REFERINTE BIOMIMETICE IN

PROIECTAREA SUBSTITUENTILOR
TISULARI
INTRODUCERE

Biomimetica (biomimeză, biognoză, bionică) reprezintă beneficiul tehnologic obiţinut

prin actul de a “împrumuta” sau de a “fura” idei de la natură.Datorită faptului că mulţi cercetători

şi tehnologi caută să afle răspunsurile la enigmele corpurilor animalelor şi plantelor pentru a se

putea inspira în creaţie, să realizeze noi materiale şi structuri, a apărut disciplina de bio-

mimetică. Astfel, unii studiază căile metabolice de formare a compuşilor chimici naturali, pentru

a putea crea o legătură între o următoare invenţie şi originea acesteia. Alţi cercetători imită

porozitatea oaselor, adezivii moluşte-lor etc.

Studiile biomimetice au menirea de a clarifica de ce performanţele mate-rialelor naturale sunt

semnificativ superioare acelora făcute de mâna omului (compozitele sintetice) sau care dintre

componentele naturale sunt responsa-bile de anumite proprietăţi sau caracteristici.

Biomimetica este o ştiinţă care investighează structurile biologice şi pro-cesele, pentru a le folosi

drept modele în dezvoltarea unor sisteme artificiale. Descoperirile făcute în domeniul

biomimeticii au un potenţial considerabil în dezvoltarea unor materiale de înaltă performanţă, cu

un impact redus asupra mediului înconjurător .

Aceasta este graniţa dintre vechi şi nou, punctul de plecare în dezvoltarea unor ramuri noi

ale cunoaşterii aplicate. Domeniul materialelor biologice şi al sistemelor naturale este extensiv,

reprezentând o temă interdisciplinară care cuprinde ştiinţa biomaterialelor,

biomecanica,bioingineria, ingineria cu aportul biologiei şi al medicinei.

 Termenul de „biomimetic” se referă la procesele, substanţele, dispoziti-vele, sistemele

făcute de către om şi care imită natura.

Arta şi ştiinţa de a desena, proiecta şi construi aparate biomimetice se numeşte

biomimetică şi însumează mai multe sfere de interes ştiinţific şi aplicativ dintre care:

nanotehnologii, protezare medico-chirurgicală şi indus-trie medicală (anticorpi şi substituenţi

universali de sânge nanorobotici, orga-ne artificiale, membre artificiale, diverse dispozitive

electronice etc.), roboti-că, inteligenţă artificială, industrie de apărare (aparate de vizionare în

diverse lungimi de undă, aparate de ascultat, amplificatoare de semnal, sisteme de navigare,

convertoare de date) etc.

J.Vincent a subliniat faptul că designul naturii are multe aplicaţii practice în diverse sectoare

ale activităţii umane. Velcro şi turnul Eiffel nu au nimic în comun în afară de faptul că designerii

ambelor s-au inspirat din

natur ă, aplicând principii biomimetice. Reţ eaua neuronală reprezintă un com-puter biomimetic

ipotetic care funcţioneză prin asocieri şi prezumţii în urma unei instruiri prealabile şi care poate

învăţa din proriile-i greş eli. Pe parcursul existenţei lor, atât plantele cât şi animalele au evoluat,

adică au supravieţuit, soluţionând probleme care ast ăzi, cu alte mijloace, încearcă să le rezolve

oamenii de ştiinţă. Plantele şi animalele au dat soluţii optime de design la probleme existenţiale.

Numeroasele structuri macromoleculare ş i supramoleculare din natură constituie tot

atâtea lecţii de ierarhie structurală şi eficienţă funcţională, exem-ple care sunt cercetate astăzi

spre definirea unor noi strategii biomimetice pentru obţinerea de biomateriale cu aplicaţii

medicale.

Legăturile chimiei cu ştiinţ ele vieţii (biologie, medicină, ş tiin ţe agricole şi cele

derivate din acestea) sunt vechi şi bine cunoscute. Încă de la începutul secolului 20, mari chimişti
organicieni au fost preocupaţi de aspectele biologice ale chimiei, iar numeroase exemple

reprezentative în acest sens se găsesc în seria Premiilor Nobel legate de chimia naturii (Fig. 1.2.).

În 1907, laureatul Nobel Emil Fischer scria: „în prima sa tinereţe, chimia organică a

fost strâns conectată cu biologia”.

Biomimetica a fost recunoscută ca ştiinţă abia în anul 1917 de către D’Arcy Thompson,

un naturalist ş i matematician scoţian, care a aplicat mate-matica şi fizica în morfologie ş i a

comparat scheletul animalelor cu patru membre cu realizarea podurilor, concluzionând că

podurile nu sunt altceva decat „schelete bine plănuite”. A fost primul om de ştiinţă care a

integrat fizica şi matematica în zoologie şi morfologie.

Bionica reprezintă ştiinţa ce studiază sistemele biologice pentru a obţine cunoş tinţe

utile fiinţei umane. Din punct de vedere etimologic, cuvântul vine de la grecescul “bio” ce

înseamnă viaţa şi de la „nica”, despre care nu se cunoaşte cu precizie dacă se referă la ultimele

patru litere din cuvintele „tehnică” sau „electronică”.

Anul de naştere al bionicii este 1960. Bionica îşi asumă responsabilitatea istorică de a

înnoi produsele sale, prin învăţătura pe care noi, oamenii, o obţi-nem prin observarea naturii;

fără îndoială cea mai mare provocare este folosirea acestor noţiuni în producerea analogilor

cotidieni cu caracteristicile observate. Încălzirea globală şi schimbarea nedorită a mediului de

viaţă au dus la conştientizarea importanţei biomimeticii pentru a menţine ce ne-a mai rămas de

la natură.
 Ingineria tisulară este un domeniu multidisciplinar care include biologia, medicina şi

ingineria şi are ca scop promovarea calităţii vieţii umane prin restabilirea, menţinerea sau

ameliorarea funcţiei ţesuturilor sau organelor. Astfel, interesul pentru aplicarea ingineriei

tisulare în domeniul vindecării rănilor a apărut în anii nouăzeci ai secolului trecut. Termenul

de inginerie tisulară a fost introdus în 1987, în timpul unei reuniuni a National Science

Foundation. Este aplicarea principiilor și a metodelor de inginerie și științe ale vieții pentru

înțelegerea fundamentală a relațiilor structură- funcție în țesuturi de mamifere normale și

patologice. Se dorește, de asemenea și dezvoltarea substituenților biologici pentru a restabili,

menține sau îmbunătăți funcția țesutului. Ingineria tisulară poate fi considerată, în linii mari, o

tehnologie multidisciplinară utilizată pentru a atinge unobiectiv universal: acel de a crește și

de a extinde țesuturi in vitro de la celule donatoare ( sistemul „crește-ți singură”). Rata de

succes a ingineriei tisulare se bazează pe biomimetica structurii și a compoziției țesutului

inițial. Pentru a atinge acest obiectiv este necesară înțelegerea fundamentelor celulei și a

interacțiunilor în vivo celulă-celulă. De asemenea, este important să se înțeleagă

comportamentul liniilor celullare și a culturilor în vitro. O mare parte din aria cercetării se

concentrează pe utilizarea ingineriei tisulare în îngrijirea rănilor și regenerarea țesutlui

cutanat.

