CURS 13, 14

APLICAȚII ALE METODELOR

MODERNE UTILIZATE ÎN
AMELIORAREA PLANTELOR

Transferul de gene
Tehnologia ADN recombinant ocupă o poziţie centrală în cadrul metodologiilor de
inginerie genetică prin faptul că a inaugurat era intervenţiilor umane asupra patrimoniului
ereditar al organismelor, dând posibilitatea transferării într-un mod relativ simplu a
informaţiei genetice de la o specie la alta.
Cunoştinţele acumulate în domeniul geneticii moleculare au oferit în anii ’70
informaţii privind structura secvenţei moleculare a ADN. Enzimologia replicării de ADN a
permis descoperirea enzimelor de restricţie, capabile să secţioneze în anumite puncte
molecula de ADN. Din acest moment şi până la izolarea genelor individuale şi clonarea lor,
pentru a obţine aşa numita moleculă de ADN recombinant, nu a fost decât un pas.
Transgeneza (transferul de gene) presupune trei etape:
• identificarea, izolarea si clonarea “genelor de interes”;
• transferul genelor de interes la plantele de cultură (Agrobacterium sau metoda
biolistică);
• selectia plantelor care exprima la un nivel optim si testarea acestora pentru evaluarea
stabilitătii expresiei transgenei în descendentă.
Aplicații: Soia Roundup Ready - Metoda biolistică - bombardarea embrionilor imaturi cu
particule de Au invelite în gena ce produce o enzimă insensibilă la erbicid.
Istoric:
▪ În 1986 – primele teste cu plante transgenice (conditii de perfectă izolare);
▪ În 1992 – prima cultură comercială cu o plantă transgenică.
Prima generație de plante transgenice:
• rezistență la insecte și boli, toleranță la erbicide (“caractere imput”);
• soia, porumb, bumbac, rapiță, cartof, dovleac;
• unu sau cel mult două caractere noi;
• Soia Roundup Ready (o genă de la Agrobacterium) – toleranță la erbicidul glifosat;
• Porumbul Bt (o genă de la Bacillus thuringiensis) – rezistent la sfredelitorul
porumbului (Ostrinia nubilalis).
A doua generatie de plante transgenice:
• produse vegetale cu însușiri vegetale ameliorate (“caractere output”);

1
 • modificări ale conținutului de amidon, proteine, uleiuri și zaharuri, modificarea
însușirilor de panificație, creșterea duratei de păstrare a fructelor, sporirea conținutului
de ß – caroten (corectarea deficitului de vitamina A), ameliorarea digestibilității
furajelor.
Rezultate obținute:
1. Tomate - modificarea procesului de coacere:
▪ prin folosire de gene antisens – blocarea sintezei unei gene care produce o enzimă
(poligalacturonaza) ce distruge pereții celulari;
▪ suprimarea sintezei etilenei (2 enzime implicate);
▪ sporirea conținutului de substanță uscată (reducerea conținutului de apă 95%).
2. Cartof:
▪ sporirea conținutului de amidon de la 21 la 25 %;
▪ sinteza de noi glucide “ciclodextrinele” – capacități de absorbție utilizate în
farmacie, industria alimentară și agrochimie (stabilizarea parfumurilor și aromelor,
extragerea de substanțe din amestecuri etc.)
3. Orez:
▪ soi cu bobul galben, bogat în Fe (gena de la soia) și ß – caroten (3 gene ce
sintetizează enzimele acestui pigment).
4. Sfecla de zahăr:
▪ bogată în fructan (îndulcitor necaloric).
5. Fructe și legume:
▪ bogate în proteine dulci – monelina, mabilina și taumatina (palatabilitate ridicată).
6. Bumbac:
▪ ce sintetizează melanina pentru culoarea neagră sau ce sintetizează în lumenul
fibrei un miez de material plastic.
A treia generație de plante transgenice:
Plantele transgenice producătoare de molecule terapeutice sau vaccinuri:
• producția de materie vegetală este usoară și ieftină;
• vaccinurile obținute pot să fie păstrate la temperatura mediului ambiant (fructe,
rizomi, tuberculi etc.);
• riscurile contaminării virale sau bacteriene sunt excluse.
Aceste vaccinuri au fost aplicate la animale: pentru parvovirus la nurci (soia transgenica),
pentru gastroenterita la porcine (porumb transgenic) etc.
Primul vaccin pentru om (1995): cartoful și salata care “vaccinează” contra hepatitei B.
Din cele menţionate reiese că tehnica ADN-ului recombinant permite amelioratorului
să inducă schimbări dorite într-un organism. Hibridarea nu poate oferi această alternativă
deoarece genele dorite iau parte la recombinări, împreună cu cele nedorite. Mutaţiile induse
par şi mai puţin satisfăcătoare datorită apariţiei lor întâmplătoare şi a spectrului lor
imprevizibil.

