• Inginerie genetică și

biotehnoligii

• Proiect realizat de Simion David-Romeo

 Ingineria genetica reprezinta un ansamblu de
metode si tehnici de lucru prin care se
manipuleaza materialul genetic la nivel celular si
molecular. Astfel se obtin microorganisme, plante si
Ingineria
animale, reprogramate genetic, in al căror genom
sunt incluse gene straine, utile, exprimabile si
transmisibile stabil la descendenti.
genetica
Ingineria genetică utilizează metode de cultură
in vitro a celulelor și țesuturilor animale și vegetale
și tehnologia ADN-ului recombinat. Pe aceste
metode se bazează hibridarea somatică la plante
și animale, haploidia prin androgeneză
șiginogenezăexperimentală, precum și clonarea.
BEST FOR
You 2
O R G A N I C S
 Tehnici utilizate în ingineria genetică:
» 1. TehnicaADNrecombinat Aceasta » 2.Hibridareasomatică
tehnica prezinta avantajul ca poate Inurmacareiarezulta hibrizi somatici
depasi barierele de specie adica, permite interspecifici la plante si animale.Ea se
transferul ADN-ului de la o specie la alta. bazeaza pe fuziunea invitroin cultura
Ea presupune folosirea unor vectori, mixta a celulelor somatice apartinand
enzime specifice si microorganisme. indivizilor din specii diferite. Tehnica
Vectorii utilizati sunt virusurile si utilizeaza agenti care maresc viteza si
plasmidele. Ei transporta genele de frecventa de fuziune si medii de cultura
interes.Enzimele sunt endonucleazele selective pentru cresterea si dezvoltarea
de restrictie care “taie” in anumite celulelor hibride. La plante hibridarea
puncte secventele de nucleotide, facand somatica se relizeaza cu
posibila izolarea genei si ligazele care ajutorulprotoplastilor, celule la care
“sudeaza” gena de interes in vector. peretele celular a fost distrus prin
tratament enzimatic. Astfel, prin
» Microorganismele utilizate sunt
hibridarea graului comun cu secara s-a
bacteriile si drojdiile. Etapele acestei obtinut o noua specie Triticale, care
tehnologii sunt: izolarea ADN-ului contine cromozomii si caracterele
corespunzator unei anumite gene, ambelor specii. La animale s-au realizat
multiplicarea sa, construirea unor hibrizi somatici de tipul: om xsoarece, om
molecule de ADN hibride si transferul de x tantar, soarece x gaina, hamster
la o specie la alta (chiar de la procariote chinezesc x soarece.
la eucariote). BEST FOR
You 3
O R G A N I C S
 TRANSFER DE GENE DE LA
ORGANISME MODIFICATE
GENETIC
Cea mai relevanta evaluare
alimentelor, cu privire la transferul
de gene, este rezultatul potential al
transferului de gene introduse prin
materialul obtinut dintr-un organism
modificat genetic la microorganisme
din tractul gastro-intestinal (GI), intr-
un mod in care genele pot fi,
succesiv, incorporate si au impact
asupra sigurantei sanatatii animale
sau umane. Genele marker sunt
inserate in plantele modificate
genetic pentru a facilita identificarea
celulelor sau tesuturilor modificate
genetic in timpul dezvoltarii. Exista
mai multe categorii de gene marker,
incluzand genele de rezistenta la
antibiotice si genele de rezistenta la
ierbicide. BEST FOR
You 4
O R G A N I C S
» Pentru a avea loc transferul de gene, trebuie sa aiba loc urmatoarele
evenimente: 
» ADN vegetal trebuie sa fie eliberat din celule/ tesuturi vegetale si sa
supravietuiasca in conditiile de mediu ostile ale tractului GI, inclusiv la expunerea
la acidul gastric si nucleaze; microorganismele recipiente trebuie sa fie
competente pentru transformare; microorganismele recipiente trebuie sa lege
ADN pentru transformare; ADN trebuie sa penetreze peretele ceular si sa
traverseze membrana celulara; ADN trebuie sa reziste la sistemul de
restrictie/modificare produs de microorganism, pentru a degrada ADN strain;
ADN trebuie sa se integreze in plasmida sau genomul gazda si necesita cel putin
20 p.b. pentru o secventa ADN omoloaga completa, in vederea recombinarii la
ambele capete ale ADN strain.
» Probabilitatea ca ADN strain sa persiste intr-un mediu ostil trebuie sa fie
amplificata semnificativ, in conditiile care ar fi exercitate de presiunea de selectie.
Asemenea conditii sunt, in general, considerate a fi limitate la markerii de
rezistenta la antibiotice si numai in conditiile utilizarii in terapia orala a
antibioticului corespunzator. Doar atunci cand un marker de rezistenta la un
antibiotic este sub controlul unui promotor bacterian corespunzator, ar trebui ca
gena de rezistenta la antibiotic sa fie potential exprimata si, astfel, sa furnizeze
un avantaj selectiv unui microorganism recipient. Markerii antibiotici existenti sub
controlul promotorilor vegetali nu vor fi exprimati intr-un microorganism; prin
urmare, in aceasta situatie, prezenta antibioticului nu furnizeaza presiune de
selectie.
BEST FOR
You 5
O R G A N I C S
 Elementele constitutive ale tehnologiei ADN
Recombinat
» PREZENTAREA ELEMETELOR CONSTITUTIVE
»  Tehnologia ADN recombinat se bazeaza, in principal, pe utilizarea urmatoarelor
elemente constitutive:
» Un set de enzime care intervin in metabolismul acizilor nucleici, in general, si in mod
special in tehnologia ADN recombinat. In particular, doua tipuri de enzime sunt
esentiale pentru obtinerea de ADN recombinat : endonucleaze de restrictie si ADN
ligaze.
» Vectorul de clonare (vehiculul) este o structura alcatuita din ADN, care poate fi
acceptata intr-un organism gazda si care are capacitatea de a se replica autonom. Prin
insertia genelor de interes in vehicul, acesta realizeaza transferul genelor de la un
organism la altul.
» Gena de interes reprezinta un fragment de ADN ce cuprinde secventa de nucleotide
corespunzatoare produsului polipeptidic a carui sinteza se urmareste. Gena de interes,
dupa insertia in vector, este clonata odata cu acesta.
» Receptorul este reprezentat, de regula, de celule bacteriene care au rolul de a accepta
ADN recombinat, asigurand exprimarea genelor, respectiv sinteza unui produs specific,
in cantitati proportionale cu ritmul de diviziune a celulei [50, 96].

