5/19/2020

1 GENETICA BACTERIANA
2 GENETICA BACTERIANA
 Implicatii in stabilirea:
- taxonomiei bacteriene;
- bazei moleculare a patogenitatii bacteriilor;
- mecanismelor moleculare de rezistenta la antibiotice;
- metode de diagnostic in microbiologia clinica;
- inginerie genetica.
3 GENETICA BACTERIANA
 studiază ereditatea şi variabilitatea la bacterii;
 genomul bacterian = suma genelor unui microorganism,
- este suportul material al eredităţii;
 gena - constituie unitatea funcţională de bază a informaţiei genetice;
= fragment ADN (2500 nucleotide) care codifica informatia pentru sinteza
unui polipeptid
 genomul bacterian este reprezentat de AND din structura:
- cromozom (include gene esenţiale)
- plasmide (conţine gene care codifică caractere de tulpină);
- episomi;
- profagi (bacterii lizogene).
 Organizare genomica foarte eficienta – secvente non-codante 12%
4 GENETICA BACTERIANA
 Specia
= toate bacteriile care au aceeași informație genetică
- include un număr infinit de tulpini
 Tulpina
= o parte dintr-o specie bacteriană diferită de alte bacterii ale aceleiași specii printr-o
diferență minoră, dar identificabilă (de exemplu, rezistența la antibiotice).
- populația de bacterii izolate la un anumit moment, dintr-un anumit loc.
5 GENETICA BACTERIANA


 genotip = totalitatea informaţiei înscrisă în genomul bacterian;

 fenotip = suma caracterelor observabile rezultate din interacţiunile genotipului cu

mediul ambiant.

6 Genomul bacterian
 cromosom
– 16x106 perechi nucleotide, 6000 gene
– codifică - structura,
- creşterea,
- multiplicarea normală a bacteriei.
7 Genomul bacterian
8 Genomul bacterian
9 Genomul bacterian
10 Genomul bacterian
11 Genomul bacterian
12 Genomul bacterian
 plasmide

1
 8
9
5/19/2020
10
11
12
 plasmide
– elemente genetice extracromosomale;
- 5% din greutatea cromosomului;
– au replicare autonomă (atasate la un situs membranar de replicare);
– ADN circular (exceptie Borrelia);
– dispensabile;
– supravieţuirea bacteriei în condiţii modificate de mediu => prelungesc timpul de
generatie;
- codifică caractere de tulpină;
13 Genomul bacterian
 Plasmide - structura:
Determinanti genetici esentiali pentru autonomie replicativa
Determinanti care codifica structuri exprimate in fenotipul bacterian
± Determinanti care codifica structuri implicate in conjugarea bacteriana – plasmide
conjugative (conjugoni)
Genele care codifica structuri exprimate fenotipic nu sunt intercalate cu celelalte gene.
14 Genomul bacterian
 Clasificare plasmide in raport cu caracterele exprimate fenotipic:
• plasmide de virulenţă;
• plasmide care codifică enzime ale unor căi metabolice particulare (ex. fixarea N2 la
Klebsiella; degradarea toluenului, camforului sau octanului la Pseudomonas);
• plasmide care codifică sinteza unor agenţi antimicrobieni (ex. bacteriocine,
antibiotice);
• plasmide de rezistenţă la agenţi antimicrobieni;
• plasmide criptice (caractere codificate necunoscute).

15 Genomul bacterian
 In aceeasi celula, plasmidul poate fi prezent in una sau mai multe cópii

 Episomi – plasmide (sau genome profagice) integrate linear în cromozomul bacterian

16 Genomul bacterian
 Expresia informatiei genetice:
Transcriptie
Translatie





 Replicarea ADN

17 Expresia informatiei genetice stocate in ADN

18 Transcrierea
 iniţierea transcrierii = dependentă de ataşarea ARN polimerazei la catena ADN matriţă
la nivelul unei secvenţe promotor (în amonte de locul de start al transcrierii)

 promotorul este alcătuit din 2 secvenţe:
secvenţa – 35 - TTGACA amplasată cu 35 de nucleotide înainte de locul de start al
transcrierii.