Variabilitatea somaclonală

În principiu, se consideră că plantele provenite din cultura in vitro dau descendenţi

identici din punct de vedere fenotipic, cu biotipul din a cărei celule sau ţesuturi provine.
S-a constatat că în funcţie de mediul de cultură, vârsta celulelor sau a ţesuturilor în
cultură, genotipul, efectele temperaturii, a luminii ş.a. pot să producă o accentuată variabilitate
la unele caractere condiţionate monogenic (culoare, formă etc.), ca şi caracterele determinate
poligenic (talia, ramificarea ş.a.). Acest tip de variabilitate a fost denumită de LARKIN şi

2
SCOWCROFT, variaţie somaclonală, considerând-o utilizabilă în procesul de ameliorare a
plantelor, ca o sursă de variabilitate genetică.
Trecându-se în revistă cunoştinţele acumulate în acest domeniu s-a ajuns la concluzia
că variabilitatea somaclonală este condiţionată de următoarele cauze majore:
- schimbări evidente la nivelul cariotipului;
- rearanjări cromozomale;
- crossing-over somatic şi schimbări între cromatidele surori;
- existenţa elementelor transpozabile;
- amplificarea şi diminuarea efectelor genelor.
Au fost emise opinii ce consideră că multe din variaţiile somaclonale ar putea fi
mutaţii preexistente ce se manifestă în culturile in vitro (BARBIER şi DULIEU).
LÖRZ si BROWN consideră culturile de celule ca un “tratament mutagen”. S-a
constatat că dacă ciclul de cultură a ţesuturilor se prelungeşte, cu atât incidenţa variabilităţii
este mai evidentă, mai ales în cazul calusului nediferenţiat, suspensiilor de celule sau
protoplaşti şi mai puţin în cazul culturilor de meristeme. Aceiaşi autori consideră că marile
schimbări cariologice ce pot să apară la nivelul descendenţei somaclonale, sunt o consecinţă
cumulată a stresurilor suferite din timpul pasărilor succesive de pe un mediu de cultură pe
altul.
În funcţie de natura schimbărilor menţionate, somaclonele sunt mai mult sau mai puţin
stabile sau fertile. Deşi originea majorităţii variaţiilor somaclonale nu sunt pe deplin
cunoscute existenţa lor ne face să considerăm că ele constituie o sursă nouă de variabilitate
genetică, compatibilă cu lucrările de ameliorare a plantelor.

Recombinarea genetică și aplicațiile ei în

ameliorare
În comparaţie cu mutaţiile care sunt asociate de obicei cu schimbări genice,
recombinarea genelor nu implică schimbări de acest tip, ci doar în combinaţia genelor ce
provin de la genitori diferiţi. Şi în acest caz rezultă o nouă variabilitate genetică.

