Raport de Cercetare

Grant: OBŢINEREA UNOR GENOTIPURI SUPERIOARE PRIN SELECŢIE ASISTATĂ DE MARKERI

GENETICI LA SOIA (GLYCINE MAX L. MERR),

Autor: Şef de lucrări Dr. STROE Elena

Universitatea: DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREŞTI

OBIECTIVUL GRANTULUI

Deşi înainte de 1989 România se găsea printre cei mai mari cultivatori de soia din
Europa, deţinând chiar locul întâi în anii ’80, în prezent, datorită transformărilor sociale şi
economice survenite după 1989, ponderea acestei culturi în structura culturilor de câmp a
scăzut drastic, cauzele fiind foarte variate: reducerea activităţii principalilor utilizatori de
proteină vegetală (complexele de creştere a păsărilor şi porcilor); fărâmiţarea suprafeţelor
agricole; incapacitatea micilor fermieri de a urmări tehnologia de realizare a culturii, prin lipsa
utilajelor necesare sau prin utilizarea unui material semincer necorespunzător; preţuri de
achiziţie foarte mici, comparabil cu efortul financiar necesar pentru realizarea culturii.
Cu toate acestea, cercetarea românească continuă să spere că rezultatele sale vor fi
necesare cultivatorilor de soia din România, într-un viitor nu foarte îndepărtat. Este evidentă
necesitatea existenţei unor soiuri cu o producţie ridicată şi de calitate, cu o bună precocitate şi
rezistenţă la cădere şi scuturare şi la boli (arsura bacteriană şi mana), ca şi selecţia unor
genotipuri cu arhitectură modificată, care să permită creşterea randamentului fotosintezei.
Pe plan mondial, cercetarea soiei in vederea ameliorarii sale se indreapta in prezent
indeosebi spre metodele moderne, cum sunt culturile in vitro si tehnologia ADN-ului recombinat,
bazate pe cunoaşterea din ce in ce mai aprofundata a genomului soiei prin tehnicile biologiei
moleculare.
In tara noastră au fost utilizate până în prezent numai metodele tradiţionale: hibridarea,
selecţia, mutageneza clasica. Începând cu anul 1992, in cadrul colectivului nostru au fost
abordate si tehnicile noi, legate de cultura in vitro a acestei specii, folosind-o ca pe o noua
sursa de variabilitate.
Anumite caracteristici, care, de altfel, implică proceduri de laborator destul de costisitoare, au
dovedit că pot fi folosite în selecţia asistată de markeri genetici (MAS = Marker-Assisted Selection).
Aceasta este una dintre cele mai noi metode utilizate în lume, dar implementarea markerilor
moleculari în programele de ameliorare este încetinită de munca necesară pentru extragerea ADN.
Selecţia asistata de markerii moleculari presupune utilizarea unui sistem bazat pe markeri
ADN care produce profilele unice de ADN sau „amprentele” genetice ale fiecărui cultivar. Se pot astfel
pune in evidenta bazele moleculare ale rezistentei soiei la seceta, boli, dăunători sau alţi factori de
stress. Se pot calcula distantele genetice dintre diverse soiuri si linii, protejandu-se dreptul de
proprietate al creatorilor si evitându-se posibilitatea de a se introduce in cultura soiuri cu o baza
genetica identica.

