ANDROGENEZA EXPERIMENTALĂ

 
 Progresele spectaculoase realizate în domeniul geneticii microorganismelor sunt justificate în
mare măsură de natura haploidă a materialului experimental.

La plantele superioare- organisme diploide şi poliploide- studiile similare sunt confruntate cu

dificultăţi generate de fenomene precum dominanţa sau segregarea, probleme ale căror soluţionare
prin intermediul metodelor clasice implică investigaţii laborioase.

La început, haploizii obţinuţi la plantele superioare au fost apariţii spontane, urmări ale unor
anomalii care pot avea loc în timpul procesului de reproducere sexuată, sau ca rezultat al aplicării
unor procedee experimentale specifice.

În anul 1963, Yamada şi colaboratorii au semnalat pentru prima dată izolarea unui ţesut haploid
din culturi de antere la Tradescantia reflexa.

În 1964, Guha şi Maheshwari au descris formarea unor structuri embrionare la Datura innoxia, a
căror origine din polenul imatur a fost confirmată ulterior
În 1967, Bourgin şi Nitsch au obţinut primele plante haploide din antere de Nicotiana sylvestris şi
Nicotiana tabacum.

Actualmente, obţinerea haploizilor prin cultivarea anterelor se înregistrează la peste 150 de specii
aparţinând la 52 de genuri şi 23 de familii de dicotiledonate şi monocotiledonate.
Androgeneza experimentală presupune dezvoltarea partenogenetică a unui embrion, respectiv plantă
haploidă, dintr-un nucleu haploid al microsporului germinat sau granulei de polen.
 
Antere
 

Microspori

Androgeneza directă Androgeneză indirectă

Proembrion Calus

Embrion
Regenerare

Plante haploide Plante haploide

• Sub influenţa unor stimuli externi (mediul de cultură, temperatura, lumina) poate fi declanşată
androgeneza directă, care presupune o evoluţie particulară a nucleului haploid al microsporului şi
anume, prin diviziuni mitotice repetate devine embrioid, iar apoi plantă haploidă. În cazul
androgenezei indirecte, microsporul se divide repetat formând mai întâi calus, din care apoi, pe
calea regenerării, se obţin plantele haploide.
• La angiosperme, fiecare celulă mamă diploidă a ţesutului sporogen dă naştere prin meioză la o
tetradă de microspori haploizi, numiţi şi granule de polen. Evoluţia ulterioară a granulei de polen
reprezintă dezvoltarea gametofitului mascul.
• Microsporii rezultaţi din tetradele meiozei sunt uninucleaţi. În urma primei mitoze polinice asimetrice
se formează doi nuclei inegali: unul vegetativ mai mare şi altul generativ mai mic. Microsporul
tânăr se transformă în granulă de polen binucleată, formată de fapt din două celule: una vegetativă
şi alta generativă.
• Celula generativă se divide încă o dată ( a doua mitoză polinică) rezultând doi gameţi
masculi(nuclei spermatici), care vor participa la dubla fecundare: unul se uneşte cu oosfera, iar
celălalt cu nucleul secundar al sacului embrionar.
• În celula vegetativă, nucleul se măreşte, se acumulează amidon, au loc activităţi metabolice
intense şi se formează tubul polinic..
• “În vitro”, gametofitul mascul poate urma o altă evoluţie finalizată cu apariţia embrionilor haploizi
prin:diviziuni repetate ale celulei vegetative, în timp ce celula generativă avortează; diviziuni
repetate ale celulei generative, fără participarea celulei vegetative la formarea haploidului; diviziuni
simetrice ale nucleului microsporului cu formarea a doi nuclei, respectiv două celule identice.
Reprezentarea schematică a dezvoltării polenului ” in vivo”
şi ” in vitro” (după Guha şi Maheshwari, 1971)
 Pentru inducerea unei devieri a programului normal de dezvoltare a gametofitului mascul există
trei metode: de cultivare a anterelor, inflorescenţelor şi polenului.