În furnizarea unui istoric al ingineriei tisulare este inevitabilă întoarcerea la elementele

de bază, începând cu anul 1665, când Hooke ( 1635 – 1703) a descoperit găuri mici în

secțiuni transversale, pe care le-a denumit celule. Acesta le-a descris pe larg în cartea sa „

Micrografia”. În 1805, Oken a declarat: „Viața este bazată pe celule individuale!”.

 Între anii 1838 – 1839, Schleiden și Schwann au formulat teoria celulei, bazată pe

descoperirile lor microscpice. Această teorie a sintetizat constatările lor la următoarele

fundamente:

1. Celula este unitatea sructurală, fiziologică și de organizare a materiei vie.

2. Celula păstrează o existență duală ca o entitate distinctă și o „clădire construită” în

structura unui organism.

3. În mod liber, celulele se formează similar cu formarea cristalelor, adică se generează

spontan.

În 1858, Virchow (1821- 1902) a descris ideile sale cu privire la formarea de celule,

astfel: omnis cellula e cellula. Astfel, el sugerează faptul ca celulele apar din celule pre-

existente, confruntând teoriile de celule generate în mod spontan ale lui Schleiden şi

Schwann. Virchow a prezentat ideile lui despre regenerare celulară care să ateste că

regenerarea celulelor este despendentă de profilerarea acestora. Acest lucru a condus atenţia

cercetării către nivele celulare mai fundamentale. Thiersch a încercat să crească celulele pielii

în răni care începeau să se vindece. Făcând acest lucru, el a descoperit influenţa importantă a

ţesutului care începe să se vindece asupra procesului de vindecare a rănilor.

Loeb a fost primul care a expus ideea de creştere a celulelor în afara corpului uman,

în 1897. Din acel moment mulţi cercetători au experimentat această idee de creştere a

celulelor în vitro. S-a realizat experimentarea pe diferite medii cu cultură, s-a obținut o rată de

supraviețuire, dar nicio creștere a celulelor. Harrison (1870 – 1959) a fost primul care a

crescut celule ectodermale de broască în vitro, în anul 1907, dezvoltâ,d astfel prima linie de

cultură a țesutului neuronal. Acest lucru a fost urmat în 1912 de Carrel, care a putut realiza

creșterea unor embrioni de pui pe diferite medii de cultură, pe care inițial i-a menținut timp de

85 de zile și ulterior ani de zile. Mai târziu, interesul s-a canalizat în creșterea celulelor, în

locul creșterii unui țesut complet. În 1916, Rous și Jones au descoperit că tripsina este
capabilă să degradeze proteinele matricei, ducând astfel la separarea celulelor. Tendințele s-au

schimbat către extinderea tipurilor de celule de-a lungul anilor 1940 și la scurt timp după, s-au

realizat multe cercetări, ceea ce a dus la abilitatea de a crește în vitro linii de celule specifice

țesutului. Enders a contribuit cu succes la utilizarea celulelor embrionare umane în 1952. În

1998, dezvoltarea de linii de celule stem a format baza ingineriei tisulare moderne. Cercetarea

până în 1998 s-a concentrat pe identificarea capacităților diferențiale ale celulelor stem

embrionare și adulte. În afară de aceasta, cercetarea se concentrează pe problemele asociate cu

expansiunea celulellor autologe și alogene, că este nevoie de un număr mare de celule pentru

a genera un volum mic de țesut. Mai mult decât atât, cercetarea fundamentală este efectuată

în permanență pentru a obține o perspectivă asupra interacțiunilor celulare, domeniu de mare

importanță pentru ingineria tisulară.

În ingineria tisulară există patru componente esențiale: celule ( de exemplu, celule

stem), o matrice ( sau un schelet), un bioreactor și citokine. În practica inginerie tisulare un

schelet se încorporează cu celule vii și citokine reglementate specific și este plasat într-un

bioreactor. În mod ideal, este creat un micromediu biochimic și biomecanic adecvat, iar

multiplicare acelulelor umple schela cu țesut , ceea ce permite celulelor să crească în forma

dorită și mai ales corectă. Când se implantează în interiorul organismului uman, schela

însămânțată se integrează, asigurându-se susținerea și dirijarea proliferării celulare. Pe măsură

ce celulele proliferează, scheletul se biodegradează lent, permițând treptat vaselor de sânge și

citokinele-gazdă să facă contact cu celulele. Prin acest proces, schela se biodegradează în

continuare,în timp ce celulele proliferează în țesutul dorit. În cele din urmă schela se dizolvă

complet, iar țesutul format începe funcționeze în noul său mediu înconjurător.
Tipuri de celule-celulele stem

Deoarece fiecare țesut este format dintr-o varietate de tipuri de celule, este de dorit

să se utilizeze celule progenitoare comune, care au capacitatea embrionară de a se diferenția

în mai multe tipuri de celule. Celulele pluripotente sunt cel mai adesea denumite celule stem.

Celula stem este definită ca o celula care, prin diviziune mitotică, produce două celule ce au

capacitatea de a rămâne în stadiul de celulă stem (păstrând caracterul nediferențiat) sau de a se

diferenția în urma unor diviziuni succesive.

În acest fel, celula stem se poate divide fie simetric, caz în care rezultă două noi

celule stem sau doua celule diferențiate, fie asimetric, rezultând o celulă stem și o celula

diferențiată. Capacitatea celulei stem de a da naștere unei celule identice se numește auto-

înnoire (self-renewal în limba engleza), iar cea de a da naștere altor tipuri de celule se

numeste diferențiere.