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 1/15
 In aceasta idee, obiectivul grantului nostru a fost implementarea metodelor biologiei
moleculare la soia, folosind ca material initial linii de soia obtinute de colectivul nostru si ca forta de
munca studenti si cadre didactice tinere. Pentru ca universitatile noastre sa se poata integra in
cercetarea stiintifica mondiala este necesara crearea unor laboratoare de biologie moleculara
operationale, unde studentii sa poata cunoaste cele mai noi metode de lucru in ameliorarea plantelor.
Dar in acelasi timp este imperativ necesar ca studentii sa poata studia si lucra ei insisi in campul
experimental, intr-o legatura directa cu planta si cu metodele de ameliorare; selectia asistata de
markeri presupune fara indoiala existenta unui camp experimental, unde se obtin prin metodele
clasice linii noi de soia, studiate si analizate apoi la nivel molecular cu ajutorul markerilor deja
cunoscuti sau a unora nou creati. Anii ’90 au reprezentat o perioada exploziva pentru biologia
moleculara si, in special, pentru cercetarile privind manipularea genetica, astfel incit pe piata
americana mai intii, apoi si pe cea europeana, au aparut primele plante transgenice. Utilizarea
tehnicilor moleculare nu inseamna insa renuntarea la tehnicile clasice de ameliorare, chiar dimpotriva,
cercetatorii trebuie sa fie constienti ca fara existenta campului experimental, fara observatiile care se
fac in timpul perioadei de vegetatie si apoi la recoltat, este practic imposibila realizarea corelatiilor
dintre rezultatele obtinute in laboratoarele de biologie moleculara si materialul utilizat.
Metodele moleculare, aşa cum sunt ele prezentate în manualele de biochimie nu au aceeaşi
semnificaţie, nici aceeaşi utilizare ca în domeniul resurselor genetice şi ameliorării plantelor. Pentru un
biochimist electroforeza proteinelor este o metodă de separare pentru a repera anumite proteine
cărora se încearcă imediat să li se facă o caracterizare: greutate moleculară, structură, proprietăţi
funcţionale, eventual secvenţa de aminoacizi. La fel, utilizarea enzimelor de restricţe pentru digestia
acizilor nucleici este destinată analizei complete a unui fragment de ADN clonat, bine determinat, sau
preparării clonării şi purificării.
În genetica populaţiilor, folosirea acestor metode este aparent mai puţin ambiţioasă: este
vorba de a se repera diferenţe ereditare între indivizi. Simpla punere în evidenţă a unei diferenţe,
demonstrarea polimorfismului genetic, este un scop în sine. În ciuda modestiei acestui obiectiv,
geneticianul întâlneşte dificultăţi pe care biochimistul le-a depăşit: modicitatea cantitativă a extrasului
de plecare (uneori este vorba despre un grăuncior de polen căruia dorim să îi aflăm genotipul),
demonstrarea stabilităţii ereditare a caracteristicii observate (studiul mendelian) pentru a arăta, de
exemplu, că două benzi de izozime nu diferă decât prin mici modificări, sau că, în spatele unei singure
diferenţe prezenţă/absenţă a unei izozime migrând la un nivel dat, intervin mai multe gene. Altfel spus,
problemele de interpretare sunt cu totul noi în raport cu cele ale biochimistului.
Biologia moleculară cunoaşte în momentul actual o evoluţie foarte rapidă şi consecinţele
pentru practica resurselor genetice şi difuzarea din ce în ce mai larga a acestui mijloc de analiză
impun o cunoaştere temeinică a acestei metode, a cărei actualitate imediată o justifică pe deplin.
Câteva utilizări ale markerilor sunt enumerate în continuare:
i) posibilitatea de a defini în mod eficient, într-o descendenţă, starea alelică a unui locus al cărui studiu
presupune observarea plantelor care trebuie eliminate (sterilitate masculă genică: trebuie eliminate
plantele fertile înainte ca ele să antreneze polenizări) sau analiza unei plante dintr-un genotip unic într-
o segregare, al cărui comportament dorim să îl studiem (găsirea sistemului genic de insensibilitate la