19

2
 5/19/2020

transcrierii.
secvenţa – 10 –TATAAT amplasată cu 10 de nucleotide înainte de locul de start al
transcrierii.
19 Operon = grup de mai multe regiuni codante atasate la un singur promotor
 Genele implicate in preluarea si metabolizarea lactozei sunt organizate impreuna in
operonul lac
20
21 Caracteristicile codului genetic
 Este degenerat – mai mulţi codoni codifică același aminoacid
 Este specific – un codon nu codifică mai mulţi aminoacizi.
 Este lipsit de punctuaţie
 Direcţia de lectură a ARNm este 5' -> 3’
 Este universal - valabil la toate organismele vii
22 Replicarea ADN
23
24
25
26
27
28 Variabilitatea la bacterii
 Variaţia fenotipică
– indusă de interacţiunea genomului cu factorii de mediu
– reversibilă, specifică
– nu se transmite ereditar
- adapteaza ansamblul unei populatii bacteriene cu acelasi genotip la conditii
modificate de mediu
- are la baza controlul transcriptiei AND in ARNm si traducerea acestuia in proteine
29 Variabilitatea la bacterii
 Variaţia fenotipică
Exemple:
 Represia genelor vegetative in cursul sporularii
 Inductia unor ß-lactamaze de catre antibiotice ß-lactamice
 E. coli - represia sintezei de triptofan in prezenta acestuia in mediu
- inductia enzimelor de fermentare a lactozei cand aceasta este prezenta in
mediu.
30 Variabilitatea la bacterii
 Variaţia genotipică
– modificare bruscă a unuia sau a mai multor caractere ale unui individ
– se transmite ereditar
- variaţiile în secvenţa unei gene constituie alele
(haploid=o singura copie a genei!)
– mecanisme:
• mutaţia

• transferul ADN de la un donor la

un acceptor,
urmat /nu de recombinare genetică
31 Variabilitatea la bacterii
 Variaţiile genetice creează indivizi cu caractere noi


32

3
 5/19/2020

31



 Modificările mediului creează avantaje sau dezavantaje pentru diferitele variante
32 Mutaţia
 eroare de autoreplicare a ADN
 modificare în secvenţa nucleotidică a unei gene => codon diferit => secvenţă diferită
de aminoacizi
 noile gene apărute prin mutaţie se numesc alele şi ocupă acelaşi locus genetic ca
gena de origine

 mutaţiile acumulate de-a lungul a miliarde de ani, sub efectul selecţiei naturale,
explică evoluţia speciilor
33 Mutaţia
Caracteristici:
 rară,
 spontană,
 specifică,
 independentă,
 discontinuă,
 stabilă.

34 Mutaţiile eveniment rar
 Rata mutaţiei
= probabilitatea de apariţie spontană a unei mutaţii într-o populaţie bacteriană;
- este foarte scăzută (10-6 – 10-9 pentru un caracter )
- poate creşte în prezenţa unor agenţi mutageni (chimici sau fizici).
 Frecvenţa mutaţiei
= proporţia unui anumit mutant într-o populaţie bacteriană;
- frecvenţa mutantului poate creşte ca urmare a selecţiei:
- relative (mutantul cu timp de generaţie mai scurt, se multiplica mai repede)
- absolute (prin prezenţa unui factor de mediu favorabil mutantului dar
defavorabil restului populaţiei).
35 Mutaţiile eveniment rar
 Factori care influenteaza prezenta si manifestarea mutatiilor:
1. Marimea populatiei bacteriene
- Sfarsitul fazei exponentiale - 1010 – 1012 celule/mL => 1-2 mutante rezistente la
streptomicina (rata mutatiei 10-6) sau 1 mutanata rezistenta la rifampicina (rata
mutatiei 10-8)
1.
2. Caracterul haploid al bacteriilor
- O gena mutanta nu poate fi compensata prin alela nonmutanta ca la celulele diploide
=> expresia mutatiei bacteriene este imediata
1.
36 Mutaţiile sunt spontane si imprevizibile
 Nu stim in care gena se produce eroarea de replicare si care va fi caracterul mutant
 Identificare mutante – presiune selectiva absoluta (“sita selectiva”) care omoara
populatia parentala si favorizeaza inmultirea mutantei