• Cultura de antere este metoda cea mai veche, introdusă de Guha şi Maheshwari, (în 1964) la
Datura innoxia, ulterior fiind aplicată şi altor specii de interes economic: orez, grâu (Hu, 1978),
secară (Wenzel, 1977), tutun (Sunderland, 1977). În cazul acestei metode, s-a elaborat un protocol
experimental care să asigure numai dezvoltarea polenului, fără ţesuturile somatice înconjurătoare.
Polenul se dezvoltă fie sub forma unor structuri organizate de tipul embrionilor (la tutun, varză),
fie sub forma unor mase neorganizate de celule (calus) ( la cereale).
• Cultura de inflorescenţe a fost pusă la punct de Wilson,(în 1977) pentru orz şi în general este
folosită în cazul speciilor cu flori mici, având periant redus.
• Cultura de polen datează din 1974, prin contribuţia lui Nitsch şi a fost aplicată la câteva specii din
familia Solanaceae. Ea implică o cultivare prealabilă a anterelor, pentru a impiedica degenerarea
polenului după izolare Polenul este reactiv în cultură numai în decursul unei scurte perioade din
dezvoltarea timpurie a anterelor. Această perioadă începe imediat după eliberarea microsporilor din
tetrade şi se sfârşeşte la scurt timp după prima diviziune mitotică, care iniţiază formarea
gametofitului mascul. În acest interval există un stadiu optim pentru fiecare specie sau varietate.

Sunderland, (în 1980) clasifică speciile, funcţie de răspunsul polenului în cultură în 3 clase:
1. premitotică (cerealele)- au reacţia optimă înainte de prima diviziune mitotică;
2. mitotică (tutunul)- răspunsul optim este în timpul diviziunii mitotice;
3. postmitotică (Nicotiana sylvestris)- răspunsul optim este la încheierea diviziunii, o dată cu formarea
celulei generative.
 Plantele haploide sunt pure genetic, la ele manifestându-se fenomenul de hemizigoţie, posedă
numai o doză de gene în genotip şi nu perechea de alele, de aceea există o corespondenţă deplină
între genotip şi fenotip. Pentru ameliorare, acest fapt este foarte important în realizarea selecţiei
tipului corespunzător de plantă la nivel haploid.

Prin diploidizarea haploizilor pot fi obţinute liniile izogene, care sunt homozigote pentru
totalitatea genelor. Caracteristica esenţială a plantelor dublu haploide constă în faptul că ele
posedă gene similare la aceiaşi loci din cromosomii omologi.
Descendenţa acestor linii, datorită homozigoţiei, este identică şi uniformă genetic şi este
menţinută prin autopolenizare. Importanţa utilizării liniilor dublu haploide în procesul de ameliorare
derivă din identitatea perechilor de alele, care controlează o anumită caracteristică, fapt care
asigură uniformitatea indivizilor în cadrul unei generaţii precum şi de la o generaţie la alta.

Metoda haploidiei şi, implicit, producerea liniilor izogene constituie baza obţinerii de noi soiuri.
Producerea liniilor izogene valoroase prin metoda androgenezei experimentale se realizează într-
un timp mult mai scurt decât prin metoda clasică, de pildă, la Nicotiana tabacum ciclul de obţinere
de noi soiuri prin utilizarea haploidiei este de 5 ani, în timp ce prin metoda clasică, este de 10-12
ani. Aceasta înseamnă o mărire a eficienţei procesului de ameliorare în condiţiile reducerii
substanţiale a cheltuielilor (suprafeţe reduse de teren, necesităţi reduse de forţă de muncă).

Liniile izogene obţinute la Solanum tuberosum sunt utilizate pentru ameliorarea unor caracteristici
cantitative: rezistenţa la boli şi dăunători, la îngheţ, forma tuberculilor.
 Cultivarea celulelor haploide reprezintă un sistem ideal pentru cercetările de mutageneză :
inducerea mutaţiilor la nivel haploid are un caracter mai controlat şi, totodată, permite izolarea
imediată a mutantelor.

Mutageneza la nivel haploid generează o mare variabilitate genetică, care în urma selecţiei
permite obţinerea unor plante mai productive, mai bine adaptate la mediu, rezistente la boli.

