MICROPROPAGAREA ŞI FOLOSIREA EI ÎN

AMELIORAREA PLANTELOR

Termenul defineşte înmulţirea în vitro a plantelor şi reprezintă o formă de

multiplicare vegetativă. Acest mod de înmulţire permite obţinerea rapidă a unui
număr impresionant de indivizi identici din punct de vedere genetic.
Micropropagarea se poate face pe căi diferite şi anume: formarea lăstarilor
adventici; lăstărire axilară multiplă şi embriogeneză somatică.
Lăstarii adventici pot fi obţinuţi prin organogeneză directă sau indirectă.
Ultimul tip este asociat însă cu o instabilitate genetică evidentă.

Clasificarea culturilor în vitro în funcţie de tipul de cultură şi scopul urmărit

(după Elena Marcela BADEA şi Daniela Săndulescu, 2000).

Tipul de cultură Scopul

Cultura de embrioni Scurtarea ciclului de ameliorare
Prevenirea avortării embrionilor
Depăşirea incompatibilităţii postzigotice
Producerea haploizilor
Sursă de explante pentru obţinerea calusurilor
Cultura de meristeme Eliminarea patogenilor (virusuri, bacterii,
ciuperci)
Clonarea plantelor
Conservara germoplasmei
Stocarea plantelor libere de virusuri
Cultura de apexuri şi noduri Lăstărirea axilară pentru clonare
Crioprezervarea
Cultura explantelor fără
performanţi.
Cultura de calus/celule în suspensie
Cultura de antere şi microspori
Cultura de ovule şi flori excizate
Cultura de protoplaşti
muguri Clonarea prin formarea organelor adventive
Izolarea mutantelor
Obţinerea poliploizilor.
Clonarea plantelor prin formarea mugurilor sau
embrionilor
Obţinerea variantelor clonate
Selecţia mutantelor
Producerea metabiliţilor secundari
Biotransformarea
Producerea haploizilor şi liniilor homozigotice
Producerea plantelor supermascule
Selecţia mutantelor
Depăşirea incompatibilităţii pre şi postzigotice
Prevenirea absciziei florilor
Realizarea fecundării în vitro
Hibridarea somatică
Crearea cibrizilor
Transferul de gene

