Biotehnologii

–
Markerii genetici
H. sapiens M. musculus

afectat/ne-

marker productiv/ne-
genetic rezistent/ne-
proveniență
grad de diversitate
înrudire
Caracterele
caracter
–
proprietate/insuşire/trăsătură/calitate
observabilă dobandită sau moştenită

ca răspuns la determinată
acţiunea genetic
mediului
înconjurător
 Caracterele
Clasic vs. modern
Genetica modernă/moleculară
Genetica clasică
(biologia moleculară)

proprietăți observabile proprietăți observabile

Fenotip

proprietăți biocimice

secvențe de ADN localizate

deducție pe cromozomi
Genotip
‘factorii genetici’
 Caracterele
Clasic vs. modern
Genetica modernă/moleculară
Genetica clasică
(biologia moleculară)

proprietăți observabile

!!!Atenție
Fenotip

în contextul biochimiei
ambele sunt molecule,
secvențe de ADN localizate
dar în contextul geneticii
deducție pe cromozomi
moleculare sunt tratate diferit
Genotip
‘factorii genetici’
Caracterele

polimorfic/polimorfism – mai multe forme

Caracterele

polimorfic/polimorfism – mai multe forme

Caracterele

polimorfic/polimorfism – mai multe forme

Caracterele

polimorfic/polimorfism – mai multe forme

Caracterele și markerii
caracter
–
proprietate/insuşire/trăsătură/calitate
observabilă dobandită sau moştenită

ca răspuns la determinată
acţiunea genetic
mediului
înconjurător

polimorfic/polimorfism – mai multe forme

marker genetic
–
fenotipic (morfologic)
biochimic (genotipic)
molecular (genotipic)
 Markerii genetici
Tipuri

fenotipici

biochimici hormoni, enzime (izoenzime/aloenzime), anticorpi

moleculari
Markerii moleculari
Definiţie
Markerii moleculari pot fi definiţi în mai multe feluri:
(a) a chromosomal landmark or allele that allows for the tracing of a
specific region of DNA;

(b) a specific piece of DNA with a known position on the genome;

(c) a fragment of DNA that is associated with a certain location within

the genome; molecular markers are used in molecular biology and
biotechnology to identify a particular sequence of DNA in a pool of
unknown DNA;

(d) a gene whose phenotypic expression is usually easily discerned,

used to identify an individual, species or a cell that carries it, or as a
probe to mark a nucleus, chromosomes, or locus;

(e) a short DNA sequence, such as a sequence surrounding a single

base-pair change (single nucleotide polymorphism, SNP), or a long
one, like minisatellites;

(f) are regions in the genome that are heritable as simple Mendelian
traits, are easy to document and can be used to quickly detect genetic
variation.
Markerii moleculari
Definiţie
Markerul molecular este un fragment specific
de ADN care poate fi identificat în cadrul
genomului şi care este utilizat pentru a marca
poziţia unei gene sau transmiterea unui caracter.
–
Markerul molecular este reprezentat de un
fragment (regiune) din molecula de ADN care
permite deosebirea/identificarea unui
(1) individ (separarea de alţi indivizi sau
apartenenţa la un anumit grup sau
categorie)
(2) caracter fenotipic (anatomic, morfologic)
(3) caracter biochimic
(4) caracter molecular (alt fragment/regiune de
ADN).
Markerii moleculari
Definiţie
Practic, se poate afirma că markerul molecular este
asociat individului/caracterului.
–
Fragmentul de ADN poate avea
mărime (număr de nucleotide)
structură (secvenţă nucleotidică)
rol genetic (codificator sau ne-)
localizare la nivelul genomului (poziţie/locus)
foarte variabile.
–
Poziţia (exactă) markerului la nivelul genomului
poate sau nu să fie cunoscută.
–
Metodele de studiu/analiză sunt de asemenea
foarte variate.
Markerii (genetici) moleculari
Aplicații
Analiza diversităţii genetice şi înrudirii între
sau în cadrul populaţiilor, speciilor sau
indivizilor

analize/studii/discipline comparative
anatomie, morfologie, embriologie,
psiohologie
+
molecular

polimorfismul ADN-ului şi proteinelor

aplicaţii în filogenie, taxonomie, ecologie,
genetică, ameliorare, medicină
Markerii (genetici) moleculari
Caracteristici
• polimorfism – moderat, înalt

• transmitere – codominantă
• posibilitatea de discriminare precisă a alelelor

• stabilitate
• repetabilitate şi reproductibilitate
• transferabilitate
• detectare/observare – uşoară, ieftină, automatizare
• creare/dezvoltare – uşoară, ieftină

• identificarea
• deosebirea
• discriminarea
• separarea
Markerii (genetici) moleculari
!