BEST FOR
You 6
O R G A N I C S
 ENZIMELE DIN TEHNOLOGIA ADN RECOMBINAT
» In tehnologia ADN recombinat un rol cu totul deosebit il are un set de enzime
care au facut obiectul unor decenii de cercetare privind metabolismul acizilor
nucleici.
» In tabelul nr.2.I sunt prezentate enzimele care intervin in metabolismul acizilor
nucleici si care sunt adevarate instrumente de cercetare in acest domeniu.
» Dintre enzimele prezentate in tabelul nr.2.I, in mod particular, doua tipuri de
enzime stau la baza metodei generale de a izola si propaga o molecula de ADN
recombinat.

BEST FOR
You 7
O R G A N I C S
 VECTORII DE CLONARE IN TEHNOLOGIA ADN
» VECTORULUI DE CLONARE
» Vectorul de clonare (vehiculul) reprezinta un element extracromozomial capabil sa se
multiplice si sa exprime o gena straina atasata de el in vitro, independent de cromozomul
celulei gazda.
» Operatia prin care o plasmida este convertita intr-un vector de clonare genica se numeste
constructia vectorului. Vectorul trebuie sa posede o serie de proprietati esentiale de care se
tine seama in alegerea si constructia lui:
» Capacitatea de a se replica rapid si intr-un numar cat mai mare de copii in celula gazda
(30-50 copii/celula);
» Dimensiune cat mai redusa (pentru a facilita patrunderea in celula gazda);
» Capacitate cat mai ridicata de acceptare (vehiculare) a unei gene straine;
» Sa nu contina in structura sa gene generatoare de efecte nedorite ( de exemplu, gene
inductoare de tumori);
» Sa posede cel putin un marker genetic (de exemplu, gena rezistentei la anumite antibiotice)
care sa permita selectia celulelor ce contin ADN recombinat;
» In tehnologia ADN recombinat se folosesc mai multe tipuri de vectori de clonare: plasmide,
» bacteriofagi, cosmide si chiar cromozomi .

