Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
unitilor
lor
ale rezistenei la stresul abiotic, inclusiv la secet i la salinitatea solurilor, care astzi
cauzeaz pn la 50% din pierderile de producie agricol mondial. Biofortificarea
plantelor de cultur prin introducerea genelor implicate n mbuntirea calitilor nutritive
ale produselor alimentare, precum coninutul de proteine, vitamine i minerale este o direcie
relativ nou, n continu dezvoltare.
Produsele alimentare derivate din PMG sunt prezente n magazinele i marketurile
Uniunii Europene (UE) din anul 1996. Acest fapt a condiionat apariia unei serii de directive
i legi emise de Comunitatea European, menite s supun unui control strict comercializarea
i cultivarea organismelor modificate genetic (OMG). Conform cerinelor, produsele
alimentare care conin cel puin 0,9 - 1% OMG trebuie supuse analizelor i etichetrii.
Necesitatea monitorizrii prezenei PMG i cantitii acestora n culturile agricole i
n produsele alimentare derivate din acestea a impus cutarea metodelor analitice eficiente n
detectarea, identificarea i cuantificarea alogenelor i a produselor de expresie, care reprezint
constituenii genetici de baz. Laboratoarele UE au elaborat i dezvoltat metode de testare a
PMG la nivel de ADN prin metoda PCR i/sau proteine, prin analize imunoenzimatice.
etc.
Obinerea
autorizrii
biscuii aperitiv;
-
griul de porumb n : biscuii aperitiv, pesmet, bere, cereale pentru micul dejun;
- amidonul de porumb: n sosuri, mezeluri, creme pentru deserturi, preparate pentru
Procesul de transfer are loc doar la nivelul materialului genetic al celulelor infectate
din cadrul organismelor gazd i a constituit punctul de plecare pentru crearea unui protocol
de transformare la plante (Zafar et al., 2004). Ulterior, procedeul de transformare a fost
optimizat, realizndu-se progrese considerabile n obinerea OMGurilor, iar transformarea
mediat de bacteriile din specia A. tumefaciens a devenit, probabil, cea mai eficient metod
de tranformare.
Strategia transformrii mediate de A. tumefaciens presupune eliminarea genelor
bacteriene care produc tumora, n locul lor fiind plasat insertul ce trebuie transferat.
Aceasta are deci la baz proprietatea conform creia orice fragment strin de ADN
plasat ntre secvenele ce mrginesc iniial T-ADN-ul, poate fi transferat n celulele plantelor
prin infecie. Este astfel posibil introducerea genei de interes n celulele plantei fr a cauza
tumora (Querci et al., 2004a). Secvenele ce mrginesc T-ADN-ul sunt denumite TR (TADN right) i TL (T-ADN left), doar prima fiind considerat indispensabil procesului de
transfer.
Dezavantajul major al acestui eficient sistem de transformare rezid n capacitatea
natural a bacteriilor A. tumefaciens de a infecta doar anumite specii de plante (Bruderer
i Leitner, 2003). Din aceast cauz se ntmpin dificulti n generalizarea metodei de
transformare la toate plante de cultur, cea mai important excepie fiind grupa cerealelor.
1.3 Transferul direct de ADN
Transferul direct de ADN n celulele plantelor se poate realiza utiliznd ageni fizici
sau chimici, care au rolul de a media ptrunderea i integrarea informaiei genetice. Pe aceste
ci (n special prin electroporare), au fost obinute o serie de varieti transgenice de porumb
i orez (ex. Bt11, MS3, MS6, T14 sau T25, respectiv LLRICE05 sau LLRICE62). Pentru ca
transferul s aib loc, pereii protectori ai celulelor receptoare trebuie ndeprtai, rezultnd
astfel protoplatii. Acest tip de celul reprezint stuctura ideal pentru introducerea ADN-ului
i selecia evenimentelor transgenice deoarece pereii celulari constituie un impediment major
n calea integrrii informaiei genetice strine n celul (Zafar et al., 2004). Dezavantajul
metodei este reprezentat de rata sczut de regenerare a plantelor din protoplati (Querci et
al., 2004a), motiv pentru care aceast metod nu s-a rspndit foarte mult n practic.
Cele mai utilizate metode din aceast categorie sunt prezentate n continuare.
5-
6-
Tehnica PCR
Extracia ADN-ului
Reacia PCR, clasic sau real-time, st la baza celor mai utilizate metode de testare
OMG. n cadrul analizelor ce au la baz aceast reacie, analitul este reprezentat de ADN, a
crui izolare i purificare constituie astfel prima etap a testrii OMG, specific biologiei
moleculare.
Tehnica PCR este reproductibil, specific i sensibil, caracterizndu-se printr-o mare
capacitate de discriminare, procesare i costuri relativ reduse. Performanele acesteia pot fi
ns limitate de caracteristicile intrinseci ale probei i de performanele metodei de extracie,
aspecte ce se reflect n absena/prezena inhibitorilor PCR i n calitatea i cantitatea ADNului din extracte (Di Pinto et al., 2007). Dac starea ADNului este influenat n principal de
procesarea industrial, eliminarea complet a inhibitorilor PCR (ex. polizaharide, acizi humici
sau lipide) depinde de procedura de extracie (Deisingh i Badrie, 2005). Aceste substane pot
persista n extractele finale, determinnd, n general, reducerea sau inhibarea complet a
procesului de amplificare.