Metodele de izolare și cultivare a celulelor stem au fost descoperite în 1998, lucru ce

a adus o nouă speranță cercetătorilor și medicilor din întreaga lume, iar în 2007, cercetătorii

Mario R. Capecchi, Sir Martin J. Evans și Oliver Smithies au primit Premiul Nobel pentru

Medicină și Fiziologie pentru „descoperirea principiilor de introducere a unor modificari

genetice specifice prin utilizarea celulelor sușă embrionare”.

Celulele stem pot trata boli precum Alzheimer, atrofii musculare, leucemii, cancere

și multe alte boli, iar cercetătorii studiază în prezet tratamentul cu celule stem în bolile

moștenite.

Organismul uman este format din peste 200 de tipuri de celule diferite, toate

provenind dintr-o singură categorie de celule: celulele stem. În viața intrauterină, celulele

stem sunt responsabile de formarea și dezvoltarea fatului, iar după nastere, de reînnoirea și de

repararea țesuturilor și organelor.Celulele stem hematopoietice (formatoare ale celulelor din

sânge), reprezintă prima categorie identificată de celule stem adulte și a cărei utilizare în scop

terapeutic, este dovedită și unanim acceptată.

În prezent, există trei surse disponibile de celule stem hematopoietice, pentru

obținerea unei grefe de transplant: măduva osoasă, sângele periferic și sângele placentar.

Dintre acestea, sângele placentar este cea mai facila sursă pentru obținerea unei grefe de

celule stem hematopoietice, fără a implica niciun risc pentru mamă sau nou născut. Celulele

stem din sângele placentar au particularitatea că sunt mai tinere comparativ cu celulele din

măduva osoasă sau sângele periferic, aceasta însemnând o capacitate mai mare de multiplicare

și o toleranță mai crescută a pacientului primitor.

Mai mult decât atât, în ceea ce privește potențialii înlocuitori de piele, studii recente

au aratat că celulele stem adulte epidermice au o plasticitate mai mare decât era de așteptat

inițial. Într-un model animal, celulele stem epidermice adulte au fost capabile să se

diferențieze în diferite tipuri de celule funcționale. Un avantaj suplimentar al celulelor stem

adulte (și în special epiteliale) este ușurința de colectare din organisme.

Matricea extracelulară și schela - scaffolds

Este necesară o matrice sau o cultură, pentru a facilita creșterea celulară. În vivo,

celulele sunt aranjate în matricea extracelulară (MEC) ceea ce formează o entitate

înconjurătoare structurală complexă și cu rol de sprijinire a celulei. Matricea extracelulară

este necesară pentru ca anumite celule să-și îndeplinească funcțiile. Matricea extracelulară are

trei componente majore: proteine structurale ( în special colagen), proteoglicani și hialuronan

și proteine specializate multiadezive. Fiecare țesut conține tipul său de matrice extracelulară,

specializat pentru funcția lui particulară. Cantitatea de componente specifice variază în

concordanță cu funcția țesutului. Ca urmare a spațiului mic disponibil extracelular, în

epidermă celulele sunt strâns legate de lamina bazală, care este o matrice subțire suprapusă

țesutului conjuctiv lax.

Proteoglicanii sunt macromolecule care constau dintr-o proteină de bază legată de

mai multe polizaharide (glicozaminoglicani). Proteoglicanii sunt capabili de a lega celulele la

matrice și de a leaga factorii de creștere (de exemplu, factorul de creștere a fibroblastelor

[FGF], factorul transformator de creștere beta [TGF-β] la glicozaminoglicanilor, prevenind

astfel degradarea proteazei extracelulare a factorilor de creștere.

Organizarea tuturor componentelor matricei extracelulare depinde de prezența

proteinelor de legare în matrice. Fibronectinele sunt o altă clasă de proteine ale matricei, care

se pot lega la integrine și joacă un rol important în atașarea celulelor la matricea

extracelulară.

În ingineria tisulară, multe cercetări se concentrează pe dezvoltarea de matrici

artificiale sau schele. Schelele poate fi permanente sau temporare în funcție de aplicație.

Schelele permanente nu sunt biodegradabile și rămân încorporate în organism. Aceste schele

sunt necesare în situații în care este nevoie de forță continuă pentru a permite țesutului să-și

păstreze forma. Astăzi, cea mai mare parte a schelelor temporare și biodegradabile sunt

folosite ultimele, lăsând doar țesutul proiectat în situ.

Cercetările au arătat că asocierea colagenului și a acidului hialuronic în schele, în

plus față de utilizarea matricelor doar de acid hialuronic, a avut succes în ingineria tisulară a

cartilajului și în regenerarea țesutului dermic.

Bioreactorul

Un bioreactor poate fi definit ca un aparat care imită și reproduce condițiile

fiziologice, cu scopul de a menține și de a susține cultura celulară pentru regenerarea tisulară.

Parametrii culturilor celulare, cum ar fi temperatura, pH-ul, gradienți biochimici și solicitările

mecanice trebuie să fie controlate în mod continuu în timpul perioadei de maturare.

Bioreactoare au îmbunătățit deja prelucrarea și rezultatele finale ale regenerării

pielii. Este esențial ca bioreactoare să fie proiectate și fabricate urmând specificații care diferă

de la țesut la țesut.

Citokinele

Citokinele constituie un ansamblu foarte heterogen de molecule (aproximativ 100 de

tipuri), cu greutatea moleculară între 15 şi 30 kDa, de natură glicoproteică sau proteică.

Acestea sunt secretate de o celulă şi se leagă de receptori membranali specifici, de mare

afinitate, prezenţi fie pe suprafaţa altei celule, fie chiar pe celula care le-a secretat. Ele sunt

recunoscute ca mediatori ai imunităţii, inflamaţiei, proliferării şi diferenţierii unor linii

celulare.

Aceste polipeptide există, de obicei, ca precursori inactivi care trebuie să fie scindați

și legați la matricea extracelulară ca să devină activi. Prin legarea receptorilor citokinelor se

poate exercita o cascadă a transducția semnalului prin intermediul mesagerilor secundari, ceea

ce conduce la modificări în expresia genelor care mediază răspunsurile celulare specifice.

Răspunsurile legării unei citokine pot include modificarea expresiei proteinelor membranare,

secreția de molecule efectoare și proliferare.