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 2/15
fotoperioadă pentru controlul înfloririi) sau a cărei alelă cercetată este recesivă şi nu poate fi observată
direct în fenotip (genele nanismului pe care dorim să le conservăm printr-un lanţ de retroîncrucişări în
care părintele recurent este purtător al alelei dominante pentru talia normală);
ii) analiza alogamiei şi, în general, a schimburilor genice între populaţiile vecine (cazul purităţii
porumbului hibrid realizat în parcele izolate, în principiu, de culturile vecine). Este de ajuns să se
dispună de una sau mai multe gene marker a căror stare alelică nu poate proveni decât de la donorii
de polen exteriori şi de a găsi frecvenţa acestor alele în populaţiile de boabe produse de planta căreia
dorim să îi analizăm procentul de alogamie sau la varietăţile cărora dorim să le garantăm puritatea;
iii) pentru speciile a căror producţie de seminţe poate rezulta fie din apomixie, fie dintr-un proces
sexuat normal, studiul heterogenităţii descendenţei cu ajutorul câtorva markeri enzimatici permite
aflarea sursei de omogenitate: o clonă apomictică sau o segregare produsă pe cale sexuată;
iv) in cadrul schemelor de selecţie care utilizează retroîncrucişări pentru a integra starea alelică a unei
anumite gene într-un genotip dat (părintele recurent), fiecare retroîncrucişare diminuează jumătate din
genomul încă heterozigot. Dacă se dispune de mai mulţi markeri, dispersaţi în mai multe puncte ale
genomului, se poate accelera procesul de izogenizare prin alegerea dintre plantele obţinute din
retroîncrucişare – dintre cele care conţin alela donorului pentru caracterul selecţionat (de exemplu,
rezistenţa verticală la un parazit pe care l-am inoculat) – pe acelea care sunt deja homozigote pentru
starea alelică a părintelui recurent;
v) pentru protecţia comercială a liniilor nou obţinute şi introduse în circuitul producătorilor sau pentru a
verifica dacă acestea sunt originale, markerii enzimatici constituie elemente excelente pentru
constituirea fişei unui soi sau linie.
Evidenţierea diversităţii genetice permite alegerea corectă şi rapidă a încrucişărilor pentru
care se încearcă punerea în evidenţă a efectelor reciproce şi găsirea în descendenţă a eventualelor
caracteristici cu ereditate maternă (sterilitatea masculă citoplasmatică, de exmplu).
Studiul distanţelor genetice între populaţiile unei colecţii poate permite descoperirea vigorii
hibride prin încrucişarea unor forme îndepărtate, ştiind că un heterozis important este adesea asociat
cu bogăţia alelică a hibrizilor.
Punerea în evidenţă a organizării diferite la nivelul cromozomilor, în special prin studiul
hibridărilor in situ cu sonde de cADN (ADN complementar) marcate, permite să se prevadă anumite
sterilităţi (mici inversii, translocaţii) legate de diferenţierile structurale ale genomului şi deci să se
orienteze programul de selecţie în direcţia eliminării combinaţiilor defectuoase prin restituirea
homozigoţiei structurale - programe de poliploidizare sau de creare a liniilor de adiţie sau de
substituţie.

MATERIAL SI METODE
Materialul utilizat în cercetările noastre este reprezentat de linii de soia reţinute din câmpul de
selecţie, din descendenţa obţinută în urma hibridărilor efectuate în perioada 1995-1996. Liniile
valoroase obţinute din câmpul de selecţie au fost studiate amănunţit, mai ales din punctul de vedere al
capacităţii de producţie şi al însuşirilor de calitate şi tehnologice, dar şi în ceea ce priveşte unele
caracteristici morfologice care ar putea influenţa creşterea randamentului fotosintezei.

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 3/15
 În scopul de a identifica diferenţele morfologice între descendenţe, s-au făcut în câmp
următoarele observaţii: culoarea hilului, a hipocotilului, a perisorilor si a florii, lungimea peţiolului,
înălţimea de inserţie a primei păstăi.
Pentru a putea aplica metodele biologiei moleculare în laboratorul nostru, s-a făcut o
documentare amănunţită în ceea ce priveşte metodele folosite pentru extragerea ADN, atât la noi în
ţară, cât, îndeosebi, în străinătate. Dacă, iniţial, toate laboratoarele foloseau metoda propusă de
Dellaporta (1982), în prezent majoritatea laboratoarelor încearcă să simplifice pe cât posibil această
lucrare, astfel încât să fie eliminate diferite etape, ca utilizarea azotului lichid sau incubarea la 65ºC,
sau folosirea unei cantităţi foarte mici din organele plantei, pentru a elimina sacrificarea acesteia în
vederea recoltării ţesutului necesar pentru analiză. Aplicarea acestei metode şi în laboratorul nostru a
permis obţinerea unor profile interesante, dar şi realizarea unor observaţii privind aplicarea metodei
concret la materialul nostru. De asemenea, a fost posibil studiul comparativ al rezultatelor obţinute în
urma analizei moleculare cu rezultatele obţinute în câmpul experimental.
Extracţia şi purificarea acizilor nucleici este primul pas în studiile de biologie moleculară, în
toate tehnicile ADN-ului recombinant. Obiectivul nostru a fost acela de a obţine acizi nucleici purificaţi
din surse diferite, cu scopul de a folosi acest ADN în analizele cu ajutorul Polymerase Chain Reaction
(PCR). Calitatea şi puritatea acizilor nucleici reprezintă unii dintre cei mai critici factori pentru analiza
PCR. În scopul de a obţine acid nucleic pur , fără nici un fel de contaminant inhibitor, se folosesc
diferite metode, corespunzător laboratorului în care se realizează extracţia. Posibilii contaminanţi, care
pot inhiba realizarea unei analize PCR corectă, sunt listaţi în tabelul următor:
Inhibitor Concentraţia în care devin
inhibitoare
SDS > 0,005%
Fenoli >0,2%
Etanol > 1%
Isopropanol > 1%
Acetat de sodiu > 5 mM
Clorura de sodiu > 25 Mm
EDTA > 0,5 mM %
Hemoglobina > 1mg-ml
Heparina > 0,1 i.m-ml
Uree > 20 mM
Mixtura de reacţie > 15%