P1 AAbb X aaBB P2

F1 AaBb

F2 AABB - genotip nou

A A bb - genotip parental
aaBB - genotip parental
aabb - genotip nou

3
 Dacă formele parentale diferă prin mai multe caractere (n - perechi de gene alele)
apare un număr mare de gameţi diferiţi (2n) datorită heterozigoţiei în F1 care, în condiţiile
împerecherii randomizate, pot da un număr mare (3n) de genotipuri şi (2n) de fenotipuri
diferite în generaţia F2.
Dacă o genă posedă mai mult de două alele, cum ar fi cazul formelor poliploide,
numărul recombinărilor genetice şi a noilor genotipuri creşte considerabil, necesitând un
număr mai mare de plante în generaţia F2.
În recombinarea genelor, rezultată ca urmare a încrucişării a doi sau mai mulţi
genitori, toate combinaţiile vor include numai acele gene alele care sunt prezente la părinţi.
În cazul genelor nelinkate, noile recombinări genetice sunt previzibile ca frecvenţă în
timp și generaţie.
În cazul genelor linkate, recombinările genetice sunt previzibile doar ca rezultat al
crossing-overului, dar frecvenţa lor poate fi estimată numai dacă distanţele dintre gene pe
cromozomi au fost stabilite anterior prin intermediul hărţilor cromozomale.
Transgresiunea genetică - segregarea caracterelor populatiei F2 în una sau ambele
direcţii, în funcţie de trăsăturile formelor parentale (o precocitate mai pronunţată decât cel mai
precoce părinte, o talie mai redusă decât părintele cel mai scund ş.a.).

P1 aaBBccddee X AAbbCCDDee P2
60 cm 80 cm

F1 AaBbCcDdee

F2 aabbccddee AABBCCDDee
50 cm 90 cm

Pe lângă variabilitatea întâlnită în populaţiile naturale de plante, reiese că hibridarea

dirijată a indivizilor genetic diferiţi, constituie cea mai sigură sursă de variabilitate genetică,
utilizabilă în ameliorarea plantelor.

Bazele genetice ale ameliorării plantelor cu

reproducere asexuată
Înmulţirea asexuată (apomictică) se caracterizează prin lipsa fecundării, cu toate că se
întâlneşte la organisme cu diferenţieri sexuale. În acest cadru larg, se întâlnesc mai multe
sisteme, în funcţie de organul sau mecanismul prin care se formează noi indivizi.
Caracteristica esenţială a înmulţirii apomictice, rămâne lipsa sexualităţii. Din această cauză, în
lipsa fecundării nu mai are loc diviziunea reducţională, iar datorită acestui fapt urmaşii vor
avea în mod nemijlocit aceeaşi masă ereditară ca şi individul din care provine.

4
 Înmulţirea apomictică

înmulţirea se face prin seminţe, deşi nu are

agamospermia
loc fecundarea.
înmulţirea se produce prin intermediul unor organe
înmulţirea vegetative sau porţiuni din ele (tuberculii, bulbii,
vegetativă bulbilii, drajonii, lăstarii, butaşii etc.).

concreşterea de organe sau ţesuturi ale unei

transplantarea plante, pe o altă plantă (proces artificial creat
(altoirea) de către om).

detaşarea unor ţesuturi sau celule

înmulţirea meristematice, aflate în plină diviziune mitotică
meristematică şi creşterea acestora pe un mediu nutritiv
adecvat (înmulţire apomictică artificială,in vitro ).

În unele cazuri, este greu de stabilit cărui sistem de înmulţire aparţine o anumită specie
de plantă, deoarece natura care evită în genere deosebirile tranşante – a creat specii care
utilizează două sau chiar mai multe tipuri de înmulţire:
▪ înmulţirea generativă (seminţe rezultate pe cale sexuată);
▪ agamospermia (seminţe obţinute fără fecundare);
▪ înmulţire vegetativă (bulbili – formaţi în inflorescenţă şi lăstari).

Modalităţi de reproducere apomictică

Agamospermia
Partenogeneza

natura celulelor din care s-a Embriogeneza

Agamospermia format embrionul seminţei
adventivă
înmulţirea prin seminţe,
produse fără fecundare,
de indivizi cu diferenţiere
sexuală