 Citokinele nu sunt celule specifice. O singură citokină poate acționa pe mai multe

tipuri de celul, așa cum mai multe tipuri de celule diferite pot secreta aceeași citokina, în

ciuda răspunsurilor dintre diferitele tipuri de celule.

Factorul de creștere epidermică (EGF), factor de creștere a fibroblastelor (FGF),

factorul de creștere derivat din trombocite (PDGF) și TGF-β sunt patru dintre cei mai

importanți factori de creștere în vindecarea rănilor. Factorul de creștere epidermică (EGF)

stimulează creșterea și migrarea keratinocitelor în vitro și regenerarea epidermică în vivo.

Factorul de creștere epidermică a fost deja aplicat la sistemele de livrare care duc la creșterea

nivelului de regenerare a epidermei în răni de grosime parțială și arsuri de gradul II. Odată

aplicat la un hidrogel, s-a observat vindecarea rănilor mult mai rapid.

Factorul de creștere a fibroblastelor (FGF) acționează pe fibroblaste. Dintre cei 20

de membri ai familiei FGF, FGF-β este cunoscut mai ales ca un stimulator puternic al

celulelor endoteliale, care induce angiogeneza. Derivat din trombocite, factorul de creștere

(PDGF), este de asemenea important în vindecarea rănilor, deoarece atrage diferite celule la

nivelul leziunii: fibroblaste, celule musculare netede, neutrofile și macrofage. Stimulează

secreția factorilor de creștere de către macrofage și produse de matrice, cum ar fi fibronectina,

hialuronan, colageni și proteoglicani. PDGF joacă un rol important în timpul fazei de

remodelare prin stimularea producerii fibroblastică de colagenaze. Recombinant, PDGF este

aplicat terapeutic pentru ulcere diabetice cronice, ameliorarea vindecării rănilor, etc.
Sinteza materialelor biomimetice

Un biomaterial biomimetic pentru ingineria tisulară poate fi orice material-schelă

care imită una sau mai multe caracteristici a unei matrici extracelulare naturale. Această

secțiune este destinată pentru a ilustra conceptul biomimeticii aplicat în mod intențional la

sinteza materialelor, folosind câteva exemple, dar nu enumerate toate aparținătoarele acestei

categorii.

Biodegradabilitatea este în general cerută pentru inginerie tisulară a materialelor

schelă, iar rata de degradare trebuie de asemenea să se potrivească cu țesutul neo-format

pentru a servi în mod ideal scopul. De exemplu, poliesteri alifatici liniari, cum ar fi poli (acid

lactic) (PLA), poli (acid glicolic) (PGA) și copolimerii acestora poli (acid lactic-co-glicolic)

(PLGA) sunt frecvent utilizați ca polimeri pentru fabricarea schelelor pentru că sunt

biodegradabili, și au un grad acceptat de biocompatibilitate. Prin comparație, poli (etilen

glicol) (PEG) nu prezintă biodegradabilitatea necesară, dar este un hidrogel biocompatibil

care are caracteristici mecanice pentru anumite țesuturi moi, cum ar fi cartilajele. O

modalitate de a depăși această deficiență este de a sintetiza copolimeri poli (etilen glicol) -

PEG cu poli (acid lactic) - PLA, poli (acid glicolic) - PGA sau poli (etilen glicol) – PLGA.

O altă modalitate de a conferi biodegradabilitatea, adică o cale biomimetică, este de

a sintetiza un biomaterial pe bază de PEG, de exemplu metaloproteazele matriciale – MMP.

Această abordare imită biodegrabilitatea enzimatică a colagenului și a altor componente ale

matricii extracelulare naturale.

Proprietăți mecanice biomimetice

Multe țesuturi cum ar fi mușchiul cardiac, valvele cardiace și sânge navele au

proprietăți elastomerice distincte. Pentru a obține proprietățile elastomerice necesare, au fost

evaluate diverse materiale elastomerice drept schele pentru a lucra aceste țesuturi. Poli (ɛ-

caprolactonă) (PCL) și poliuretanul (PU) sunt doi polimeri sintetici folosiți în plus față de

materialele derivate din matricea extracelulară naturală. PCL este un polimer semicristalin,

are o foarte mică temperatura de tranziție vitroasă (în jur de -62 ° C), și, astfel, este foarte

elastic, la temperatura camerei sau a corpului. Cu toate că PCL se degradează prin diverse

mecanisme sub condițiile fiziologice,rata de degradare este prea lentă, ceea îl face mai puțin

interesant. Poliuretanul (PU) permite variații structurale pentru a obține proprietăți

elastromerice. O limitare majoră a PU pentru aplicațiile biomedicale este implicarea în sinteză

a prescursorilor toxici, cum at fi toluen diizocianații. Astfel, au fost făcute progrese în

dezvoltarea poliuretanilor sau polimerilor pe bază de uretan, folosind diizocianați mai puțin

toxici. Acești polimeri au fost analizați pentru aplicații în ingineria țesutului vascular sau a

alor țesuturi.

Pe lângă utilizarea tehnologiilor polimerice existente pentru a realiza proprietăți

elastomerice necesare diferitelor țesuturi, există abordări biomimetice pentru a dezvolta

materiale elastomere. Elastina este un polimer insolubil, proteină a matricii extracelulare care

ajută numeroase țesuturi din organism, datorită proprietăților sale de extensibilitate și recul

elastic. Elastina este sintetizat al tropoelastinei (~ 70 kDa), un precursor solubil al elastinei

insolubile. Tropoelastina are o struictură repetabilă ce alternează între regiunile hidrofobice și

reticulare. Peptidele repetate ale derivaților topoelastinei și ai elastinei sunt capabile de auto

asamblare pentru a alcătui forme insolubile de agregate la o temperatură înaltă. Polipeptidele

artificiale sunt derivate din pentapeptida Val-Pro-Gly-Xaa-Gly (VPGXG) găsită în domeniul

hidrofob al tropoelastinei. Utilizând tehnologii de recombinare, Dan Urry a pornit cercetarea

privind polipeptidele elastină – ELP. Anumiți copolimeri elastinmimetici tribloc ( hidrofob-

hidrofil-hidrofob) au fost de asemenea dezvoltați pentru a se autoasambla în hidrogeluri

termoreversibile. ELP sunt schele promițătoare pentru anumite aplicații ale ingineriei tisulare.

Inspirat de proteinele naturale elastomerice, o proteină nonmecanică GB1 (imunoglobulina

streptococică B1) a fost recent proectată prin metode inginerești într-o poliproteină (GB1) 8 și

s-a dovedit că are proprietăți elastomerice excelente, lucru care ar putea face din acesta un

bun material candidat pentru schele ingineriei tisulare.