Deoarece există o mare varietate de metode pentru extracţia şi purificarea ADN, alegerea
celei mai potrivite dintre ele se bazează în general pe următoarele criterii:
 acidul nucleic analizat
 organismul sursă
 materialul de la care se pleacă (ţesut, frunze, seminţe)
 rezultatul dorit (cantitate, puritate, timpul disponibil pentru purificare)
 tehnica folosită ulterior pentru analiză (PCR, clonare, etichetare, blotting, RT-PCR, cADN,
sinteza de ADN etc).
Principiul unora dintre cele mai utilizate metode este următorul: extracţia acizilor nucleici din
materialul biologic necesită liza celulei, inactivarea nucleazelor celulare şi separarea acidului nucleic

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 4/15
dorit din amestecul celular. Adeseori, procedeul folosit pentru liza celulei este un compromis între
tehnici şi trebuie să fie suficient de puternic pentru a rupe ţesutul şi totuşi destul de delicat pentru a
păstra intact acidul nucleic. Procedura comună de liză include: ruperea mecanică (zdrobire, liza
hipotonică etc), tratamentul chimic (detergent, alţi agenţi etc), digestie enzimatică (proteinaze).
Ruperea membranei celulare şi inactivarea nucleazelor trebuie să fie combinate între ele. De exemplu,
o singură soluţie poate conţine detergenţi pentru solubilizarea membranei celulare şi săruri suficient
de puternice pentru a inactiva enzimele intracelulare. După realizarea lizei şi inactivarea nucleazelor,
materialul celular poate fi îndepărtat prin filtrare şi precipitare. Metodele de purificare a acizilor nucleici
din extractul celular sunt combinaţii între două sau mai multe dintre tehnicile: extracţie-precipitare,
cromatografie, centrifugare, separare.
Extracţie-precipitare. Pentru eliminarea contaminaţilor se folosesc solvenţi de extracţie. De
exemplu, o combinaţie între fenol şi cloroform este folosită frecvent pentru a îndepărta proteinele.
Precipitarea cu izopropanol sau etanol este folosită în general pentru a concentra acizii nucleici. Daca
este vorba de o cantitate scăzută de acizi nucleici, un purtător inert (cum ar glicogenul) poate fi
adăugată în mixtură pentru a creşte eficienţa precipitării. Alte metode de precipitare presupun o
precipitare selectivă, care se realizează prin folosirea unor concentraţii mari de săruri („salting out”)
sau precipitarea proteinelor folosind schimbările de pH.
Cromatografia. Metodele cromatografice utilizează diferite tehnici, cum ar fi filtrarea gelului,
schimbul de ioni, adsorbţia selectivă şi altele. Filtrarea gelului exploatează această proprietate
moleculară a particulelor de gel. O matrice cu o mărime a porilor definită permite moleculelor mici să
treacă prin pori prin difuziune, în timp ce moleculele mai mari sunt eliminate. Astfel, moleculele sunt
separate cu scopul de a descreşte greutatea moleculară. Schimbul de ioni cromatografic este o altă
tehnică ce utilizează interacţiunea electrostatică dintre o moleculă ţintă şi un grup funcţional din
coloană matrice. Acizii nucleici (încărcaţi negativ) pot fi eliminaţi prin schimbul de ioni cu o soluţie
buffer simplă. In cromatografia de adsorbţie, acizii nucleici adsorb selectiv în prezenţa anumitor săruri,
în timp ce alte molecule biologice nu adsorb. O soluţie buffer slabă sau chiar apă pot elimina acizii
nucleici, producând o probă care poate fu folosită direct in aplicaţie.
Centrifugarea. Centrifugarea selectivă este o metodă de purificare puternică. De exemplu,
centrifugarea in gradient de clorură de celsiu la forţe de gravitaţie înalte a fost folosită pentru
purificarea plasmidelor. Frecvent, centrifugarea este combinată cu o altă metodă. De exemplu,
cromatografia spin column, care combină filtrarea gelului cu centrifugarea, pentru a purifica ADN sau
ARN de contaminaţi mici (săruri, nucleotide). Aceeaşi procedură combină adsorbţia selectivă cu o
matrice cromatografică cu eliminarea prin centrifugare, în scopul purificării selective a unui tip de acid
nucleic.
Extracţia CTAB şi metoda de purificare. Protocolul CTAB (cetyltrimethylamonium bromide),
care a fost propus de Murray şi Thompson (1980) şi publicat apoi de Wagner şi colaboratorii (1987),
corespunde necesităţilor de a extrage şi purifica ADN din plante şi din alimente derivate din plante şi
este, în special potrivit pentru eliminarea polizaharidelor şi compuşilor fenolici, deşi afectează într-o
oarecare măsură puritatea şi deci calitatea ADN. Acest procedeu a fost intens aplicat in genetica
moleculară la palnte şi a fost testat pentru detecatrea OMG (Lipp, 1999, 2000). Au fost de asemenea