Mutaţiile sunt discontinui

 Mutatia urmeaza legea tot sau nimic – intre tipul salbatic si tipul mutant nu exista

37
4
 5/19/2020

 Mutatia urmeaza legea tot sau nimic – intre tipul salbatic si tipul mutant nu exista
forme de tranzitie.
Exp. Mutatia genei care codifica polizaharidul capsular al pneumococului => variatia S -
>R
37 Mutaţiile sunt specifice si independente
 Rata mutatiei pentru 2 caractere este produsul ratelor mutatiei pentru fiecare caracter
in parte
Ex. Rata mutatiei pentru rezistenta la rifampicina = 10-8
Rata mutatiei pentru rezistenta la izoniazida = 10-5
Rata mutatiei pentru dubla rezistenta = 10-13
Daca populatia din caverna TBC = 108 bacili =>
- 1 mutanta rezistenta la monoterapie cu rifampicina (108/108)
- 103 mutante rezistente la monoterapie cu izoniazida (108/105)
- Nicio mutanta rezistenta la ambele – preventia selectiei de mutante multidrog
rezistente (1013)
- mutația unui caracter dat nu schimbă probabilitatea unei alte mutații
38 Mutaţiile sunt stabile
 Caracterul mutant se transmite indefinit la descendenti chiar in absenta presiunii
selective
 Numai mutatii reverse care apar cu aceeasi rata pot restaura tipul salbatic
39 Modalităţile mutaţiei
 Substituţii şi inversii nucleotidice
– modifică un singur codon (punctiforme)


 Inserţii şi deleţii
– interesează un singur nucleotid sau mai multe nucleotide
40 Substituţii şi inversii nucleotidice
– modifică un singur codon (punctiforme) =>
codon sinonim – mutatie imperceptibilă
codon nou – mutatie cu sens greşit
• aminoacid nou înafara situsului funcţional al polipeptidului = mutatie mută
• aminoacid nou în situsul funcţional al polipeptidului = funcţie
pierdută/modificată
codon non-sens (stop, ex. UAA, UAG, UGA) – mutatie non-sens => peptid incomplet
Mutatie polară = mutatie non-sens din prima genă structurală a unui operon =>
sistează traducerea următoarelor gene structurale => se pierd mai multe peptide (ex.
o secventă metabolică)
41 Inserţii şi deleţii
– interesează un singur nucleotid sau mai multe nucleotide (frameshift mutation)
 microinserţii/microdeleţii
- interesează un singur nucleotid cu decalarea citirii mesajului genetic = mutaţii cu
schimbare de proiect => proteină total nouă
 macroinserţii – insertia intr-o gena a unui fragment de AND (sute/mii perechi de baze
prin intermediul unui profag) => mutaţie cu pierderea funcţiei
 macrodeleţii - mutaţii letale/ apariţia de genuri noi de bacterii (ex. Genul Mycoplasma
prin macrodeletie dintr-un stramos comun cu genul Clostridium)
42
43 Mutatie polară
44 Mutaţii bacteriene observate în laborator (consecinţe):

5
 5/19/2020

42
43
44 Mutaţii bacteriene observate în laborator (consecinţe):

mutaţii privind morfologia coloniei bacteriene (variaţia S – R);

mutaţii nutriţionale (mutanţi auxotrofi);
mutaţii care duc la pierderea unor factori de patogenitate (mutanţi avirulenţi la
S.pneumoniae care şi-au pierdut capsula);
mutaţii care conduc la apariţia fenomenului de rezistenţă la antibiotice (atât ADN
cromozomic cât şi cel plasmidic poate fi sediul unor asemenea mutaţii).
45
Transferul genetic