Lăstărirea axilară multiplă are loc la nivelul vârfului tulpinii şi a

mugurilor laterali. Pentru clonare, propagarea din muguri terminali sau axilari sau
din ‚ţesut maristemic este mai favorabilă deoarece reduce apariţia unor variaţii
genetice.
Explantele obţinute din vârful lăstarilor include adesea 1-2 primordii de
frunze în plus, faţă de cele din regiunile meristemice şi prezintă unele avantaje:
sunt excizate mai repede, fiind mai mari; au rată de supravieţuire mai mare; ciclul
de multiplicare este foarte scurt (câteva săptămâni) şi prin urmare numărul de
plante care poate fi realizat într-un interval de timp este foarte mare.
Problema principală a micromultiplicării plantelor la scară industrială
constă în realizarea unei rate şi a unui ritm cât mai ridicate de clonare, pentru a
asigura un preţ de cost competitiv.
Coeficientul de înmulţire la acest mod de propagare poate fi foarte ridicat.
Minodora PĂTRAŞCU (1981) apreciază că la specia Chrysantheum se pot
obţine într-un an circa 9.000.000 plante pe calea sistemului de micromultiplicare
care utilizează ca explant ţesut tulpinal, în timp ce prin sistemul de înmulţire
vegetativă, (butaşi) se obţine maxim 30.000 plante.
HOLDGATE (citat de Dorina CACHIŢA COSMA, 1987) menţionează că
dintr-o plantă donatoare, în primul an de cultură se obţine cca 100.000 de plante,
iar prin subculturi repetate, în funcţie de specie, numărul de exemplare – copii
fidele – poate creşte an de an.
Foarte important de subliniat este şi faptul că plantele obţinute prin cultură
in vitro, fiind copii conforme cu planta mamă, alcătuiesc o cultură cu o mare
uniformitate, ceea ce este mai greu de realizat prin procedeele tradiţionale.
Propagarea prin culturi de ţesuturi nu poate fi folosită practic pe scară largă
la plantele agricole, care produc sămânţă sau în cazul în care suprafeţe mari
trebuiesc plantele, din cauza costurilor prea mari de transplantare a plantelor
regenerate.
În schimb, există un larg potenţial şi rezultate deosebite la multe alte specii
floricole şi ornamentale care produc sămânţă puţin (Anthurium, Pelargonium,
Begonia, Freesia, Chrysanthenum etc), precum şi la specii horticole (cartof,
căpşun, etc) . Sunt multiplicate in vitro în măsură importantă, numeroase specii de
arbuşti ornamentali, pomi şi arbuşti fructiferi dar şi arbori forestieri. Cea mai
avansată aplicare comercială s-a realizat la orhidee.
Micropopagarea poate fi folosită cu bune rezultate în ameliorarea plantelor,
cu condiţia existenţei unor procedee eficiente de culturi de ţesuturi care să fie
folosite curent pentru specia respectivă şi a păstrării intacte a zestrei genetice, în
descendenţă.
Pe lângă multiplicarea rapidă şi pe scară largă a unor lante identice din
punct de vedere genetic şi care provin dintr-un singur genotip genetic superior,
propagarea clonală mai are şi alte utilizări potenţiale în ameliorarea plantelor şi
anume înmulţirea rapidă a primelor generaţii hidrice, înmulţirea pe scară largă a
genotipurilor heterozigote; înmulţirea genotipurilor autoincompatibile pentru
programele de ameliorare , etc.
 Embriogeneza somatică şi sămânţa artificială. Embriogeneza somatică
constituie modalitatea cea mai eficientă de accelerare a micropopagării.
Aptitudinea celulelor vegetale somatice de ase dezvolta în embrioni
somatici este cunoscută de mult timp (STEWARD şi MEARS, 1953), dar numai
după anii 80 embriogeneza somatică a cunoscut interes crescând, eaapărând în
numeroase cazuri ca fiind cea mai eficientă metodă de multiplicare vegetativă.
Mai mult, există menţiuni privind capacitatea unor specii (morcov, lucernă, viţa de
vie, ş.a. ). Capabile de a produce un număr mare de embrioni somatici în mediu
lichid şi care au un comportament analog cu embrionii sexuaţi.
Utilizându-se calus, pe un mediu lichid care este agitat, celulele care
formează conglomerate nediferenţiate se dispersează şi evoluează datorită
mediului nutritiv, formând embrioni într-un timp relativ scurt. Prezentând
primordii cotiledonale şi un mugure central, aceştia nu diferă cu nimic de un
embrion natural conţinut de o sămânţă.
Etapele principalele ale acestui proces pot fi sintetizate astfel: explantele de