Prin metoda androgenezei experimentale se pot evidenţia rapid mutaţiile recesive şi pot fi induse
artificial mutante la nivel haploid. Posibilitatea izolării rapide a mutaţiilor recesive naturale sau
induse artificial reprezintă un avantaj al haploizilor, aceasta spre deosebire de plantele diploide, la
care mutaţiile recesive nu se manifestă decât în stare homozigotă.

Mutaţiile recesive sunt evidenţiate imediat la nivel haploid, ele pot fi aduse prin diploidizare în
stare homozigotă, la liniile izogene.
Un avantaj al plantelor haploide sau dublu haploide îl constituie faptul că acestea manifestă atât
trăsăturile recesive, cât şi dominante, şi ca atare pot fi uşor selectate.
.
 Numeroase mutante biochimice au putut fi izolate la nivel haploid: mutante de tip auxotrof pentru
biotină, arginină, precum şi mutante rezistente la antibiotice, erbicide sau diferiţi factori de
stres( temperaturi scăzute sau ridicate, salinitate).

Inducerea şi detectarea la plantele de cultură a unor mutante rezistente sau tolerante la doze mai
mari de pesticide şi capabile să metabolizeze aceste substanţe chimice asigură obţinerea unor
genotipuri rezistente, evitându-se riscul distrugerii culturilor, în cazul administrării unor cantităţi mai
mari de pesticide. Capacitatea de metabolizare a substanţei active din pesticide constituie premiza
producerii unor recolte lipsite de substanţe remanente nocive pentru om şi animale.

Acumularea excesivă a sărurilor solubile (clorurile) constituie un factor limitativ pentru producţia
agricolă. Creşterea şi dezvoltarea plantelor este afectată de excesul de săruri din sol. Studiile de
mutageneză, efectuate pe culturi haploide de Nicotiana sylvestris au permis selectarea unor linii
celulare care tolerează NaCl, fiind capabile să creasă la o concentraţie de 1-50%. Liniile selectate
şi-au păstrat această proprietate după multe generaţii. În mod normal celulele tolerează
concentraţii de NaCl doar de 1 % .
 Antere

Microspori 

Embriogeneză Calus haploid

Plante haploide Mutageneză fizică şi chimică

Dublarea cromosomilor Selecţie şi regenerare

Plante homozigote (linii izogene) Mutante

 
Factorii implicaţi în declanşarea androgenezei experimentale sunt:

• Genotipul plantei donatoare influenţează atât capacitatea anterelor de a produce calus, cât şi
capacitatea calusului de a regenera plante haploide. De pildă, la viţa de vie, Gresshoff a obţinut
calus haploid doar la 3 din cele 27 de soiuri testate. La diferite soiuri de Triticum aestivum s-au
înregistrat diferenţe în privinţa potenţialului androgenetic (Chu, 1973).

• Vârsta şi starea fiziologică a plantei donatoare se referă la stadiul de dezvoltare a polenului care
urmează a fi cultivat. Faza optimă de dezvoltare a microsporilor, necesară pentru inducerea
androgenezei este cuprinsă între stadiul de tetradă şi imediat după prima mitoză polinică. De pildă,
la cereale recoltarea anterelor în etapa de dezvoltare de microspori uninucleaţi asigură
răspunsurile androgenetice maxime.

• Mediul nutritiv, lumina şi temperatura afectează randamentul androgenezei directe şi indirecte.