Apogameţia

5
 Partenogeneza este multiplicarea agamospermică în care embrionul seminţei ia naştere
din celulele ou ale sacului embrionar. Dacă aceste celule nu au suferit o diviziune
reducţională, indivizii ce vor lua naştere vor fi diploizi, iar dacă au fost reduse meiotic,
indivizii nou formaţi vor fi haploizi.
Plantele partenogenetic haploide, dacă sunt fertile, pot fi încrucişate între ele,
obţinându-se indivizi cu 2n cromozomi, perfect homozigoţi. Acest fapt prezintă importanţă,
când se urmăreşte obţinerea unor linii cu un grad ridicat de homozigoţie, necesar în realizarea
unor hibrizi F1 comerciali.
Apogameţia, este tipul de înmulţire în care embrionul seminţei ia naştere fara
fecundare, din alte celule ale sacului embrionar, de obicei din sinergide şi antipode.
Apogameţia poate fi haploidă, sau diploidă, în funcţie de starea în care se găsesc celulele
respective, în momentul când din ele începe să se dezvolte embrionul seminal.
Embriogeneza adventivă este caracteristică tipului de organism în care embrionii
seminţelor sunt produşi fără fecundare, din anumite celule somatice, situate în afara sacului
embrionar. Acest rol, de cele mai multe ori, este îndeplinit de celulele chalazei sau al nucelei,
care aflându-se în imediata apropiere a sacului embrionar, pătrunde în aceasta, dezvoltându-se
ca embrion. Acest tip de înmulţire se întâlneşte la majoritatea speciilor genului Citrus.

Înmulţirea vegetativă

Înmulţirea vegetativă este tot o înmulţire apomictică, frecvent întâlnită la numeroase

specii agricole şi horticole. Organele, sau părţile de organe, pe care plantele le utilizează
pentru înmulţirea vegetativă naturală, sunt mai mult sau mai puţin specializate pentru această
destinaţie. Natura a creat o variatate extrem de mare, de posibilităţi pentru realizarera
înmulţirii vegetative.

Înmulţirea vegetativă
Cele mai frecvent utilizate organe pentru înmulţirea vegetativă sunt:

butasi muguri
(vita de vie, (flori)
specii
floricole)

lăstari
drajoni
(lăcrămioare)
(visin, arbusti)
stolonii
(căpşun)

tuberculii
(cartof)
rizomii
(coacăz, zmeur, bulbii şi bulbilii
plante ornamentale) (ceapa, usturoi, lalele)

6
 De remarcat, că la plantele agricole şi horticole, înmulţirea vegetativă nu exclude
reproducerea sexuată ci, de cele mai multe ori, în procesul de ameliorare cele două tipuri de
multiplicare sunt utilizate concomitent. Urmaşii obţinuţi, pe cale vegetativă, posedă,
întotdeauna acelaşi patrimoniu ereditar cu a plantei din care a provenit.
Cu ajutorul înmulţirii vegetative se poate multiplica şi menţine neschimbat orice
organism heterozigot, ce se poate multiplica pe această cale. Din aceste motive, înmulţirea
vegetativă găseşte o largă utilizare în ameliorarea unor plante alogame.

Multiplicarea „in vitro”

Înmulţirea „in vitro” poate fi considerată tot o înmulţire apomictică artificială. În

esenţă ea constă în detaşarea unor ţesuturi sau celule meristematice, aflate în plină diviziune
mitotică şi creşterea acestora pe un mediu nutritiv adecvat. Din aceste celule sau ţesuturi vor
lua naştere plantule, care vor fi apoi transferate de pe mediul nutritiv artificial, în seră sau în
câmp.
Culturile de ţesuturi se folosesc exclusiv la cartof şi căpşun pentru propagarea clonală
rapidă a noilor soiuri. S-au obţinut rezultate satisfăcătoare cu ajutorul culturilor de ţesuturi şi
la măr. În cazul plantaţiilor cu densitate mare care trebuiesc înfiinţate pe rădăcini proprii,
pentru accelerarea producţiei, culturile de ţesuturi par a fi profitabile.
Cultura de embrioni se utilizează pentru obţinerea puieţilor, din embrioni incomplet
dezvoltaţi, rezultaţi din hibridările interspecifice. Din cauza viabilităţii scăzute a seminţelor,
cultura de embrioni este aproape singura metodă de obţinere a soiurilor foarte timpurii de
piersic şi nectarine.
Având în vedere dificultăţile legate de lungimea procesului de ameliorare, la speciile
lemnoase, metodele de multiplicare „in vitro” pot să ajute accelerarea acestui proces, în
special prin propagare clonală rapidă şi obţinerea de plante libere de viroze.
Consecinţe genetice ale reproducerii apomictice

