesită cunoaşterea hărţii de restricţie a genei ţintă
• Necesită cantităţi mari de material biologic
• Metodă laborioasă, cu multe etape
• Necesită izotopi radioactivi
• Necesită materiale costisitoare
46

46

Tehnica Northern-
blot
• Extragerea ARN din
țesutul țintă
• Electroforeza ARN în
condiții de denaturare
• Transfer pe membrană de
nailon
• Hibridarea cu sonda
marcată
• Autoradiografia

47

47

Tehnica Northern-blot

Extragerea ARN Electroforeza ARN

Hibridare cu sonda Autoradiografia

Transferul ARN
pe membrane Vizualizarea şi
interpretarea
rezultatelor
48

48

16
 25.03.2024

Utilizarea tehnicii
Northern-blot
• Identificarea expresiei genice în
anumite țesuturi, anumite condiții
• Identificarea variantei de splicing a
proARNm
• Identificarea nivelului de expresie
• Identificarea agenților infecțioși
(ribovirusuri)

49

49

Identificarea nivelului
de expresie şi a variantei
de splicing

50

50

51

51

17
 25.03.2024

Secvenţierea ADN

Stabilirea secvenţei de nucleotide

• Metoda chimică (tehnica Maxam-Gilbert,
1973)
• Metoda dideoxi (tehnica Sanger, 1975)
• Metoda automată (cu utilizarea agenților
fluorescenți)
• NGS (New Generation Sequencing)

52

52

Secvențierea ADN
Ţinta cercetrii
• ADN genic şi extragenic

Materialul biologic cercetat

• Orice celulă nucleată a individului testat

Scopul cercetării
• Identificarea secvenţei nucleotidice a genei analizate
• Identificarea variantei genei (normală sau mutantă)
• Identificarea polimorfismului ADN
• Marker individual (dactiloscopie genomică)
• Marker al unei gene patologice

Aplicaţii în medicină
• Depistarea mutaţiilor genice
• Substituţii nucleotidice
• Deleții nucleotidice mici
• Inserții nucleotidice mici
• Diagnosticul precis şi precoce a bolilor genetice:
• Boli monogenice
• Boli poligenice
• Boli infecţioase

53

Componentele necesare pentru

secvențiere prin tehnica di-deoxi:
• ADN de cercetat
• 1 primer specific complimentar regiunii 5’ (marcat
radioactiv / fluorescent)
• ADN-polimeraza
• Dezoxiribonucleozidtrifosfaţi (dNTPs)
• Dideoxiribonucleozidtrifosfaţi (ddNTP)
• Instalație pentru electroforeză
• Film fotosensibil

54

54

18
 25.03.2024

Tehnica
dideoxi
• Sinteza enzimatică a
ADN

• Utilizarea în paralel
a nucleotidelor ce
conțin deoxiriboză
și dideoxiriboză

• Stoparea sintezei în
cazul incorporării
ddNTP
55

55

Tehnica dideoxi

Extragerea ADN

Denaturarea ADN

Sinteza catenelor complementare

utilizând primeri marcaţi cu 32P în
prezenţa dNTP şi ddNTP

Electroforeza în condiţii de denaturare

Vizualizarea fragmentelor marcate prin

autoradiografie

56

56

Secvențierea ADN
1. Extragerea ADN genomic
5. Electroforeza
2. Denaturarea ADN
genomic;
hibridizarea cu 1
primer marcat
radioactiv
6. Separarea
3. Pregătirea a 4 fragmentelor după
serii de reacții de lungime
sinteza a ADN în
prezența ddNTP

4. Sinteza 7. Autoradiografia
complementară a Citirea și
catenei matriță a interpretarea
ADN, stopată rezultatelor
specific de un
ddNTP