Cele mai importante caracteristici ale extractelor utilizate n analizele PCR sunt
cantitatea, calitatea i puritatea, care, dac sunt nesatisfctoare, reduc sensibilitatea metodei
sau fac imposibil testarea OMG (Engel i Moreano, 2003, n Smith i Maxwell, 2007;
Deisingh i Badrie, 2005), mai ales n cazul n care materialul MG este prezent doar ntr-un
procent redus.
Existena unei largi varieti de metode destinate extraciei i purificrii acizilor
nucleici impune utilizarea urmtoarelor criterii pentru alegerea celei mai potrivite tehnici:
acidul nucleic int care trebuie izolat, tipul probei sau materialul iniial (ex. esut, frunz sau
material procesat), rezultatele ateptate (ex. cantitate, calitate sau timpul necesar pentru
purificare), aplicaiile ulterioare (ex. PCR, clonare, etichetare, blotting, real-time PCR sau
sintez de ADN complementar). Aceast alegere este foarte important, n special pentru
analiza cantitativ i reprezint de obicei un compromis ntre costuri, concentraia extractului
8
proba
testat.
practic,
poate fi foarte sensibil, capabil de detect i a uneia sau mai multor copii ale genelor
sau secvent ei t int de interes n cadrul unui material genetic al unui organism sau genom.
Trebuie luate toate masurile pentru evitarea contaminrii ncrucis ate.
9
PCR faciliteaz diferent ierea ntre anumite tipuri de modificri genetice. Metodele de
n plante, diferene care nu pot fi evideniate dup coninutul de proteine sau ulei, ns se
evideniaz cu uurin prin SIA.
V. Metoda ELISA
ELISA, implica testarea pentru detect ia proteinelor specifice prin exploatarea
specificitt ii legturii ntre antigenul exprimat s i anticorpul t int.
Testul de marcare enzimatic (enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) (metoda
ELISA) este unul de alternativ PCR i permite identificarea proteinelor (enzimelor)
codificate de transgene, cum ar fi, de exemplu, neomicin- fosfotransgeraza (nptII), EPSPS,
proteinele Bt, enzima PAT etc.
Metoda ELISA are ca principiu utilizarea unui marker enzimatic legat de un anticorp,
antigen sau hapten (substan care reacioneaz cu anticorpii, dar nu induce sinteza de
anticorpi - adic nu determin un rspuns imun). Prezena markerului enzimatic permite
detectarea reaciei antigen-anticorp. Deci antigenele sau anticorpii sunt cuplai covalent cu o
enzim (n locul radioizotopului sau fluorocromului). Cuplarea markerului enzimatic cu
antigenele sau cu anticorpii se face cu ajutorul unor molecule bifuncionale care leag cei doi
compui (fig.2.2). Evidenierea reaciei antigen-anticorp se realizeaz prin degradarea unui
substrat specific (marker enzimatic), urmat de o modificare de culoare, msurat
spectrofotometric. De exemplu, paranitrofenil fosfatul (galben) se utilizeaz pentru fosfataza
alcalin; 3,3',5,5'-tetrametil-benzidina (galben) sau 3-Amino-9-etilcarbazolul (rou) - pentru
peroxidaza.
11
12
mai putin sensibila decat PCR, de aceea mai putin susceptibila decat PCR in rezultate
pozitive false cauzate de mici nivele de contaminare;
13
14
gene,
biodiversitatea,
impactul economic,
avantajele
pentru
15
16
4.Concluzii
Din cele prezentate anterior se poate concluziona c utilizarea PMG-urilor, ca n cazul
oricrei alte tehnologii, prezint o serie de avantaje, dar poate genera i riscuri
i sntate. Trebuie de asemenea subliniat c pericolul nu este reprezentat
pentru mediu
ntotdeauna
de
tehnologia n sine, ci mai degrab de utilizarea iraional. O serie din situaiile prezentate
demonstreaz clar posibilitatea formulrii unor
17
Bibliografie
Acutis, M., P. Trevisiol, R. Confalonieri, G. Bellocchi, E. Grazioli, G. van den
Eede, C. Paoletti, 2007. Analytical method performance evaluation (AMPE) A
software tool for analytical method validation, Journal of AOAC International,
Ahmed, F. E., Detection of genetically modified organisms in foods, 2002. Trends
Biotechnol
Badea E.M., Sndulescu D. Biotehnologii.vegetale, Bucureti, 2001
Botu Dorica Biotehnologii horticole 2006 EUROBIT 201
Duca M., KALOSHIAN I. Tehnici de cercetare n biologia molecular, Chiinu, CE USM,
2002.
Popescu Sorina, Biologie Molecular, Editura Eurobit Timioara 2006
Altieri, M. A., P. Rosset, 1999, Ten reasons why biotechnology will not ensure food
security, protect the environment and reduce poverty in the developing world,
Deisingh, A. K., Neela Badrie, 2005, Detection approaches for genetically modified
organisms in foods, Food Research International
Holst-Jensen, A., 2007, Validation of real-time PCR methods;-what can we learn
from the field of GMO detection?, http://fou02.planteforsk.no/Nordforsk
NetworkMycotox/PDFs/Validation
James, C., 2005, An update of the role of GMOs in current and future production
worldwide, http://www.isaaa.org/Resources/publications/briefs/default.as
http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/
http://www2.biologie.fu-berlin.de/lampart/gp03/GUS_assay.html.
http://www.brutarul.ro/index.php/ro/altestiri/481-soluie-pentru-identificarea-culturilormodificate-genetic.html
18