 în sens unic, de la o bacterie donor la una receptor


 exogenot = materialul genetic transferat

 endogenot = materialul genetic propriu

46
47 Evoluţia exogenotului în celula receptor
 recombinare: alinierea secvenţelor cu omologie structurală, urmată de substituirea
uneia sau mai multor gene între exo- şi endogenot (genele exogenotului persista
integrate in endogenot);
 integrare în genomul bacteriei receptor (transpozoni, profagi);
 menţinerea în poziţie extracromozomală dacă este un replicon (plasmide, fagi);
 supus acţiunii endonucleazelor de restricţie (informaţie genetică pierdută)
48 Recombinarea
 Bacteriile isi recunosc propriul AND pentru ca este marcat prin metilarea nucleotidelor
in pozitii specifice
 Catenele de ADN care nu sunt metilate in pozitii specifice sunt degradate prin
restrictie
 Endonucleazele de restrictie recunosc si cliveaza un palindrom (secventa nucleotidica
de 6-8 perechi de baze care se citesc identic in ambele sensuri pornind de la
extremitatea 3’ a catenei de ADN)
49 Palindrom
a. b.
3’ –GAATTC—5’ 3’ –GA*ATTC—5’
5’—CTTAAG—3’ 5’—CTTA*AG—3’

a. secventa recunoscuta si clivata de endonucleaza EcoR1 (E. coli)

b. dupa metilare (*) secventa nu mai este tinta endonucleazei EcoR1

50 Recombinarea
 Legitimă (omologie structurală exogenot-endogenot)





 Nelegitimă (recombinări catalizate enzimatic între secvenţe diferite de ADN)
Insertie aleatorie

51
52

6
 5/19/2020

Insertie aleatorie
Lipsa relatie intre secvente situs donor si acceptor
51 Recombinare legitima
52 Recombinare nelegitima = transpozitia
 excizia cópiilor monocatenare ale unor secvenţe specifice de ADN, apoi inserţia lor
aleatorie în acelaşi replicon (cromozom sau plasmid) / diferit, putând determina
blocarea expresiei unei gene în care se inseră (factor mutagen);
 nu exista nicio relatie intre secventele situs donor si situs acceptor;
 are loc cu intervenţia unei enzime, transpozaza, fără să fie necesară omologia
genetică
 elemente transpozabile:
Secvente de insertie (SI) - 0,8-1,4 Kb

Transpozoni (Tn) - 3-20 Kb
53 Tipuri de elemente transpozabile
• secvenţe de inserţie (SI)
- 0,8-1,4 Kb
- sunt constituite din gena care codifică transpozaza flancată de repetări inversate a
20-40 perechi de baze;
-

• transpozoni
- 3-20 Kb
- posedă în regiunea centrală una sau mai multe gene ce codifică anumite caractere
(ex. rezistenţa la antibiotice, activitati biochimice, factori de patogenitate), flancate de
SI.

54 Elemente transpozabile
55
56 Mecanisme de transfer
 Transformarea

 Conjugarea

 Transferul prin bacteriofagi

transducţia
conversia lizogenică


57
Transformarea
- bacteria acceptor primeşte ADN liber provenit din liza spontană a bacteriilor
donatoare.
- pneumococi, Bacillus spp., Haemophilus, Neisseria, Moraxella-Branhamella,
Helicobacter
58
59 Mecanisme de transfer
60 Conjugarea
- transfer genetic consecutiv contactului fizic între două bacterii cu polaritate sexuală
diferită

7
58
5/19/2020
59
60

diferită
- bacteria donor (”sex masculin”) - plasmid conjugativ (factorul F+)

Plasmid conjugativ
- gene care codifică sinteza de pili sexuali

Pilul sexual
- se ataşează la receptori specifici de pe suprafaţa unei celule receptor ( F-, de “sex
feminin”)
- prezent la bacteriile gram negative

61 Conjugarea
- retragerea pililor aduce cele două celule în contact - punte citoplasmatică prin care se
transferă ADN plasmidic
-
- rezultă două celule F(+)
-
- după 1 oră de contact între o populație F⁺ și o Fˉ, 50% din bacteriile Fˉ devin F⁺.
62
63
64 plasmidul F - gene adiţionale (rezistenţa la antibiotice)
65 Conjugarea
 mobilizarea plasmidelor non-conjugative;
 factorul F poartă gene suplimentare care sunt exprimate fenotipic prin:
- sinteza enzimelor care inactivează antibioticele (factori R),
- sinteza bacteriocinelor (factori cervicali)
- sinteza structurilor de virulență.
 cel mai adesea, conjugarea are ca rezultat rezistența dobândită
66 Conjugarea
 plasmidul F integrat în cromozom (episom) poate conduce la transfer de gene
cromozomale (între o bacterie Hfr şi una F- );
 transferul începe din vecinătatea locului de inserţie a plasmidului F, care este ultimul
transferat;
 bacteria donatoare rămâne Hfr;
 cel mai frecvent bacteria receptor ramâne F- ;
 transferul unui cromozom complet necesită 120 de minute, iar contactul dintre cele
două bacterii nu este persistent.
67
68
69 Conjugarea