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 5/15
propuse câteva variante pentru a adapta metoda la un număr mai mare de plante şi produse (Hupfer,
1998; Hotzel, 1999); Meyer, 1997; Poms, 2001).
Reacţia PCR (Polymerase Chain Reaction). Reacţia PCR permite amplificarea selectivă a
unor fragmente specifice care apar cu o frecvenţă redusă în amestecul de ADN. În PCR sunt folosite
secvenţe complementare de ADN, numite primeri. Aceşti primeri sunt desemnaţi pentru a hibrida cu
anumite secvenţe din catena opusă a genei de interes, lucru care se realizează printr-o serie de cicluri
repetitive de denaturare şi replicare, cu ajutorul unor polimeraze ADN specifice, obţinându-se
amplificarea secvenţelor aflate între primeri. Aceste secvenţe amplificate sunt apoi supuse
electroforezei, astfel încât să poată fi detectate prezenţa şi mărimea lor.
Electroforeza în gel de agaroză. Este o metodă care separă macromoleculele pe baza mărimii
lor, încărcăturii electrice şi a altor proprietăţi fizice. Termenul de electroforeză descrie migrarea
particulelor încărcate sub influenţa unui câmp electric. Elementu principal al electroforezei este voltajul
aplicat electrozilor la cele două capete ale gelului. Proprietăţile moleculei determină cât de rapid poate
trece un curent electric prin mediu gelificat. Multe molecule importante (aminoacizi, peptide, proteine,
nucleotide şi acizi nucleici) posedă grupări ionizabile, şi, la un anumit pH, există în soluţie fie ca anioni
(-) fie ca şi cationi (+). Depinzând de natura încărcăturii, particulele pot migra fie la catod fie la anod.
Electroforeza în gel de agaroză este o metodă standard folosită pentru a separa, identifica şi purifica
fragmentele de ADN. Este o metodă simplă, rapidă, capabilă să separe fragmente de ADN care nu pot
fi separate prin alte metode. Mai mult, locaţia ADN în gel poate fi determinată prin colorarea cu o
concentraţie scăzută de bromură de etidiu.
Marker ADN. Pentru un anumit voltaj, un anumit gel şi o anumită concentraţie de soluţie buffer,
distanţa de migrare depinde de greutatea moleculară a materialului. Ca atare, un marker ADN cu o
greutate moleculară cunoscută poate fi introdus în gel pe ambele laterale ale gelului, în partea
dreaptă şi în partea stângă a materialului de studiat. Un marker conţine în general un număr definit de
segmente de ADN cunoscute, ceea ce face mai uşoară determinarea mărimii ADN-ului necunoscut,
dacă nu apar elemente care să deranjeze activitatea electroforetică.

Extracţia ADN
S-a făcut conform protocolului descris de Delaporta, cu unele modificări (protocol bazat pe
SDS) şi conform protocolului descris de Doyle&Doyle, bazat pe CTAB, cu unele modificări. După
părerea noastră, ambele protocoale trebuie optimizate pentru frunza de soia, deoarece nu la toate
probele s-a obţinut ADN corespunzător calitativ şi cantitativ.
Extracţia unui ADN curat a fost dificilă datorită, în principal, prezenţei unor compuşi metabolici
secundari şi carbohidraţi. Acidul nucleic a fost izolat din frunze uscate sau proaspete folosind
metodele menţionate. Aproximativ 300 mg de ţesut a fost mărunţit pe azot nitrogen, folosind PVP
(polivinilpolipirolidon) şi suspendat în 9 ml de bufer preîncălzit (100mMTris-Hcl pH=8.0, 1,4M NaCl,
20mM EDTA pH=8.0, 2% alkyltrimetilamonium bromide (CTAB), 0,2% b-mercaptoethanol).
Homogenatul a fost incubat la 65ºC pentru 90’, răcit şi emulsionat cu 4,5 ml diclormetan şi centrifugat
la 1.600g pentru 10 minute. Faza apoasă a fost transferată într-un tub nou de 15 ml şi emulsificată din
nou până când s-a obţinut o nouă fază apoasă . Aceasta a fost incubată timp de 1 oră la 37ºC cu 30