Pentru anumite țesuturi, cum ar fi tendoanele și ligamente, întinderea și modulul de

elasticitate și rezistență sunt factori deosebit de importanți. Mătasea din coconii viermilor de

mătase este un material natural compus din proteine fibroase care a fost utilizat mult timp

pentru producerea de textile și suturi chirurgicale, datorită proprietăților sale excelente de

tracțiune mecanică. Aceasta ar putea fi un material schelă excelent pentru ingineria tisulară a

tendoanelor și ligamentelor. În forma sa naturală, mătasea este compusă dintr-un miez cu

filamente proteice , fibroină de mătase și un înveliș adeziv format dintr-o familie de proteine

sericina. Există o serie de elemente îngrijorătoare asupra toxicității mătasei naturale. Sericina

din mătasea naturală s-a demonstrat că provoacă reacții imune adverse, ceea ce nu este

avantajos pentru aplicarea acesteia în ingineria tisulară. După îndepărtarea sericinei, mătasea

regenerată a oferit o biocompatibilitate îmbunătățită.

Abordări biomimetice pentru proiectarea substituenților tisulari

Dezvoltarea țesuturilor și remodelarea în organisme vii este orchestrată de cascade

de factori de reglementare care interacționează la mai multe niveluri, în spațiu și timp. Toate

modelele animale oferă cu siguranță fidelitate biologică (cel puțin în cadrul speciilor date),

dar, de asemenea oferă și un control limitat asupra mediul local și o potrivire în timp real
limitată. Prin comparație, cultura celulară tradițională oferă un control semnificativ asupra

mediului celular, împreună cu o perspectivă precisă asupra proceselor celulare, dar în

detrimentul unui context experimental în mare parte simplist 2D.

În ingineria tisulară, direcționarea celulelor pentru a se diferenția la momentul în

locul potrivit și în fenotipul corect necesită, de asemenea și un mediu propice care să ofere

aceleași factori care guvernează procesele celulare în vivo. Câmpul se mișcă departe de

"biologie plată" a monostraturilor de celule în favoarea mediilor de cultură 3D controlabile.

Cercetările se apropie de o nouă generație de sisteme de inginerie tisulară, care ar

reprezenta mediul autentic al celulei într-un organism viu, permițând totodată un control strict

asupra mediului celular și poate oferi în timp real o perspectivă asupra evenimentelor celulare

și morfogenice. Dat fiind aceste lucruri, o abordare biomimetică pentru formarea țesuturilor

prin inginerie tisulară direcționează asamblarea țesuturilor funcționale utilizând cerințele de

proiectare biologice.

Scaffold-uri pentru organizarea ghidării tisulare

Materiale de schelă-native sau sintetice, permanente sau biodegradabile - sunt

transformate în arhitecturi 3D potrivite pentru însămânțare și cultivare de celule. Materiale

sunt alese în funcție de necesitatea de a restabili semnalizarea celulară și pentru a se potrivi

comportamentului mecanic al țesutului care va fi proiectat. Scaffold-urile, de asemenea, pot

servi ca "șabloane informaționale" celulelor, prin punerea în aplicare a unor patente, legarea

de liganzi și eliberarea controlată a citokinelor. Fiecare țesut prezintă propriile sale provocări

pentru proiectarea de schele-scaffold uri și în continuare voi folosi țesuturile musculare

cardiace și osoase, ca exemple.

Țestulul muscular cardiac este un țesut dens de celule cuplate electromecanic care

transmit forța și deformarea în mai multe direcții. Acest tip de țesut necesită schele moi și
elastice. Exemple de astfel de schele includ hidrogeluri, schele elastomere însămânțate

secvențial cu fibroblaști și miocite care oferă un mediu de diferențiere celulară și de cuplare.

De asemenea, alinierea fibrelor scaffold-urilor a redus nivelurile factorului atrial natriuretic

(ANP), ceea ce indică o schimbare spre un fenotip celular mai matur.

Osul, un țesut care conține matrici dense mineralizate, ce poate rezista la impact și la

șoc puternic, necesită schele care să poată oferi un cadru de stabilitate mecanică și pori mari

interconectați pentru infiltrarea celulelor. Într-un studiu de specialitate, scaffold-uri de mătase

și fibroină au fost proiectate pentru a ghida diferențierea celulelor stem umane mezenchimale

(hMSCs) în rețele mineralizate trabeculare sau corticale. Într-un alt studiu, fragment osos

complet lipsit de celule a furnizat biomimetică în ceea ce privește topografia, compoziția și

proprietățile mecanice pentru diferențierea osteogenică a hMSCs.

Scaffold-urile proiectate și personalizate și-au găsit, de asemenea, utilitatea în

dezvoltarea de modele de țesut pentru screening-ul medicamentelor și studiile asupra

diferitelor boli. S-a demonstrat că un model 3D particular de tumoare biologică poate prezice

mai îndeaproape răspunsurile celulelor la agenții chimioterapeutici decât modelul tradițional

2D. Un studiu de laborator a arătat că decelularizarea țesutului cardiac intact poate produce o

matrice extracelulară bazată pe un șablon, care permite perfuzia, vascularizarea și

însămânțarea miocitelor ce conduc la exercitarea funcției de pompare ex vivo.

Creșterea celulară pe schele poate oferi astfel, noi perspective cu privire la răspunsurile

celulare asupra mediului lor înconjurător și regenerarea țesuturilor.

Controlarea nutrienților și a metaboliților din mediul înconjurător (în

bioreactoare)

Parametrul critic necesar pentru supraviețuirea celulară în țesuturile native și în cele

obținute cu ajutorul ingineriei tisulare este oxigenul (datorită solubilității scăzute în mediu de
plasmă și cultură celulară). În țesuturile native, oxigenul este furnizat de rețeaua vasculară, pe

distanțe de transport difuzional scurte și cu utilizarea hemoglobinei care crește conținutul

total de oxigen al sângelui. În abordările ingineriei tisulare convenționale, fragmentele de

țesut sunt doar imersate în mediul de cultură. Transportul difuzional de oxigen în aceste

condiții poate sprijini viabilitatea celulară doar cu ~100 μm în stratul exterior , în timp ce

construcția interioară rămâne lipsită de oxigen. Pentru a rezolva această problemă, întrega

construcție poate fi perfuzat cu mediu de cultură, pentru a furniza oxigen celulelor.