Pentru ameliorarea plantelor înmulţirea apomictică şi, în special cea vegetativă,

prezintă avantaje deosebite. Prin înmulţirea vegetativă, o plantă valoroasă poate fi perpetuată
şi înmulţită foarte mult timp, indiferent de gradul de heterozigoţie. Toţi urmaşii vegetativi ai
unor astfel de plante vor avea o bază genetică identică cu a plantei mamă, reproducând fidel
caracterele acesteia.
Totalitatea descendenţilor uniformi genetic, obţinuţi prin multiplicare vegetativă,
dintr-o celulă sau organism, formează o clonă. Datorită acestui fapt, în practica ameliorării
plantelor, pentru a menţine anumite însuşiri şi caractere valoroase, ori de câte ori este posibil,
se utilizează reproducerea vegetativă.
Fenomenul apomixiei, ca de altfel şi amfimixia (înmulţirea sexuată), este controlat
genetic. Rezultă că, mutaţia genelor implicate, poate schimba gradul de manifestare a
reproducerii apomictice, tot aşa cum mutaţia genelor, care determină meioza sau fecundarea,
pot substitui amfixia cu apomixia.
Astfel la Allium carinatum, specie predominant apomictică, substituirea florilor cu
bulbili, se datoreşte mutaţiei unei singure gene.
Conservatorismul ereditar, în cazul reproducerii apomictice şi în special a celei
vegetative, nu este însă absolut, depinzând de conservatorismul ereditar a plantei materne
iniţiale. În cazul transplantării, altoii proveniţi de la puieţi tineri, prezintă o variabilitate mai
mare, decât cei proveniţi de la plantele mature sau de la soiurile mai vechi în cultură.
În cadrul unei clone pot să apară mutaţii somatice naturale, ce crează variaţii mugurale
frecvente la multe plante de cultură şi care, prin reproducere vegetativă pot constitui surse
pentru obţinerea de noi genotipuri.

7
 În cursul numeroaselor diviziuni celulare, acumularea de mutaţii în stadiul heterozigot,
este considerabilă. Se ştie, că atunci când celulele multiplicate în zona apicală se diferenţiază,
se poate constata formarea unor ansamble de celule, dispuse în straturi, de obicei trei, care
constituie epiderma, stratul subepidermal şi derma. În general, mutaţiile somatice nu apar
decât în celulele unui strat. Ele nu se exprimă, numai parţial şi doar în sectorul unde organele
sunt formate, începând de la această stratificare modificată.
Uneori, în cazul transplantului, în interiorul sulului de cicatrizare, cu excepţia
butăşirii şi a grefării, se realizează o redistribuire a ţesuturilor între diferitele substraturi,
ajungându-se ca o mutaţie sau mai multe, situate într-un strat mai profund, subepidermal sau
dermal, să fie transferate în zona epidermică, devenind vizibile. Acest fenomen, are însă o
frecvenţă relativă. Interpretarea eronată a proceselor de acest tip, a stat la baza creării
hibrizilor de grefă. Această mutageneză spontană (somartificial), permite o diversificare şi
deschide potenţialităţi de adaptare la speciile care se reproduc vegetativ.
Studiile privind polimorfismul ramu-rilor, la speciile din genul Phyllantus, au
evidenţiat existenţa unor ramuri verticale, denu-mite ortotrope şi a altora cu o creştere
orizontală, plagiotrope.
S-a evidenţiat faptul că “memoria” ortotropiei sau a plagiotropiei se transmite de-a
lungul multiplicărilor vegetative, caracteristicile ramurii de origine rămânând impregnate la
individul regenerat, la fel ca şi precocitatea de înflorire, vigoarea, portul etc.
Multiplicările vegetative antrenează, de multe ori, acumularea accidentelor cito-
plasmatice. S-a dovedit că variaţiile apărute sunt datorate prezenţei în celule a unor viruşi
latenţi, sau micoplasme. În aceste cazuri, fenomenul se pune pe seama degenerescenţei,
legate de multiplicarea vegetativă (la cartof, viţa de vie, căpşun ş.a.).
Pentru a se contracara fenomenul, producerea de plante în cultura „in vitro” din
meristeme sau embrioni, poate duce la realizarea unor indivizi cu o stare fitosanitară foarte
bună. În acest fel, virozele care afectau în mod sistematic numeroase varietăţi au fost
combătute cu succes.