pornire sunt prelevate din diferite organe sau ţesuturi, sau constituie din celule
izolate, se formează un calus primar (din explantul unui organ) sau un microcalus
din celule izolate; se realizează subculturi de calus primar sau de microcalus;
calusul poate fi disociat sub formă de suspensii celulare. Suspensiile celulare
repuse pe mediu de cultură solid pot general calus.
În aceste condiţii , resturile celualre în mediu lichid sau solid se organizează
în numeroase masive mici cu structură bipolară (cu un meristem caulinar şi unul
radicular), numiţi embrioizi asexuaţi sau somatici. Embrioizii se dezvoltă ca şi
embrionii zigotici în plante, având capacitatea de a se înrădăcina, asemenea
plantulelor din sămânţă normală.
Cultura embrionilor somatici oferă două perspective de utilizare:
- accelerarea micropopagării;
- producerea de seminţe artificiale.
 Accelerarea micropopagării. Embrionii somatici prezintă unele avantaje
pentru multiplicare plantelor. Provenind de obicei dintr-o singură celulă, sunt
capabili să realizeze plante uniforme genetic, pe când cele produse prin
caulogeneză pot prezenta numeroase himere.
Producerea de seminţe artificiale. Într-o perspectivă mai mult sau mai puţin
îndepărtată, apare posibilitatea creării seminţelor artificiale. S-a pornit de la ideea
încapsulării embrionilor somatici într-un mediu nutritiv şi într-o membrană
permeabilă biodegradabilă care va permite seminţei artificiale să germineze în sol
şi să formeze o nouă plantă, copie a plantei de la care a fost prelevat explantul de
origine. Principiul este simplu şi pus la punct sub aspect teoretic.
La cca 100 de specii au fost realizate metode de producere a calusurilor
embriogene, ca şi tehnica obţinerii de embrioni, dar există numeroase aspecte
practice şi economice nerezolvate. Dintre acestea cele mai importante sunt cele
legate de nesincronozarea proceselor de formare a embrionilor somatici dintr-o
cultură; realizarea în mică a inducerii simultaneităţii maturării acestora, precum şi
a izolării fiecărui embrion în vederea semănatului (CHU, 1986). Mediul de
cultură conţine deci embrioni de toate vârstele şi dimensiunile , fapt ce creează
numeroase aspecte negative.
LUZ şi colab. (1985) menţionau că într-un mililitru de mediu de cultură se
găsesc circa 2x106 celule, din care se pot obţine aproximativ 5000 de embrioni
somatici după 14 zile de cultivare a celulelor pe un mediu lipsit de 2,4 D. La scară
industrială apare ca imposibil de reperat toţi embrionii ajunşi la stadiul ideal
pentru includerea în mediu nutritiv adecvat şi într-o membrană, ca ,,sămânţă
artificială”. S-a imaginat un sistem de filtre bine echilibrate pentru trierea
embrionilor prea mici sau prea dezvoltaţi.
De asemenea, evaluând că într-un m3de mediu lichid pot să se găsească
peste 1.000.000 de embrioni, s-a evidenţiat necesitatea realizării unor tipuri de
fermentatoare industriale în care pot fi cultivate celulele. Pentru rezolvarea acestui
aspect s-a recurs la fermentatoare asemănătoare cu cele utilizate în culturile de
microorganisme în scopul producerii substanţelor de origine vegetală (metaboliţi).
STEZER (1985( a imaginat un sistem de bioreactor pentru obţinerea pe
scară mare a embrionilor somatici în suspensii celulare. Se apreciază că în
recipiente de mică capacitate (1-5 l) se pot obţine cu uşurinţă sute de mii de
embrioni. După obţinerea lor, embrionii somatici pot fi menţinuţi cca 20 de
săptămâni până la semănarea acestora. Sub aspectul menţionat, s-au obţinut
rezultate promiţătoare la morcov, ţelină, palmierul de ulei, cafea, curmal, etc.
O altă problemă dificilă o constituie stabilizarea embrionilor în vederea
stocării. Fără acest lucru, embrionii odată formaţi îşi continuă dezvoltarea,
germinează sau pier dacă sunt lipsiţi de elementele nutritive. Actualmente sunt în
studiu diverse procedee de stabilizare. Astfel, GEBBART (1985) a pus la punct un
sistem de încapsulare a embrionilor somatici în polimeri biodegradabili. Împreună
cu embrionii, a încapsulat şi o serie de compuşi pentru a susţine germinaţia şi
creşterea (regulatori de creştere , fertilizanţi, pesticide, amendamente şi de la caz la
caz , anumite tipuri de bacterii fig.1.