Oxigenarea are loc astfel, atât prin difuzie cât și prin convecție, la fel ca în țesuturile native.

Un grup de cercetători a utilizat inocularea cu celule pe bază de gel și o unitate

intercalată de flux de mediu de cultură prin schelele însămânțate, pentru a sprijini densitățile

fiziologice ridicate ale celulele de cultură. În acest sistem, celulele sunt "blocate" în scaffold,

o scurtă perioadă de gelificare (10 min) și alimentate cu oxigen, în toate momente din timpul

culturii. În timp ce rata medie de curgere a culturii crește, același lucru se întâmplă și cu rata

alimentării cu oxigen. În același timp, fluxul de forfecare crește de asemenea, lucru ce creează

o situații de bază non-fiziologică, ce poate fi în detrimentul celulei. Studiile recente folosind

cardiomiocite neonatale indică faptul că aplicarea interstițială a unui debit la forfecare crează

condiții de stres mai mari de 2,4 dyn / cm2, ceea ce a dus la activarea p38 și inițierea

apoptozei.

În țesutul cardiac nativ, cardiomiocitele sunt protejate de contactul direct cu sânge

de către celulele endoteliale. Pentru a imita rețeaua capilară, celulele au fost cultivate pe

scaffold-uri polimerice elastice foarte poroase cu o serie paralelă de canale. Pentru a imita

aprovizionarea cu oxigen de către hemoglobina, mediul de cultură a fost suplimentat cu o

emulsie de perfluorocarbon (PFC). Deoarece particulele de perfluorocarbon sunt nemiscibile

în faza apoasă a mediului de cultură, ele servesc drept rezervoare de oxigen reîncărcabile, un

mecanism de alimentare cu oxigen analog, mecanismului de hemoglobină în sânge. Această

combinație a permis creșterea unor milimetri de țesut cardiac gros, cu densitate fiziologică a

celulelor viabile care exprimă markeri cardiaci moleculari funcționali.

În vivo, schimbarea morfologiei 3D dă naștere unor stimuli mecanici distincți care

acționează sinergic cu factorii biologici pentru a reglementa dezvoltarea țesutului, maturarea

și remodelarea. Interacțiunea repetată între semnalele mecanice și sstructura organizatorică a

țesutului da rezultate în anumite relații structură-funcție specifice. De exemplu, proprietățile

mecanice anizotrope ale oaselor lungi sunt rezultate al structurii lamelare microscopice.

Dintr-o perspectivă de inginerie tisulară, supunerea țesuturilor imature de încărcare

fiziologică ar putea fi o modalitate de a dobândi caracteristicile structurale și funcționale

necesare. În cele mai multe cazuri, rămân încă multe lucruri de studiat despre natura exactă,

nivelurile și regimul de aplicare a semnale mecanice. Stimularea mecanică îmbunătățește, de

asemenea, transportul de substanțe nutritive la celule cu ajutorul constructelor prin inducerea

convecției. S-a dovedit că tensiunea de forfecare poate avea un efect anabolic asupra

osteoblastelor și de stimulare a exprimării genelor specifice țesutului osos o constatare care

oferit modele îmbunătățite de bioreactor. Descoperiri similare au condus la dezvoltarea de

bioreactoare avansate cu încarcare compresivă de condrocite încorporate în agaroză, pentru a

forma cartilaj și tensiune ciclică a cardiomiocitelor în colagen. Acest lucru ajută ingineria

tisulară la formarea de țesut cardiac. În special, utilizarea combinată a factorilor de creștere și

stimularea mecanică sinergetică a îmbunătățit proprietățile funcționale ale cartilagiului obținut

prin inginerie tisulară.

În ceea ce privește osul, este destul de dificil să se izoleze efectele forfecării, de cele

ale transferului de masă convectiv. Un studiu important a utilizat molecule de dextran pentru a

obține medii cu diferite vâscozități ,unde, prin urmare, să varieze nivelurile de forfecare, fără

a schimba ratele de transport a masei.

 Acestă abordare a permis o corelare între depunerea matricei și tensiunea de

forfecare, fără a afecta rata de proliferare a celulei și activitatea fosfatazei alcaline (AP) a

celulelor. În cazul mușchiului cardiac, un studiu clasic efectuat de laboratorul Zimmermann și

Eschenhagen a explorat rolul stresului mecanic asupra maturizării țesutului cardiac cu ajutorul

ingineriei tisulare. Aplicarea unei forțe de întindere dinamică la cardiomiocitele unor pui de

șobolan în geluri de colagen sub formă de inel pentru doar 7 zile, a determinat fascicule

musculare mature, o strcutură bine organizată, cuplare celulară și generare a forței.

Controlul contracțiilor inimii este aproape în întregime de sine stătător. Propagarea

semnalelor electrice de pe intersecții intracelulare specializate produce contracții mecanice

care pompează sângele înainte. Cuplarea sistematică între semnalele electrice și contracțiile

macroscopice este prin urmare esențială pentru funcționarea și dezvoltarea inimii.

Furnizarea de semnale electrice a fost, de asemenea de așteptat, să sporească

asamblarea țesuturilor cardiace, cu ajutorul ingineriei tisulare. Constructele cardiace au fost

supuse la un supraprag electric, semnalele concepute pentru a imita pe cele din țesutul nativ.

După numai 8 zile în vitro, electrostimularea a condus la alinierea și cuplarea celulară,

creșterea amplitudinii contracțiilor sincrone de 7 ori, și a avut drept rezultat o organizare

ultrastructurală remarcabilă. Dezvoltarea proprietățilelor conductoare și contractile ale

constructelor cardiace a fost concomitentă, cu dependență puternică de inițierea și durata

stimulării electrice aplicate.

Există două posibile mecanisme de stimulare electrică: prin gradienti electrice sau

prin inducerea electrică a contracției, dar studiile de specialitate precum și date din studiile 2D

o sugerează pe cea din urmă. Țesuturile proiectat cu aplicarea stimulării câmpului electric

se aseamănă în multe aspecte cu cele proiectate prin stimulare mecanică. Stimularea

eloectrică induce hiperpolarizarea la capătul anodic al celulei și depolarizarea la capătul

catodic al celulei, astfel încât celulele aliniate cu linii ale câmpului electric au fost supuse la
cea mai mare diferență de tensiune și au fost probabil primile care au generat acțiune, contract

și cuplu cu alte celule prin procese la capătul celulelor.