BEST FOR
You 8
O R G A N I C S
 Obtinerea insulinei prin ADN recombinat continand gena pentru
proinsulina
» Acest procedeu are la baza construirea unor plasmide care sa contina secventele (genele)
care codifica proinsulina sub forma de ADNc. Acest ADNc se poate sintetiza in vitro din
ARNm pentru proinsulina izolat din celulele beta din insulele Langerhans ale pancreasului.
ARNm se izoleaza din aceste celule, se purifica prin cromatografie pe oligo-dT-celuloza si
este apoi utilizat la sinteza de ADNc cu ajutorul reverstranscriptazei. La inceputul lantului
de ADNc se ataseaza codonul ATG (sintetizat chimic) corespunzator metioninei. In acest fel
are loc marcarea pentru ADNc si se asigura si delimitarea galactozidazei de proinsulina,
ceea ce usureaza procesul de purificare a proinsulinei prin tratarea cu BrCN.
» ADNc astfel pregatit este apoi cuplat cu vectorul plasmidic prevazut cu elementele de
control ale operonului lac continand o mica parte din gena structurala a galactozidazei.
» ADN recombinat rezultat este utilizat pentru transformarea bacteriilor E.coli. Celulele
transformate produc o proteina compusa prin β-galactozidaza si proinsulina. Aceasta,
tratata cu BrCN, elibereaza proinsulina, care apoi este convertita in insulina matura pe cale
enzimatica (figura nr.3.7) [51,96].
» Avantajele insulinei umane obtinuta prin ADN recombinat fata de insulina izolata din
pancreasul animal sunt: nu induce afectiuni oculare (retinopatie) si renale (nefropatie), nu
provoaca alergii (fata de 5% alergii la insulina animala), are un grad inalt de puritate, se
poate obtine prin orice cantitate, productia nu este dependenta de abatoare, care sunt
aprovizionate discontinuu, iar testele clinice au stabilit ca insulina umana obtinuta prin
inginerie genetica este mai activa decat insulina umana.

BEST FOR
You 9
O R G A N I C S
 Insulina
» Conditia la care in solutie nu mai exista protamina sau insulina masurabila, dupa
cristalizare, este denumita ca fiind punctul de „isophane”. De aceea INSULINA NPH se mai
numeste INSULINA
» „ISOPHANE”.
» INSULINA NPH are o declansare a actiunii cuprinsa intre1-2 ore, o activitate maxima
cuprinsa intre 6-12 ore si o durata a activitatii de 18-24 ore.
» Ca si in cazul altor formulari, variatiile observate la relatia timp-actiune sunt datorate unor
factori cum ar fi : doza, locul injectarii, temperetura si activitatea fizica a pacientului.
» INSULINA NPH poate fi amestecata usor cu INSULINA REGULAR fie ex tempore, de catre
pacient, fie in forma in care se obtine de la fabricant, respectiv sub forma unei formulari
preamestecate.
» Au fost solutionate si controversele privind imunogenitatea la protamina. Astfel,
pacientii care au prezentat sensibilitate la protamina in cazul formularilor NPH au fost
trecuti pe tratament cu preparate de INSULINA LENTE sau INSULINA ULTRALENTE
pentru a se putea controla concentratiile bazale ale glucozei.
» INSULINA LENTE este o suspensie de zinc-insulina care a fost conceputa pentru o
singura injectie zilnica. Ea este un amestec constituit din doua forme insolubile de
insulina, 70% cristale romboedrice de zinc-insulina (componenta ultralente) si 30%
particule de insulina amorfa (componenta semilente).
BEST FOR
You 10
O R G A N I C S
» Formularea aceasta este un preparat neutru care contine tampon pe baza de acetat si un
exces de zinc. Surplusul de zinc se leaga la suprafata hexamerului insulinei, reducand
astfel solubilitatea insulinei si, in felul acesta, se produce o incetinire a profilului timp-
actiune.
» Volumul componentei cristaline ultralente este cuprins in mod obisnuit intre 200 si 1 000
mm³.
» INSULINA LENTE are o declansare a actiunii dupa 1-3 ore, activitatea maxima este intre 6-
12 ore si durata actiunii revine la 18-24 ore. Ca si in cazul altor formulari, variatiile
observate in ceea ce priveste profilul timp-actiune sunt datorate unor factori cum ar fi: doza,
locul injectarii, temperatura si activitatea fizica a pacientului.
» Capacitate de amestecare a INSULINA LENTE cu INSULINA REGULAR este limitata la
amestecurile ex tempore care sunt utilizate imediat dupa preparare.
»  In mod curent singura insulina cu actiune prelungita disponibila este INSULINA
ULTRALENTE, care este o suspensie de insulina cristalizata. Cristalele au fost identificate
ca fiind romboedrice cu un volum cuprins intre 200 si 1 000 mm³. Formularea contine un
agent de tamponare cu valoare neutra a pH-ului si un surplus de zinc.
» INSULINA ULTRALENTE are o declansare a actiunii la 4-6 ore, o activitate maxima
curpinsa intre 8-20 ore si o durata actiunii situata intre 24-48 ore. Ca si celelalte formulari,
variatiile profilului timp-actiune sunt datorate unor factori cum ar fi: doza, locul injectarii,
temperatura, activitatea fizica a pacientului.
» Amestecarea preparatului INSULINA ULTRALENTE cu INSULINA REGULAR este limitata
la amestecarea ex tempore si utilizarea imediata.