Fig. 1. Structura teoretică a unei seminţe artificiale

 1.- prelevare de celule; 2- început de cultură prin fragmentare; 3-cultură pe
mediu lichid; 4- obţinere de embrioni somatici; 5 - cultură directă de embrioni ; 6-
încapsulare pentru culturi diferite

KILTO şi JANICK (1985) au reuşit să încapsuleze embrionii somatici de

morcov, în polietilenă 5%. La începutul experimentului, procentul de supravieţuire
a embrionilor a fost modest (3%). S-a dovedit ulterior că prezenţa acidului abscisic
în cursul inducţiei embrionare a determinat sporirea evidentă a procesului de
supravieţuire a embrionilor.
SMITH şi MURASHIGE (1984) au făcut experienţe cu embrioni somatici
de dovleac şi au observat necesitatea realizării sincronizării embriogenezei în
suspensiile celulare. Ei au ,,cernut” suspensia prin site, după care au centrifugat
cultura şi au trecut-o pe un mediu cu un anumit conţinut de zaharoză, pentru a
împiedica germinarea precoce a embrionilor. De remarcat că procedeul a favorizat
şi dezvoltarea embrionilor insuficienţi formaţi. În prezent, pentru anumite specii
(lucernă, grâu, orez, morcovi, etc) s-a reuşit să se cunoască cu exactitate procedeul
de inducere într-o cantitate adecvată de mediu, a embrionilor şi stimulării
germinării lor. Introduşi în sol, embrionii astfel condiţionaţi , germinează normal
(DEMARLY şi SIBI, 1989).
RODENBAUGH şi colab (1984) preconizează încorporarea embrionilor
într-o matrice de gel, constituită din alginat de natriu, inserată apoi într-o soluţie
de clorură de calciu, pentru solidificarea matricei.
Toate realizările menţionate constituie, în principal, reuşite de laboratr, dar
ele deschid perspective deosebite agriculturii viitorului.
Sămânţa artificială , pe lângă faptul că este realizabilă într-o perioadă
scurtă de timp (din momentul prelevării explantului şi obţinerea acestuia sunt
necesare 1-2 luni ), poate aduce şi alte avantaje:
- din punct de vedere genetic apare posibilitatea obţinerii de sămânţă la
specii care obişnui nu o produc. Este cazul cartofului dulce, a sfeclei triploide,
bananierului, a unor graminee şi leguminoase furajere şi perene ş.a. Prin acest mod
de multiplicare s-ar putea menţine vigoarea hibridă, fără obligativitatea menţinerii
liniilor parentale. Odată creat un hibrid ar fi suficient să se preleveze explantul ce
va constitui sursa seminţelor necesare culturilor. Această tehnică ar permite
producerea de sămânţă artificială hibridă şi la speciile autogame (cereale păioase,
leguminoase pentru boabe) la care producţia acesteia nu este pusă la punct, pe
scară comercială;
- sub aspect fitosanitar , multiplicarea în vitro şi în fermentatoare, ca şi
includerea embrionilor într-un mediu steril, s-ar traduce în ultimă instanţă în
obţinerea unor seminţe sănătoase. Pentru aceasta, sămânţa încapsulată scoasă din
mediul controlat, trebuie să aibă în învelişul capsular bacterii sau enzime cu
proprietăţi protectoare, ca şi erbicide şi fungicide în doze reduse, cu efect localizat
la nivelul patului germinativ. Pentru eliminarea viruşilor se pot realiza inoculi cu
viruşi mai puţin virulenţi, pentru a combate surse virulente . În acelaşi timp
fermentatoarele ar putea fi utilizate pentru aplicarea termoterapiei şi eliminarea
totală a agentului patogen;
- sub aspect nutriţional şi dinamic, în capsulele protectoare pot fi introduşi
hormoni sau îngrăşăminte – starter, care pot favoriza germinarea printr-o nutriţie
suplimentară, sau pot fi asociate cu bacterii simbiotice (Rhizobium).
Pentru a se putea perfecta crearea seminţei artificiale se urmăreşte cu
precădere găsirea mijloacelor de stopare a dezvoltării embrionilor formaţi şi
îmbunătăţirea fiecărei etape de producere. În acest sens, menţionăm, punerea la
punct a mediilor de cultură pentru fiecare specie, a fermentatoarelor de dimensiuni
uriaşe, a tehnicilor realizării învelişului protector. Studiile întreprinse vor putea
avea repercusiuni pozitive privind multiplicarea celulelor vegetale, tehnicile de
includere în diferite învelişuri protectoare, fabricarea de biomembrane ş.a.
Noua tehnică de producere de sămânţă poate avea o serie de repercusiuni
pozitive sub aspect socio – economic, determinate de schimbarea sistemului
convenţional de producere de sămânţă.
Exemplu:
ÎNMULŢIREA PRIN MICROPROPAGARE (IN VITRO) MATERIAL
SĂDITOR VITOCOL

La viţa de vie primele începuturi privind micropropagarea "in vitro" s-au

înregistrat cu aproximativ cinci decenii în urmă (Morel G., 1944). Reţinerile
privind folosirea acestei metode au fost datorate potenţialului de rod mai redus în
primii ani, determinat de fenomenul de " juvenilizare " (Mullins M. G. şi colab.,
1979). Acest dezavantaj poate fi eliminat prin unele tratamente care favorizează
trecerea mai rapidă de la starea fiziologică " juvenilă " la cea adultă (Nazeron R.
şi colab., 1983). Un alt inconvenient al clonării "in vitro" la viţa de vie îl
reprezintă faptul că plantele obţinute nu pot fi folosite la înfiinţarea plantaţiilor
viticole pe terenurile unde se impune utilizarea viţelor altoite.
Micropropagarea (cultura "in vitro"), ca metodă de înmulţire vegetativă, se
bazează pe următoarele principii fiziologice : totipotenţa celulară, independenţa
fiziologică temporară şi aparentă a explantelor, posibilitatea de stimulare a
proliferării ţesuturilor şi de înmulţire a plantelor neoformate.
Totipotenţa celulară este deţinută de fiecare celulă, dar exprimarea se
produce numai la unele tipuri de celule sau grupe de celule. Acestea sunt
restructurate morfogenetic şi pot răspunde anumitor stimuli meniţi să regenereze,
în anumite condiţii specifice, formaţiuni de embrioni cu rădăcină, tulpină şi
coroană, până la plante noi (Murashige S., 1984).
Independenţa temporară şi aparentă exprimă posibilitatea de menţinere în
viaţă a explantelor, inoculate pe mediu de cultură, până la emiterea de
neoformaţiuni.
 Posibilitatea de stimulare a proliferării ţesuturilor se materializează prin
inocularea explantelor pe medii de cultură în vederea transformării lor în
formaţiuni tisulare autonome.
Multiplicarea plantelor neoformate are la bază posibilitatea de
înrădăcinare a minibutaşilor pe medii de cultură asemănătoare celor din faza
iniţială, însă cu corectarea conţinutului în substanţe hormonale - prin reducerea
citokininelor în favoarea auxinelor.