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 6/15
mg RNasa A. ADN-ul a fost precipitat prin adăugarea unui volum egal de isopropanol, uscat şi dizolvat
peste noapte în 1 ml bufer (EDTA 0,1 mM, acetat de amoniu 10 mM). Apoi a fost precipitat din nou prin
adăugarea unui volum de 1/20 din 5M acetat de sodiu şi 2,5 ml etanol 95%. După 10 minute a fost
centrifugat la 1.600 rotaţii, a fost spălat pentru 20 minute în 200 mM acetat de sodiu, etanol 76%,
uscat şi resuspendat în apă distilată.
Cuantificarea ADN
S-a făcut la fluorometrul Hoeffer, rezultatul fiind dat în mg/ml. Conform acestei concentraţii, s-
au făcut diluţiile.
Amplificarea ADN în PCR
Pregătirea amestecului de reacţie:
Pentru 1 probă:
12,8…………H2O
2,5………….10 x Buffer
2…………….2 mM dNTPs
2……………3 mM Primer
0,2…………Taq ADN polimeraza Stofel Fragment
2,5…………25 mM MgCl2
3……………ADN
Volum final 25 µl
Programul de amplificare:
95ºC - 2’
95ºC - 30 „
55ºC - 2’
72ºC – 30’
72ºC – 7’
4ºC
Termocyclerul utilizat este M.J.Research.

Primerii folosiţi în prima etapă au fost decameri (zece baze azotate) şi au următoarele
secvenţe nucleotidice:
Denumire primeri Structura
119 ATTGGGCGAT
135 AAGCTGCGAG
147 GTGCGTCCTC
204 TTCGGGCCGT
272 AGCGGGCCAA
300 GGCTAGGGGG

Faza suplimentara s-a caracterizat prin utilizarea unor primeri cumpãrati de la UBC din
Canada. Markerii SSR au fost cumpãrati de la Mycrosynth, Elvetia.

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 7/15
Denumire primer Structura
UBC 839 TAT ATA TAT ATA TAT ARG
UBC 840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT
UBC 841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC
UBC 842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG
UBC 844 CTC TCT CTC TCT CTC TRC
UBC 846 CAC ACA CAC ACA CAC ART
UBC 847 CAC ACA CAC ACA CAC ARC
UBC 848 CAC ACA CAC ACA CAC ARG
UBC 849 GTG TGT GTG TGT GTG TYA
UBC 850 GTG TGT GTG TGT GTG TYC
UBC 860 TGT GTG TGT GTG TGT GRA
UBC 861 ACC ACC ACC ACC ACC ACC
UBC 862 AGC AGC AGC AGC AGC AGC
UBC 863 AGT AGT AGT AGT AGT AGT
UBC 866 CTC CTC CTC CTC CTC CTC
UBC 867 GGC GGC GGC GGC GGC GGC
UBC 868 GAA GAA GAA GAA GAA GAA

REZULTATE ŞI DISCUŢII
Studiul caracteristicilor genitorilor folosiţi la hibridare
Analiza genitorilor din punct de vedere morfologic si fiziologic a evidenţiat diferenţe
semnificative în ceea ce priveşte înãltimea medie a plantei: la SE-135 este de 110 cm, în timp ce la
celelalte linii este cuprinsã între 60 si 88 cm. Caracteristicile de productie variazã în limite foarte mici:
linia A-3 are o productie pe plantã de 26,93 g în timp ce linia H-7 are 24,36 g. Înãltimea de insertie a
primei pãstãi este aproximativ egalã la linia B-5 (10,8 cm) cu cea de la SE-135 (10,5 cm) (tabelul 1).