Microtehnologiile bazate pe ingineria tisulară devin instrumente puternice pentru a

manipula micromediu celular și pentru a studia răspunsurile celulare în timp real, cât și în

mod cantitativ. Scară mică permite studii de înaltă calitate, concepute pentru a evalua un

spațiu experimental mare, în timp ce se utilizează cantități mici de celule și materiale. Un

exemplu al acestei abordări este un bioreactor la scară micro cu douăsprezece godeuri de

cultură cu un format standard de diapozitiv pentru microscop, conceput pentru a găzdui două

setări de cultură: celule atașate la un substrat 2D și celulele încapsulate în hidrogel 3D.

Ambele formate permit perfuzarea controlată de lichid la celule, oferind un control strict al

compoziției medii și al forfecarării hidrodinamice la care celulele sunt expuse. Celulele stem

embrionare umane au fost cultivate într-un astfel de sistem și au fost evaluate pentru

potențialul lor de diferențiere cardiovasculară. Viabilitatea celulară a celulelor a fost în mare

măsură îmbunătățită prin perfuzare. O altă caracteristică atractivă a acestei tehnologii este

conformitatea sa cu formatele standard de formare a imaginii. Dat fiind faptul co

douăsprezece izvoare de cultură au fost create pe diapozitivul de sticlă, se pot folosi diferite

tipuri de microscopie pentru analiza imaginii.

Microtehnologia poate fi de asemenea utilizată pentru a genera țesuturi "organoide",

mici, dar funcționale pentru o varietate de aplicații. De exemplu, cardiomiocitele au fost

modelate pe un substrat pentru a produce organoide sincrone contractile care mimează

organizarea extrem de specifică a cardiomiocite în vivo. De-a lungul timpului, celulele se

cuplau funcțional una de alta pentru a crea fire de țesutului cardiac,ce bate în sincron, cu

dezvoltarea progresivă a funcției contractile și a expresiei markerilor de diferențiere cardiacă.

Astfel de organoide își pot găsi utilitatea în screening-ul de medicamente, studii

electrofiziologice și cercetarea biologică fundamentală.

 Ingineria tisulară a utilizat în mare măsură abordările "minimaliste", bazate pe

populațiile omogene de celule prevăzute cu condiții de mediu adecvate pentru a da naștere

unor rezultate practice specifice (de exemplu, scaffold-uri mineralizate sau țesuturi

contractile). Cu toate acestea, doar câteva tipuri de țesut sunt derivate din populațiile

unicelulare. Osul, de exemplu, este într-o stare constantă de flux, bazată pe interacțiunile

dintre osteocite, osteoblaste și osteoclaste. Atât țesutul osos cât și țesuturile cardiace sunt

foarte vascularizate, astfel încât tipurile de celule primare sunt în contact strâns legat cu alte

fenotipuri celulare. Crearea de țesuturi complexe formulează noi cerințe de design al

sistemelor în vitro. Acest lucruse referă la furnizarea multiplelor semnale de reglementare,

medierea interacțiunilor celulă-la-celulă și a procesele de luare a deciziilor în cadrul celulei,

precum și controlul spațial al diferențierii celulelor și formarea de țesut. Aceasta este zona în

care intrările din dezvoltarea biologică sunt cele mai valoroase și cele mai necesare.

Provocările cu care se confruntă biologii și inginerii nu sunt triviale, dar acest domeniu ar

putea avea nevoie de noi instrumente pentru reglementarea condițiilor de micro-mediu spre

formarea de țesuturi complexe.

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE:

1. Mihai Chirita, Gheorghe Chirita, Tratat de Biomolecule, Sedcom Libris.

2. Bell E, Ehrlich HP, Buttle DJ, Nakatsuji T. Living tissue formed in vitro and accepted

as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 1981;211(4486):1052-1054.

3. Hooke R. Micrographia, or some physiological descriptions of minute bodies made by

magnifying glasses with observations and inquiries thereupon. London, England:

Royal Society; 1665.

4. Harrison RG. Observations on the living developing nerve fiber. Proc Soc Exp Biol

Med. 1907;4:140-143.

5. Carrel A. On the permanent life of tissues outside of the organism. J Exp Med.

1912;15(5):516-528.

6. Rous P, Jones FS.A method for obtaining suspensions of living cells from the fixed

tissues, and for the planting out of individual cells. J Exp Med. 1916;23:549-555.

7. Enders JF.General preface to studies on the cultivation of poliomyelitis viruses in

tissue culture. J Immunol.1952;69(6):639-643.

8. Amit M, Carpenter MK, Inokuma MS, et al. Clonally derived human embryonic stem

cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of

culture. Dev Biol. 2000;227(2):271-278.

9. Yang X, Qu L,Wang X, et al. Plasticity of epidermal adult stem cells derived from

adult goat ear skin. Mol Reprod Dev. 2007;74(3):386-396.

10. Lodish H,Baltimore D,Darnell JE. Multicellularity: cell-cell and cell-matrix

interactions. In:Tenney S, ed. Molecular Cell Biology. 3rd ed. New York,NY:WH

Freeman; 1995.
11. Marcacci M, Berruto M, Brocchetta D, et al.Articular cartilage engineering with

Hyalograft C: 3-year clinical results. Clin Orthop Relat Res. 2005;(435):96-105.

12. Bilodeau K, Mantovani D. Bioreactors for tissue engineering: focus on mechanical

constraints. A comparative review. Tissue Eng. 2006;12(8):2367-2383.

13. Griffith LG, Naughton G. Tissue engineering—current challenges and expanding

opportunities. Science. 2002;295(5557):1009-1014.

14. Lee SJ. Cytokine delivery and tissue engineering. Yonsei Med J. 2000;41(6):704-719.

15. Nimni ME. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials.

1997;18(18):1201-1225.

16. Ferreira LS, Gerecht S, Fuller J, Shieh HF, Vunjak-Novakovic G, Langer R. Bioactive

hydrogel scaffolds for controllable vascular differentiation of human embryonic stem

cells. Biomaterials 2007;28:2706–2717. [PubMed: 17346788]

17. Kraehenbuehl TP, Zammaretti P, Van der Vlies AJ, Schoenmakers RG, Lutolf MP,

Jaconi ME, et al. Three-dimensional extracellular matrix-directed cardioprogenitor

differentiation: Systematic modulation of a synthetic cell-responsive PEG-hydrogel.