Locus

Genă

Alele (variante)

Genotip (combinaţia de alele)

Fenotip (caracter, combinaţia de...)

Markerii (genetici) moleculari
Transmitere

Makerilor biochimici şi moleculari le sunt

caracteristice două modele de transmitere:
(1) dominantă/recesivă
(2) codominantă.

În cazul în care structura genetică homozigotă

poate fi deosebită de cea heterozigotă, markerul
este codominant, iar acest tip este cel mai
informativ.

!!!!!!!!
interacţiunea dintre gene şi mecanismele de
formare a caracterlor
Markerii biochimici

alozime – enzime produse de alele (forme)

diferite ale aceleiaşi gene

izoenzime – enzime produse de gene diferite dar

care catalizează aceeaşi reacţie
Markerii biochimici
Caracteristici
În trecut, au reprezentat cea mai utilizată clasă de markeri
(cost redus, simplitate şi expeditivitate dpdv. tehnic, uşor
de dezvoltat), dar au fost surclasaţi de markerii
moleculari, care sunt mai informativi (pot evidenţia un
grad mai ridicat de polimorfism şi la nivelul mult mai
multor loci) şi mai stabili (nu sunt influenţaţi de vârstă
sau anatomie).
–
Metodele analitice au la bază mobilitatea electroforetică
diferită determinată de mici diferenţe în secvenţa de
aminoacizi.
–
Variabilitatea/diversitatea evidenţiată astfel este cea
de la nivelul funcţional al genelor.
–
Caracteristici: transmitere simplă, exprimare
codominantă, penetranţă completă, lipsa
interacţiunilor epistatice şi pleiotropice.
Markerii biochimici
Electroforeza
Markerii biochimici
Elecroforeza
Markerii moleculari

Markerii moleculari au revoluţionat domeniul

analizelor moleculare genetice, depăşind
limitările markerilor biochimici.
–
În prezent, există un mare număr de astfel de
sisteme ce permit evaluarea directă a
informaţiei genetice şi la nivelul întregului
genom.
–
Influenţa factorilor de mediu şi stadiului
ontogenetic este neglijabilă.
Markerii moleculari

Există trei mari grupuri de markeri moleculari:

(1) bazaţi pe hibridarea moleculară (ADN-
ADN) (ex. RFLP)
(2) bazaţi pe reacţia PCR – amplificarea
fragmentelor de ADN (ex. RAPD, ISSR,
SSR, SCAR, AFLP, SNP, CAPS)
(3) bazați pe secvenţiere.
–
Fiecare tip de markeri (moleculari şi genetici)
prezintă avantaje şi dezavantaje, de aceea,
utilitatea şi aplicabilitatea unui sistem de
markeri nu au caracter universal.
–
Alegerea markerilor depinde, în principal, de
sopul urmărit.
Secvențierea
Markerii moleculari

.....alegerea markerilor
De ex.:
(1) sistemul RFLP este destul de mult utilizat,
dar necesită ADN de foarte bună calitate şi
caracterizare moleculară prealabilă
(2) markerii AFLP au un grad mare de
reproductibilitate, dar prezintă dezavantaje
tehnico-materiale
(3) sistemele RAPD şi ISSR sunt preferabile în
cazul lipsei caracterizării moleculare şi a
resurselor materiale
(4) markerii SCAR necesită o foarte bună
caracterizare moleculară (i.e. secvenţiere)
(5) CAPS, SSR, SNP etc.
Markerii moleculari

Amprentare genetică/moleculară
Profil genetic
Genotip(iz)are
Testare genetică

DNA profiling
DNA fingerprinting
DNA (geno)typing
Genetic testing
Tipuri de markeri moleculari
Exemple – #1
Tipuri de markeri moleculari
Exemple – #2
Tipuri de markeri moleculari
Exemple – #3
Tipuri de markeri moleculari
Exemple – #4
Tipuri de markeri moleculari
Exemple – #4
Tipuri de markeri markeri
moleculari
Tipuri de markeri moleculari
Exemple – #4
Markerii genetici
Aplicații
Variabilitatea (diversitatea) genetică
–
genetica populațiilor (+ gen. evoluţiei +
filogenia moleculară, ecologia moleculară etc.)
–
studiul frecvenţei genelor/alelelor şi a
interacţiunilor dintre acestea sub influenţa
principalelor procese evolutive: selecţia
naturală, driftul genetic, mutaţia, fluxul genelor

Selecţia și ameliorarea asistată de markeri

–
selecţia indirectă a formelor ce prezintă o
caracteristică genetică dorită (şi implicit un
fenotip dorit)
 Variabilitatea genetică şi
modelele de diversitate
genetică intra- şi interspecifică şi
intra- şi interpopulaţională
Variabilitatea genetică

Studiul variabilităţii genetice şi modelelor de

diversitate genetică intra- şi interspecifică şi intra-
şi inter populaţională ajută la dezvoltarea
metodologiilor de
(1) ameliorare (selecţie)
(2) domesticire
(3) conservare
–
Pentru atingerea acestor obiective este necesară
selectarea (şi utilizarea) unor
markeri genetici (moleculari) corespunzători.