Tabelul 1. Descrierea liniilor folosite la încrucisare

Inãlt. Inãlt. Nr. mediu Nr. mediu Nr. mediu Nr. mediu Prod.
medie a de de pãstãi boabe / boabe în MMB medie /
Linia plantei insertie pãstãi seci/ plantã pãstaie (g) plantã
(cm) (cm) /plantã plantã
SE- 110 10,5 88,3 1,2 150 2,1 162,4 24,36
135
A-3 60 7,8 63,5 1,0 131,2 2,1 154,55 20,27
B-5 88 8,3 85,2 1,1 158 3,1 170,5 26,93
E-2 82 10,8 60,2 1,7 132,4 2,2 142,4 18,85
H-7 76 9,2 84,5 1,4 142,7 2,3 150,25 21,44
Tabelul 2. Caracteristicile plantelor din generaţia F1 in anul 2003
Parinte Parinte
F1
Caractere analizate matern patern
Culoare perisori cenusie maronie maronie
Forma frunzei lanceolatã ovalã ovalã
Culoare hil brunã negru negru
Perioada de vegetatie (zile) 97 120 140
Înãlt. medie a pantei (cm) 88,9 110 128
Înãlt. de insertie (cm) 8,7 10,5 10
Nr. mediu pãstãi/plantã 85,2 88,3 256
Nr. Mediu boabe / plantã 154,6 150 496

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 8/15
MMB (g) 170,5 162,4 154,2
Prod. de boabe / plantã (g) 26,9 24,36 76,48

Tabelul 3. Caracteristicile plantelor selectionate din generatia F2 in anul 2003

Numar Numar Tulpina Lungime Unghi de Forma Culoare Culoare
planta ramificatii petiol insertie foliole perisori hil
1 1 groasa fara mic lanceolata cenusii gri-alb
4 3 subtire scurt mare lanceolata maronii gri-inchis
6 6 groasa fara mic ovala albi maroniu
16 2 groasa fara mic ovala maronii maroniu
18 1 groasa fara mare ovala maronii gri-inchis
25 1 groasa fara mare ovala maronii maroniu
38 2 subtire normal mic lanceolata cenusii gri-alb
109 3 subtire scurt mic ovala cenusii gri-inchis
118 2 groasa scurt mare lanceolata maronii maroniu
131 2 groasa fara mare lanceolata maronii maroniu
136 2 groasa normal mare lanceolata cenusii gri-alb
148 2 subtire normal mic lanceolata cenusii gri-alb
150 2 groasa fara mare ovala maronii maroniu
169 3 subtire normal mic lanceolata cenusii maroniu
196 2 subtire normal mic lanceolata cenusii gri-inchis
208 2 subtire fara mare ovala cenusii maroniu
213 4 subtire fara mic lanceolata maronii gri-alb
222 3 subtire fara mic ovala cenusii gri-inchis
228 2 subtire normal mic lanceolata cenusi maronii
236 1 subtire normal mic lanceolata cenusii gri-alb
241 2 subtire fara mic lanceolata maronii maroniu
245 2 subtire fara mare ovala cenusii maroniu

Evaluarea amplificării
Au fost triati 18 primeri RAPD dintre care 17 au dat amplificare, dar nu de aceeasi intensitate.
Numãrul benzilor în profilele electroforetice a variat între 3 si 20 benzi pe profil. Au fost evaluati numai
primerii care au dat peste 12 benzi de amplificare pe profil electroforetic, deoarece se presupune cã
fiecare bandã corespunde unei gene si prin urmare estimarea polimorfismului se poate aprecia pentru
cel putin 12 loci.
Etapele finale au fost:
- Electroforeza în gel de agaroză 1,5% (Tampon TBE 0,5 x 180V 2h30’);
- Colorarea gelului cu BET 10 mg/ml (bromura de etidiu)
- Fotografierea LA Combina Bioprint în lumină UV.
În urma analizei moleculare, s-a pus în evidenţă polimorfism, dar şi similaritate genetică,
potenţiali markeri genetici legaţi de anumite caracteristici morfologice. Utilizarea primerilor este
uşoară, dar şi complicată. Se poate obţine polimorfism numai dacă există diferenţe între cultivare şi
numai dacă acestea pot fi puse în evidenţă utilizând o anumită secvenţe de gene, ca primeri. În
momentul în care acesta apare însă, lucrurile se simplifică, deoarece liniile studiate se diferenţiază
prin prezenţa/absenţa unor benzi, situate la anumite distanţe, măsurate în perechile de baze ale
martorului de greutate moleculară (în cazul nostru, prima bandă mare este la 123 perechi de baze).
Unele benzi au fost foarte consistente, acestea putand fi folosite la generarea markerilor
SCAR, care ar putea permite o evaluare mai buna a polimorfismului liniilor. Acestia se obtin cu