BEST FOR
You 11
O R G A N I C S
 Biotehnologiile
» Biotehnologiile constau în aplicarea proceselor biologice în scopul
obţinerii unor substanţe necesare în medicină şi în industrie. Dezvoltarea
ingineriei genetice şi a biotehnologiilor a devenit o posibilă odată cu
dezvoltarea tehnicilor de investigaţie din ştiinţele biologice. Principalele
etape în ingineria genetică sunt: – obţinerea ADN-insert – stabilirea unui
vector de clonare – obţinerea ADN-recombinant (ADN-rec) – clonarea
(multiplicarea) ADN-recombinant – introducerea ADN-rec într-un
organism-gazdă.
 

BEST FOR
You 12
O R G A N I C S
 Clonarea
» Clonareaesteprocesulprincaredintr-osinguracelulacultivataseobtine o
coloniedeceluleidentice. Clonarea la plante se bazeaza pefenomenulde totipotentacare
consta in capacitea de a genera , prin diviziuni succesive, intregul organism. Pentru
clonelor se utilizeaza fie prelevarea meristemulor, fie inmultirea vegetativa. Tot la plante,
prin cultura de polen, antere, ovare sau ovule nefecundate se obtin organisme haploide
normale, dar sterile. Tratate cu colchicina, plantele haploide se diploidizeaza si devinlinii
pure genetiv (izogene).Cultivate, acestea produc substante farmacologic active pentru
industria medicamentelor, alimentara, cosmetica etc.Astfel s-au obtinut carotenii din
morcov, alcaloizii din tutun, saponinele din gingseng. La animalele vertebrate, clonarea se
realizeaza prin translatarea nucleilor din celulele somatice in ovule din care s-auindeparatat
nucleii. Este bine cunoscut cazul celebrei oi clonate Dolly (1997). Ea a fost obtinuta din
fuzionarea unui ovul fara nucleu provenit de la o oaie cu capul negru, cu o celula somatica
provenita din glanda mamara a unei oi cu capul alb. Dolly are capul alb, fiind identica cu
oaia cu capul alb, de la care a provenit celula cu nucleu. Metoda clonarii prezinta avantajul
obtinerii unor copii identice din punct de vedere genetic ale unui organism adult.

BEST FOR
You 13
O R G A N I C S
 Biografia
• https://ro.wikipedia.org/wiki/Biotehnologie
• http://www.biotehnologii.usamv.ro/images/pdf/Bioteh
nologie_generala.pdf
• https://www.scribd.com/doc/205173201/Ingin
eria-genetica
• https://www.scribd.com/doc/142413958/
• Curs-14-Ingineria-Genetica-Si-Biotehnologiil
e-Moderne
• https://www.scribd.com/document/33707068
9/Inginerie-Genetica-Si-Biotehnologii
BEST FOR
You 14
O R G A N I C S