în funcţie de:
numărul locilor studiaţi
gradul de polimorfism detectabil
costuri (resurse)
Variabilitatea genetică

Variabilitatea genetică evaluabilă cu ajutorul

markerilor este reprezentată de diferenţele de la
nivelul moleculei de ADN, determinate, în
principal, de mutaţii–inserţii, deleţii, duplicări,
inversii.
–
Mutaţiile pot determina modificări de natură
funcţională, ce determină, la rândul lor, schimbări
metabolice sau fenotipice, sau pot fi neutre.
–
Variantele mutante pot:
(1) avea eficienţă metabolică sporită sau redusă
(2) avea diferite niveluri sau tipare de expresie
genică în diferite stadii fizologice sau de
dezvoltare
(3) să îşi piardă complet funcţionalitatea
(4) să capete funcţii noi.
Variabilitatea genetică

Provocarea constă în alegerea celor

mai potriviţi markeri moleculari,
pentru identificarea/evidenţierea
variaţiei din cadrul populaţiilor.
Variabilitatea genetică
Variabilitatea genetică
Variabilitatea genetică
Variabilitatea genetică
Variabilitatea genetică
Variabilitatea genetică
Variabilitatea genetică
Selecţia asistată de markeri
Selecţia asistată de markeri
Clasificare
Aplicaţii potenţiale ale markerilor moleculari:
–
selecţia asistată de markeri – selecţia indivizilor ce prezintă
caracteristici dorite, pe baza analizei genotipice
moleculare; se poate utiliza singură sau în combinaţie cu
metode de selecţie clasice
–
ameliorarea asistată de markeri – orice aplicaţie a
markerilor moleculari în cadrul programelor de ameliorare,
în vederea eficientizării acestora

Selecţia asistată de markeri poate fi:

–
selecţia directă bazată pe genele codificatoare a
caracterelor de interes
–
selecţia indirectă bazată pe markeri QTL
Selecţia asistată de markeri
Selecţia directă...
...bazată pe genele codificatoare
–
Această formă de selecţie asitată de markeri presupune
selecţia directă a alelelor individuale specifice unuia sau
mai multor loci ce influenţează caracterul poligenic.
Pentru aceasta, este necesară cunoaşterea, la nivel
molecular, a uneia sau mai multor gene implicate în
controlul caracterului de interes. Practic, markerii sunt
reprezentaţi de polimorfisme (variante) ale genelor ce
controlează direct caracterul poligenic.
–
Pentru a fi eficientă, selecţia moleculară directă
trebuie aplicată mai multor (tuturor) loci ce
controlează caracterul poligenic de interes.
–
Toate formele de selecţie asistată de markeri pot fi
utilizate separat sau împreună cu metodele de selecţie
clasică.
Selecţia asistată de markeri
Selecţia directă...
Selecţia asistată de markeri
Selecţia directă...
Selecţia asistată de markeri
Selecţia indirecta bazată pe
markeri QTL

QTL
–
quantitative trait locus – locus asociat unui
caracter cantitaitv (!poligenic)
–
reprezintă o regiune cromozomală în cadrul căreia
este situată o genă
sunt situate mai multe gene
ce influenţează semnificativ (controlează) un
caracter cantitativ; de obicei, regiunile QTL
identificate includ mai multe gene asociate unui
caracter cantitaiv, dar nu pe toate
Selecţia asistată de markeri
Selecţia indirecta bazată pe
markeri QTL