În general se utilizează mediile White, Murashige-Skoog şi Nitsch, care conţin toate elementele de
bază necesare dezvoltării “in vitro”: macroelemente, microelemente, aminoacizi esenţiali, vitamine,
substanţe de creştere. Zaharoza, în concentraţie de 8% are efect inductiv asupra culturii de antere
de Brassica napus, Brassica campestris, B. oleracea, B. nigra. Alteori efectul inductiv constă în
utilizarea unei concentraţii de 17-20% zaharoză, urmată de reducerea concentraţiei la 10-13 %.
Aminoacizi, ca glutamina, prolina, asparagina stimulează embriogeneza haploidă la orz, grâu,
porumb.
 Temperatura optimă de cultivare “in vitro” a polenului este de 27 ˚C. Microsporii izolaţi prezintă o
fotosensibilitate mai crecută decât a anterelor, de aceea în primele zile de cultură ei sunt ţinuţi la
întuneric. Schimbarea evoluţiei normale a microsporilor cu o evoluţie pe cale vegetativă poate fi
indusă prin tratarea anterelor cu diferiţi agenţi fizici sau chimici, care contribuie la sporirea
numărului de diniziuni simetrice ale microsporilor. Anterele sunt supuse şocurilor termice, fiind
păstrate timp de 24-48 de ore la temperatura de 3-5 ˚C.
Obţinerea plantelor diploide homozigote presupune tratamentul cu colchicină a plantelor
haploide, substanţă care blochează mitoza în metafază, prin inactivarea fusului de diviziune, ce are
ca efect dublarea numărului de comosomi.
Embriogeneza haploidă se referă nu numai la regenerarea “in vitro” a plantelor haploide din
culturi de microspori(antere), ci şi din ovule (ovare).
• Ginogeneza experimentală are un caracter mai limitat decât androgeneza, deoarece aceasta din
urmă presupune folosirea unui materialde start mult mai abundent, mai uniform ca mărime şi mai
uşor de manipulat.
• Dezvoltarea embrionilor haploizi din culturi de ovare, ovule, muguri florali a fost obţinută la
monocotiledonate şi dicotiledonate.
• Se cultivă de obicei sacul embrionar cu cei 8 nuclei şi fiecare celulă haploidă poate da naştere unui
embrion. Studii histologice privind ginogeneza experimentală au fost efectuate îndeosebi la
Helianthus anuus.
• La Oryza sativa, sinergidele au evoluat spre calea embriogenezei (He şi Yang, 1988), iar la Allium
tuberosum antipodele (Tian şi Yang, 1989).
 Factorii care influenţează ginogeneza sunt aceiaşi ca şi în cazul androgenezei:

• Genotipul plantei donatoare- diferenţe genotipice sub aspectul embriogenezei au fost semnalate la
Allium cepa şi Beta vulgaris;

• Stadiul de dezvoltare a celulelor gametofitului femel - la Helianthus anuus, recoltarea ovulelor s-a
efectuat cu 3-4 zile înainte de înflorire. la Beta vulgaris , ovulele de formă alungită au fost adecvate
pentru embriogeneză, iar cele sferice au degenerat. Sezonul recoltării influenţează frecvenţa
ginogenezei în culturi de ovule(ovare).

• Mediul de cultură şi condiţiile fizice – fitohormonii joacă un rol important în declanşarea

ginogenezei. De pildă, la Beta vulgaris s-a utilizat BAP (benzilaminopurină). Mediul de iniţiere a
culturii conţine zaharoză (10%). La Alium cepa , cultivarea ovulelor se realizează la 27 ˚ C şi la
lumină slabă. La Beta vulgaris, ovulele au fost cultivate 4-5 zile la temperatuă scăzută, iar la
Helianthus annuus, 24-48 de ore la temperatura de 4 ˚C.
Quercus suber
a) Stadii ale dezvoltării staminelor b) Polenul în stadiu de tetradă şi
apariţia microsporilor izolaţi c) Microspori uninucleaţi d) Microspori
uninucleaţi (vacuolizaţi) e) Microspori binucleaţi
Inducerea şi proliferarea embrionilor haploizi la (Quercus suber L.)
a) Quercus suber L. b) Ramuri cu stamine c)Cultivarea anterelor in vitro d)
Dezvoltarea embrionilor haploizi e) Stadii incipiente ale embriogenezei
haploide f) Proliferarea embrionilor haploizi
Inflorescente, muguri, antere si microspori de Olea europaea L.
a. tetrade ;
b.,c. microspori uninucleati- stadiu timpuriu;
d. microspori uninucleati- stadiu avansat;
e. granule de polen binucleate;
f. granule de polen matur.