Fazele operaţionale
Procesul de micropropagare cuprinde, în ansamblu, mai multe faze (etape)
derulate într-o anumită succesiune, însă fără o accepţiune unitară. Astfel,
Murashige S. (1974) distinge pentru prima dată în practica de micropropagare în
sistem industrial trei etape, şi anume:
- etapa I-a, care cuprinde înfiinţarea culturilor cu plante selecţionate şi o
stare fitosanitară îmbunătăţită, de la care se recoltează material vegetal donator de
explante;
- etapa a II-a, care include iniţierea, multiplicarea şi propagarea "in vitro"
a materialului vegetal;
- etapa a III- a, ce constă în pregătirea şi trecerea plantelor regenerate "in
vitro" pe substrat natural.
Pe baza noilor realizări ştiinţifice sunt acceptate cinci etape (fig.6.4.):
Etapa I. Înfiinţarea culturii de plantă mamă.
Etapa a II-a. Înfiinţarea culturii "in vitro" . Aceasta cuprinde iniţierea şi
creşterea de plante noi pe medii artificiale din fragmente vegetale (culturi de
organe cu capacitate regenerativă şi explante de dimensiuni microscopice, ţesuturi,
celule, protoplaşti).
Materialul vegetal folosit provine de la plante mamă sănătoase obţinute
anterior sau de la plante elită alese pentru înmulţire. În funcţie de tipul de explant
şi faza sezonală se recoltează în perioada de repaus relativ porţiuni de coarde care
nu au mugurii bine exteriorizaţi şi în faza de creştere intensă din perioada de viaţă
activă, lăstari cu frunze şi vârful intact.
Etapa a III-a. Formarea şi multiplicarea plantulelor neoformate.
Recipientele cu medii nutritive, în care s-au inoculat explante, se depun în camera
de creştere cu condiţii de mediu controlat, în rândul cărora temperatura, lumina,
umiditatea şi aerul ocupă un loc important.
Etapa a IV-a. Înrădăcinarea neoplantulelor. Multiplicarea şi
înrădăcinarea se realizează prin subculturi repetate de minibutaşi. Operaţiunea
poate fi favorizată, în prealabil, şi pe calea alungirii lăstarilor prin transferul
culturii iniţiale pe timp limitat pe un mediu adecvat.
Fluxul tehnologic de multiplicare constă în detaşarea, începând de la bază,
a lăstarilor neoformaţi în faza iniţială, urmată de fragmentarea lor sub formă de
minibutaşi de câte un nod cu ochi. Aceştia sunt trecuţi în subcultură pe un mediu
de cultură proaspăt, asemănător celui iniţial, însă, cu corecţia conţinutului în
substanţe hormonale, respectiv de reducere a citokininelor (zeatină sub 0,1 mg/l) şi
de asigurat preponderenţa auxinelor în favoarea înrădăcinării.
Multiplicarea se continuă prin subculturi repetate de până la 10 -12 etape
succesive, cu intervale de 35 - 45 zile pentru fiecare din acestea. În felul acesta se
6
poate ajunge la o rată posibilă de multiplicare de până la 2 x 10 (Nazeran, R.,
1972). Plantele obţinute prin subculturi repetate şi cele individualizate încă din
faza iniţială se înrădăcinează "in vitro".
Etapa a V-a. Transferul în mediul natural, verificarea şi livrarea
materialului. Rolul important în transferul plantelor din mediul controlat aseptic
în cel natural îl are aclimatizarea.. În faza de început, pentru diminuarea stresului
hidric, se acoperă fiecare plantă cu ghivece din material plastic. În vederea
certificării valorii biologice a materialului produs, plantele aclimatizate în mediul
natural se supun unui control citogenetic şi fitosanitar adecvat .
 BIBLIOGRAFIE

1. M. Savatti , G.Nedelea, M.Ardelean – Trata de ameliorarea plantelor –

Editura Marineasa – Timişoara 2004.
2. Ardelean M. 1986 – Ameliorarea plantelor horticole şi tehnica
experimentală , Tipo Agronomia – Cluj Napoca
3. G.Nedelea – Ameliorare generală – Editura Agroprint – Timişoara – 2003.