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 9/15
extinderea fragmentului din primerul initial (10 perechi de baze) la 19-20 perechi de baze, ceea ce
mareste sansa amplificarii ADN la un numar mai mare de loci (figura nr. 2).
Desi markerii RAPD sunt dominanti si nu furnizeaza suficiente informatii privind polimorfismul
la nivel de AND, optimizarea reactiei PCR ne-a permis evidentierea unui numar mare de benzi (figura
nr. 3), intre 12 si 15 benzi, fiecare banda reprezentand polimorfismul la un sigur locus.
O importanta deosebita in reactia de amplificare PCR o are matrita de ADN, care a necesitat
obtinerea unui ADN de calitate si realizarea unor dilutii potrivite, dilutii care au fost realizate pe baza
cuantificarii cu ajutorul fluorometrului. Rezultatele obtinute au aratat ca la concentratii prea mici sau
prea mari de ADN reactia de amplificare esueaza, chiar daca primerul a avut o puternica capacitate de
atasare ( exemplu, UBC 204) (figura nr. 4).
In concluzie, desi markerii UBC din setul 800 sunt speciali, faptul ca pot fi utilizati la diferite
specii le demonstreaza universalitatea. Din punctul nostru de vedere, se pare ca nu sunt cei mai
recomandati pentru analiza genomului de soia.

Markerii SSR
Analiza microsatelitilor este bazatã pe reactia de amplificare în lant a ADN polimerazei, PCR
(PCR= Polymerase Chain Reaction). La plante, s-a demonstrat cã microsatelitii sunt informativi si
detecteazã un numãr mare de alele localizate pe diferiti cromosomi si pe diferite brate ale
cromosomilor. Mãrimea alelelor observate variazã intre limite destul de largi, de exemplu 129- 149, si
sepresupune cã numãrul repetitiilor varioazã adesea între 13 si 23. Deoarece ei sunt markeri de tip
multialelic, microsatelitii au un mare potential pentru utilizare în studii asupra evolutiei plantelor si în
studii cu privire la relatiile genetice dintre specii.
Markerii SSR se deosebesc de cei RAPD prin aceea cã la amplificarea ADN se utilizeazã
primeri specifici, la care se cunoaste structura si banda care este amplificatã. Adesea acesti primeri se
marcheazã fluorescent si este posibil sã se facã amplificarea simultanã cu mai multi primeri. De
asemenea programul de amplificare este diferit, cu temperatura de atasare (anealing) diferitã, în
functie de structura fiecãrui primer.
In privinta utilizãrii tehnologiei markerilor SSR în analiza genomicã a liniilor de soia studiate,
aceasta s-a efectuat conform metodelor clasice utilizate în majoritatea laboratoarelor de profil, cu
unele modificãri care au fost optimizate în laboratorul nostru.
Amestecul de reactie pentru amplificarea ADN a cuprins 2,5 l 10x tamponul enzimei, 2,5l
nucleotidele, 2,5l de fiecare primer SSR (forgoing si revers), 0,2l ADN Taq polimerazã (Stofel
Fragment), 2,5l MgCl2 si 2l de ADN pentru fiecare probã, la un volum final de 25l.
In privinţa programului de amplificare în PCR acesta a consstat în : 95C denaturare initialã
timp de 3 minute, 10 cicluri de alternanta de temperaturi de 95C-30 secunde, 63C 30 secunde si
72C 45 secunde, 30 cicluri de alternata temperaturilor de 94C 30 secunde, 53C- 30 secunde si
72C- 45 secunde, apoi 5 minute la 72C pentru extensia finalã.
Primerii specifici utilizati având perechea foregoing si reverse pentru ambele capete ale
catenei de ADN 5’ si 3’ au fost aplicati la toate genotipurile. Primerul SATT 9 a fost identificat ín baza
de date disponibilã pe Internet pentru genomul de soia. Sintetizarea primerului respectiv a fost

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 10/15
efectuatã de compania Microsynth din Elvetia care este specializatã în sinteze de primeri, cu rezultate
recunoscute a fi foarte bune.
Nu toti primerii au diferentiat cele 10 genotipuri de soia. Singurul primer SATT 9 (F- ATT
ACT AGA GAA ATT AGT TA si R- CTT ACT AGC GTA TTA ACC CTT) a evidentiat polimorfismul liniilor
analizate, si anume liniile R1 si R9 nu au banda de 100 perechi baze, fatã de celelalte linii R la care
aeste prezentã. (Figura 5).

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 11/15
Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 12/15
Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 13/15
Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 14/15
Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 15/15