Biomaterials 2008;29:2757–2766. [PubMed:18396331]

18. Radisic M, Park H, Martens TP, Salazar-Lazaro JE, Geng WL, Wang YD, et al. Pre-

treatment of synthetic elastomeric scaffolds by cardiac fibroblasts improves

engineered heart tissue. Journal of Biomedical Materials Research Part A

2008;86A:713–724. [PubMed: 18041719]

19. Rockwood DN, Akins RE Jr, Parrag IC, Woodhouse KA, Rabolt JF. Culture on

electrospun polyurethane scaffolds decreases atrial natriuretic peptide expression by

cardiomyocytes in vitro. Biomaterials 2008;29:4783–4791. [PubMed: 18823659]

20. Uebersax L, Hagenmueller H, Hofmann S, Gruenblatt E, Mueller R, Vunjak-

Novakovic G, et al. Effect of scaffold design on bone morphology in vitro. Tissue

Engineering 2006;12:3417–3429. [PubMed: 17518678]

21. Grayson WL, Bhumiratana S, Cannizzaro C, Chao GP, Lennon D, Caplan AI,

Vunjak-Novakovic G. Effects of initial seeding density and fluid perfusion rate on

formation of tissue-engineered bone. Tissue Eng A 2008;14:1809–1820.

22. Fischbach C, Chen R, Matsumoto T, Schmelzle T, Brugge JS, Polverini PJ, et al.

Engineering tumors with 3D scaffolds. Nature Methods 2007;4:855–860. [PubMed:

17767164]

23. Ott HC, Matthiesen TS, Goh SK, Black LD, Kren SM, Netoff TI, et al. Perfusion-

decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature

Medicine 2008;14:213–221.

24. Radisic M, Euloth M, Yang L, Langer R, Freed LE, Vunjak-Novakovic G. High-

density seeding of myocyte cells for cardiac tissue engineering. Biotechnol Bioeng

2003;82:403–414. [PubMed: 12632397]

25. Radisic M, Park H, Chen F, Salazar-Lazzaro JE, Wang Y, Dennis R, et al.

Biomimetic approach to cardiac tissue engineering: oxygen carriers and channeled

scaffolds. Tissue Eng 2006;12:2077–2091. [PubMed: 16968150]

26. Radisic M, Yang L, Boublik J, Cohen RJ, Langer R, Freed LE, et al. Medium

perfusion enables engineering of compact and contractile cardiac tissue. Am J Physiol

Heart Circ Physiol 2004;286:H507–H516. [PubMed: 14551059]

27. Dvir T, Levy O, Shachar M, Granot Y, Cohen S. Activation of the ERK1/2 cascade

via pulsatile interstitial fluid flow promotes cardiac tissue assembly. Tissue Eng

2007;13:2185–2193. [PubMed: 17518740]

28. Wang Y, Ameer GA, Sheppard BJ, Langer R. A tough biodegradable elastomer.

Nature Biotechnology 2002;20:602–606.

29. Owan I, Burr DB, Turner CH, Qiu JY, Tu Y, Onyia JE, et al. Mechanotransduction in

bone: Osteoblasts are more responsive to fluid forces than mechanical strain.

American Journal of Physiology-Cell Physiology 1997;42C810-C5

30. Bancroft GN, Sikavitsas VI, Mikos AG. Design of a flow perfusion bioreactor system

for bone tissueengineering applications. Tissue Engineering 2003;9:549–554.

[PubMed: 12857422]

31. Grayson WL, Bhumiratana S, Cannizzaro C, Chao GP, Lennon D, Caplan AI, Vunjak-

Novakovic G. Effects of initial seeding density and fluid perfusion rate on formation

of tissue-engineered bone. Tissue Eng. in press

32. Mauck RL, Soltz MA, Wang CC, Wong DD, Chao P-HG, Valhmu WB, et al.

Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of

chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng 2000;122:252–260. [PubMed:

10923293]

33. Zimmermann WH, Schneiderbanger K, Schubert P, Didie M, Munzel F, Heubach JF,

et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation

Research 2002;90:223–230. [PubMed: 11834716]

34. Mauck RL, Nicoll SB, Seyhan SL, Ateshian GA, Hung CT. Synergistic action of

growth factors and dynamic loading for articular cartilage tissue engineering. Tissue

Engineering 2003;9:597–611. [PubMed: 13678439]

35. Sikavitsas VI, Bancroft GN, Holtorf HL, Jansen JA, Mikos AG. Mineralized matrix

deposition by marrow stromal osteoblasts in 3D perfusion culture increases with

increasing fluid shear forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America 2003;100:14683–14688. [PubMed: 14657343]

36. Radisic M, Park H, Shing H, Consi T, Schoen FJ, Langer R, et al. Functional assembly

of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on

scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America 2004;101:18129–18134. [PubMed: 15604141]

37. Tung L, Sliz N, Mulligan MR. Influence of electrical axis of stimulation on excitation

of cardiac muscle cells. Circulation Research 1991;69:722–730. [PubMed: 1873867]

38. Radisic M, Park H, Shing H, Consi T, Schoen FJ, Langer R, et al. Functional assembly

of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on

scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:18129–18134. [PubMed: 15604141]

39. Berger HJ, Prasad SK, Davidoff AJ, Pimental D, Ellingsen O, Marsh JD, et al.

Continual electric field stimulation preserves contractile function of adult ventricular

myocytes in primary culture. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory

Physiology 1994;266:H341–H349.

40. Li N, Tourovskaia A, Folch A. Biology on a chip: microfabrication for studying the

behavior of cultured cells. Critical Reviews in Biomedical Engineering 2003;31:423–

488. [PubMed: 15139302]

41. Sia SK, Whitesides GM. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for

biological studies. Electrophoresis 2003;24:3563–3576. [PubMed: 14613181]

42. Figallo E, Cannizzaro C, Gerecht-Nir S, Burdick J, Langer R, Elvassore N, Vunjak-

Novakovic G. Microbioreactor for controlled differentiation of human embryonic stem

cells. Lab on a Chip 2007;7:710–719. [PubMed: 17538712]

43. Khademhosseini A, Eng G, Yeh J, Kucharczyk PA, Langer R, Vunjak-Novakovic G,

et al. Microfluidic patterning for fabrication of contractile cardiac organoids.

Biomedical Microdevices 2007;9:149–157. [PubMed: 17146728]