 transferul de ADN la bacterii gram-pozitive (ex. enterococi) este controlat de feromoni
(hormoni sexuali primitivi), molecule de suprafaţă prin care celulele bacteriene aderă
între ele.

70 Mecanisme de transfer
71 Bacteriofagul
 sau fagul
 un virus care infectează numai bacteriile;
 conține ADN dublu catenar;

72

8
70
5/19/2020
71

 conține ADN dublu catenar;

 incapabil să se reproducă singur;
 injectează materialul genetic în bacteriile gazdă.
72 Bacteriofag
1. Cap
2. Coada
3. Acid nucleic
4. Capsida
5. Col /guler
6. Teaca contractila
7. Fibre caudale
8. Spiculi /crosete
9. Placa bazala

73
74
Transducţia

- transfer de ADN de la o celula bacteriană la alta prin intermediul bacteriofagilor

- în timpul înmulțirii bacteriofagului, ADN-ul bacteriilor este încorporat în genomul
fagului;
-
- Generalizata – fagi litici
- Specializata – fagi temperati

- cotransducţia (max. 2% cromozomul bacteriei donor) este limitată la gene bacteriene

vecine
75
Transducţia generalizata
- este efectuata de fagii litici;
- fragmentul de genom al gazdei sursă este apoi integrat în genomul unui destinatar
prin recombinare omologă;
- poate afecta întregul genom al gazdei.

76
77
78
79 Conversia lizogenică
 informaţie genetică adiţională, de origine fagică – integrare in cromosomul bacterian
prin recombinare situs specifica
 rol: producerea toxinei botulinice – toxiinfecţie alimentară
80
81
82 Semnificaţii biologice ale variaţiei genetice a bacteriilor
 variaţiile genetice creează indivizi cu caractere noi
 mutaţiile scurtează timpul de generaţie (pierdere structuri şi funcţii)
 transferurile genetice prelungesc timpul de generaţie (1-m.m. caractere suplimentare)
 modificările mediului creează avantaje sau dezavantaje pentru diferite variante
• selecţia relativă – pozitivă pentru mutantele cu timp de generaţie mai scurt decât al
populaţiei parentale

9
 5/19/2020

populaţiei parentale
– negativă când transferul genetic creşte timpul de generaţie al
variantei
• selecţia absolută – factor de mediu favorabil unei variante dar letal pentru populaţia
parentală
83 Importanţa
 Diagnosticul microbiologic

 Ingineria genetică
84 Ingineria genetică
Bacteriile
 multiplicare rapidă şi economă

 randament de biosinteză impresionant

85 Ingineria genetică
86
87
88 Mecanisme de reparare a ADN
 Reparare prin excizie - 4 enzime:
endonucleaze (cliveaza catena de ADN de o parte si de alta a erorii);
3’nucleotidaza (excizeaza situs eroare prin digestie secventiala);
AND polimeraza (transcrie de pe catena parentala situsul excizat);
AND ligaza (reface continuitate catena).
- Mecanism posibil temporal intre transcrierea catenei progene si metilarea
nucleotidelor in pozitii specifice
- Mecanism inoperant dupa metilare => mutatie insusita ca self
 Raspuns SOS
- Daca eroarea este extinsa => furca de replicare blocata la nivelul erorii
- Situsul erorii va fi identificat, clivat si excizat
- Proteina rec A (codificata de operon rec ) se fixeaza pe catena parentala in dreptul
exciziei, initiaza recombinari genetice si inhiba represori ai unor profagi si enzime ale
sistem de reparare a AND.
-
89 Mecanisme de reparare a ADN
90
91

10