Toate formele de selecţie indirectă presupun

selecţia unui caracter molecular (i.e. markerul
de selecție) corelat cu o variantă superioară a
altui caracter (caracterul ţintă sau de interes).
–
De obicei, markerii QTL se pot utiliza cu
succes doar în cadrul familiilor în care au fost
identificaţi; în cadrul altor familii, s-ar putea
ca înlănţuirea iniţială (între alele) să nu existe.
Selecţia asistată de markeri
Selecţia indirecta bazată pe
markeri QTL
Principiu:
–
populaţii corespunzătoare (i.e. segregante) sunt utilizate pentru
identificarea asocierilor (înlănţuirea/linkage) dintre markeri
moleculari (de obicei necunoscuţi) şi QTL-uri;
–
asocierea înseamnă că anumite alele ale locusului ce reprezintă
markerul corespund unei frecvenţe ridicate a alelelor QTL
favorabile;
–
practic, corelaţia (asocierea) markerului şi caracterului de
interes este determinată de linkarea markerului cu o regiune
cromozomală pe care
este prezentă şi o genă ce influenţează semnificativ
caracterul ţintă (i.e. QTL)
sunt prezente mai multe gene care influenţează
caracterul ţintă (i.e. QTL).
Selecţia asistată de markeri
Selecţia indirecta bazată pe
markeri QTL
Se încrucişează doi indivizi cu forme extreme ale
fenotipului de interes. Aceştia sunt caracterizaţi dpdv.
genetic (i.e. structura genetică pentru cei trei markeri este
cunoscută).

Din generaţia F1, se încrucişează două forme cu fenoptip

intermediar şi structură genetică heterozigotă.

În generaţia F2 are loc segregarea, atât

fenotipică, cât şi genotipică.

Fiecare descendent este genotipat pentru cei

trei markeri. Markerul B-b este codominant.

Cu ajotorul testelor statistice se identifică o

asociere între clasele genotipice (markerul B-
b) şi formele fenotipului de de interes:
genotipul BB este asociat dimensiunii mari
genotipul Bb este asociat dimensiunii
intermediare
genotipul bb este asociat dimensiunii reduse.
 Selecţia asistată de markeri
Avantaje și dezavantaje
Selecţia asistată de markei prezintă numeroase beneficii, fie utilizată împreună cu
metodele clasice, fie singură:
(1) posibilitatea reducerii duratei ciclui de ameliorare;
(2) reducerea costurilor legate de testarea populaţiilor de descendenţi;
(3) creşterea intensităţii selecţiei;
(4) creşterea eficienţei de selecţie a caracterelor cu heritabilitate redusă.
–
Există şi câteva dificultăţi semnificative în utilizarea eficientă a selecţiei asistate de
markeri, care se întâlnesc la orice tip de organisme (i.e. plante agricole şi horticole,
animale, specii forestiere).
Cel mai important aspect se referă la structura genetică a caracterului de interes.
Dacă acesta se află într-adevar sub controlul a zeci/sute/mii de loci, fiecare cu
având un mic efect fenotipic, atunci este imposibilă detecţia tuturor locilor, iar
identificarea unor markeri asociaţi poate fi de asemenea imposibilă, sau foarte
dificilă.
Un alt factor, ce limitează eficienţa selecţei bazate pe markeri QTL, este
posibilitatea variabilităţii caracterului de interes în funcţie de factorii de mediu
sau de genomul analizat.
Ameliorarea asistată de markeri

Deşi au fost obţinute realizări importante cu ajutorul

metodelor clasice de ameliorare, selecţia asistată de
markeri oferă potenţialul de sporire a eficienţei acestora.
Ameliorarea asistată de markeri se referă deci la diferite
aplicaţii ale markerilor moleculari în cadrul programelor
de ameliorare.
–
Astfel, pe lângă procesul de selecţie, markerii moleculari
pot fi utilizaţi şi în alte etape/faze ale acestor programe:
alegerea schemelor de hibridare
testarea (genetică a) descendenţei (genotipare)
management şi controlul calităţii
etc.
–
Se doreşte:
sporirea valorii genetice
reducerea costurilor
scurtarea intervalul dintre generaţii şi
eficientizarea controlului calităţii.
Selecţia asistată de markeri
Eucalyptus grandis

Eucalyptus urophylla

♀ E. grandis x E. urophylla ♂

F1 E. urograndis

distanţă de izolare
Selecţia asistată de markeri
E. urograndis

vârstă 6 ani
A – circumferinţa trunchiului

n1 – îndeplinesc criteriul A
n2 – aleşi la întâmplare
n3 – nu îndeplinesc criteriul A

Markeri moleculari microsateliţi

distanţă de izolare
Selecţia asistată de markeri
Analiza ♀ E. grandis
nu toţi descendenţi provin din clona utilizată în
plantaţie

Analiza ♂ E. urophylla
două dintre clonele utilizate ca polenizatori sunt
identice
–
nu toţi descendenţi provin din clonele utilizate în
plantaţie
–
n1 – cea mai mare parte dintre descendenţi
provin doar din trei clone
–
autopolenizare – lipseşte în n1; proporţie mică în
n2; proporţie mare în n3

validarea sistemului
îmbunătăţirea managementului
distanţă de izolare