57

19
 25.03.2024

5’-ATTACA-3’
5’-ATTACAA-3’
A 5’-ATTACAAGA-3’
5’-ATTACAAGATTA-3’
5’-ATTACAAGATTACCA-3’
A T C G
5’-ATTACAAGAT-3’ -
5’-ATTACAAGATT-3’
T
5’-ATTACAAGATTACCAT-3’
5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’
5’-ATTACAAG-3’
G
5’-ATTACAAGATTACCATG-3’
5’-ATTAC-3’
+
C 5’-ATTACAAGATTAC-3’
5’-ATTACAAGATTACC-3’ 5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’
58

58

(+) 5' TAAATGGCTA.......3'(-)

+ 59

59

Metoda automată

60

60

20
 25.03.2024

61

61

NGS: Next-Generation Sequencing

62

62

Hibridarea
in situ
• Pregătirea
preparatelor de
cromozomi

• Denaturarea ADN

• Hibridarea cu sonda
marcată

• Vizualizarea la
microscopul optic

63

63

21
 25.03.2024

Hibridarea in situ pentru

depistarea secvenţelor ADN

Hibridarea in situ cu Hibridarea in situ cu

utilizarea preparatelor utilizarea preparatelor
de cromozomi metafazici cu nuclei interfazici

64

64

Hibridarea in situ
pentru depistarea
secvenţelor ARN

Hibridarea in situ cu Analiza

utilizarea probei sens (stânga) histochimică –
şi antisens (dreapta) identificarea
proteinelor în ţesut

65

65

66

66

22
 25.03.2024

67

67

Tehnica.................... Tehnica.................... Tehnica....................

Rezultatul: Rezultatul: Rezultatul:
+5...

68

Tehnici de analiză a genelor

PCR Secvenţiere Southern-blot

Gena PAH 1. 1. 1.
2. 2. 2.
3.

Gena FBN1 1. 1. 1.
2. 2. 2.
3.

Gena CFTR 1. 1. 1.
2. 2. 2.
3.

+Taq-polimerază; +ADN-polimeraza; +EF

+dNTP; +dNTP +Filtru nailon;
+soluţie bufer +ddNTP; +Peliculă
+Termociclor +soluţie bufer radiosensibilă
+colorant+EF +EF
+Transiluminator +Peliculă
radiosensibilă

69

23
 25.03.2024

Testarea genetică
Testarea (screening-ul) nou-născuților -
• P/u identificarea afecțiunilor congenitale corijabile
• Ex: fenilcetonuria, hipotiroidizmul,...
Teste de diagnostic
• p/u confirmarea unui diagnostic stabilit prin metode clinice şi paraclinice (semne şi simptoame)
• Prenatal sau postnatal
Testarea purtătorilor
• p/u identificarea heterozigoţilor Na, purtători de gene recesive patologice
• În familiile cu risc, în cuplurile consanguine
Testarea prenatală
• p/u depistarea modificărilor genetice în familiile cu risc

Testarea preimplantativă (PGD)

• p/u prevenirea unor modificări genetice ce pot apărea în timpul asistenței tehnice a fertilizării

Teste predictive şi presimptomatice în patologia adultului

• p/u identificarea genelor de risc la rudele sănătoase a unor eventuali bolnavi
• p/u inițierea unor măsuri de prevenire a manifestării bolii
Forensic test
• Secvențierea ADN pentru depistarea polimorfismelor individuale în situații legale
• Criminalistică
• Catastrofe
• Paternitate

70

Rolul practic al tehnicilor de analiză a acizilor nucleici:

Cercetare – secvenţierea ADN, formarea bibliotecilor de gene, studiul

expresiei genice, studiul mecanismelor de reglare, studiul consecinţelor
mutaţiilor.

Depistarea persoanelor purtătoare de mutaţii patologice - prenatal sau

postnatal, cu scop de prevenire a naşterii copiilor cu anomalii genetice
sau manifestării unor patologii severe.

Terapie genică (alegerea genei ţintă, construirea vectorilor de gene etc.).

Depistarea ADN străin (viral sau bacterian) în diagnosticul bolilor

infecţioase.

Identificarea polimorfismelor individuale în analiza filiaţiei, în

criminalistică.
71

71

24