Ingineria genetica

Recombinarile genetice oaca un rol din ce in ce mai important. Totusi, nu trebuie

confundate experientele de modificare si transfer ale acizilor nucleici cu cele
referitoare la realizarea fecundatiei in vitro a ovocitelor de mamifere si la
manipuarea embrionilor prin transplant de nuclee, in vederea studiuliu diferentierii
celulare si embrionare (Kelly, 1982).
Evolutia biotehnologiei la anvergura care se constata, nu poate fi separata de
etapele esentiale ale vastei intreprinderi care cnsta in elucidarea progresiva a
mecanismelor fundamentale ale vietii (de Rosnay, 1981).
Itakura si colab. (City of Hope National Medical Center-Duarte California) au reusit in
1977 si 1979 sa sintetizeze genele somatostatinei si insulinei umne. Aceste gene au
fost introduce in celulele de Escherichia Coli prin tehnicile de recombinare genetica
puse la punct de Boyer si colab. de la scietatea GENETECH. Pentru prima oara s-a
facut demonstratia expresiei genelor umane in celulele bacteriene.
Dayhoff a realizat un atlas al secventelor de protein si a introdus la sfarsitul anului
1980 , un analizator si pe ordinator peste 350.000 de secvente de gene (virusuri,
bacterii , om).
Sinteza totala a unui AND avand o secventa nucleotidica specifica, se deosebeste
de replica in vivo sau in vitro a ADN-ului catalizata de AND-polimeraza. Aceasta are
nevoie de un tipar care este un frangment din molecula bicatenara a AND-ului si
consta in reproducerea cu fidelitate a unei informatii existente si nu a uneia noi.
Sinteza chimica ofera avantajul ca se pot studia procesele de reglare a sintezei
acizilor nucleici, precum si al transcriptiei AND-ului in ARN. In ARN rolul secventelor
nucleotidice promotoare este capital.
Polinucleotidele preparate prin sinteza pot servi la izolarea prin hibridare a ARN-ului,
mesager corespunzator care comanda sinteza unei polypeptide sau a unei proteine.
Progresele biologiei in ingineria genetica sunt legate de perfectionarea tehnicilor
analitice ca:
1. Ultracentrifugarea
2. Marcarea moleculelor cu izotopi radioactivi
3. Electroforeza
4. Cromatografia bidimensionala (tehnica separarii moleculelor complexe
prin anticorpii monoclonali corespunzatori)
5. Microanaliza (determinarea structurii primare a unei protein sau a unor
macromolecule biologice)

Principiul recominarii consta in a reuni un AND nativ si un ADN strain intr-un

vector care este un plasmid bacterian sau un genom viral, si a-l introduce
apoi intr-o celula gazda unde se va putea inmulti. Rezultatul va fi un clon de
cellule transformate, capabile sa exprime mesajul genetic strain pe care lau integrat si deci apte sa produca molecule proteice specifice in cantitate
mare (Abelson si Butz, 1980).
Recombinarile genetice sunt importante pentru:
- aplicatiile in bioindustrie;
- determinarea structurii genelor organismelor superioare;
- reglarea expresiei genice;
- determinaea structurii proteinelor pornind de la aminoacizi.
Tehnica enzimelor imobilizate, puza la punct la sfarsitul anilor 60
(enzimele sunt inchise intr-un gel poros sau fixate pe un suport solid)
este folosita pentru:
- productia penicilinelor semisintetice,
- productia fructozei plecand de la amidonul de porumb,
- teste biochimice simple.
Celulele sau organitele celulare imobilizate prezinta avantajul ca ele
contin secvente complete de enzyme indispensabile sintezei
compusilor complecsi.
Recombinarea genetica consta in schimbul de gene intre doi
cromozomi.
Recombinarea este un fenomen obligatoriu la manifere in timpul
formarii gametilor. In timpul meiozei unele gene se schimba intre
cromozomii omologi (crossing-over) si acesta explica fuziunea
caracterelor ereditare in cursul generatiilor succesive. La virusuri si
bacterii, recombinarea genetica este mai rara ca la animale.
Schimburile genetice urmate de recombinare se produc intre
organismele aceleasi specii sau intre specii invecinate.

Tehnici de introducere a AND-ului in cellule bacteriene

Exista doua tipuri:
1) Utilizarea plasmidelor ca vectori;
2) Utilizarea bacteriofagilor.
Plasmidele sunt molecule circulare de ADN si reprezinta intre 1-3 % din
genomul celulei bacteriene. Aceasta fractiune redusa a informatiei ereditare
dirijeaza importante caractere genetice care nu sunt, in general, sub cntrolul
cromozonului bacterian. Plasmidele poarta informatia relativa la conjugarea
celulelor bacteriene si sunt responsabile de o serie de boli la plante si
animale.
Numarul plasmidelor variaza intre 1 si 100 intr-o celula bacteriana, dar cu cat
este este mai voluminoasa cu atat numaru copiilor in celula este mai redus.

A doua tehnica utiizata pentru introducerea unei gene intr-o bacterie

foloseste ca vector un bcteriofag, al carui genom (10-50 gene) integreaza
gena straina; aceasta va fi sintetizata intocmai ca si celelalte gene ale
virusului, cand aceasta se va replica in celula bacteiana.

Recominarea si expresia ADN-ului in cellule bacteriene

Cromozonul unei bacterii este o macromolecula de ADN, cu lungimea de 1 m si
care contine circa 5 milioane de nucleotide. Aceasta moleculaneste repliata de
multe ori intr-un spatiu avand sectiunea de 1 micron.
ADN-ul celulor umane este repartizat in 46 cromozoni. Fiecare cromozon contine un
lant de ADN ca lungime de 4 cm iar numarul total al nucleotidelor este de ordinal a
3 miliarde.
Un alt mod consta in a izola ARN-mesager corespondent aflat din abundenta in
celulele specializate in producerea unei protein specific, de exemplu ARN-m al
insulinei din celulele B din indulele Langherhans ale pancreasului sau chiar ARN-m
al hemoglobinei.

Biosinteza insulinei cu ajutorul colibaciilor

Din 60 de milioane de diabetic in 1979, 4 milioane erau tratati cu insulin. Din 8001000 kg pancreas de bou (200 g) se obtin 100 g de insulin cristalizata. In 1935
Hagedom (Danemarca) a creat insulina-retard prin adaosul unei protamine.
Un diabetic dependent are nevoie in medie de 40 U/zi.
Prima cristalizare a insulinei a fost realizata in 1952.

Biosinteza somatostatinei umane si a altor substante

hormonale
Hormonul de crestere uman a fost izolat si purificat in 1963 de Ross si colab. din
hipofiza umana prelevata post mortem. Administrarea a 6 mg pe saptamana (trei
injectii) ar face posibila cresterea unui nanic cu 6 cm in primul an. Tratamentul
trebuie sa continue de la varsta de 4-5 ani pana la sfarsitul pubertatii.

Posibilitatile de recombinare genetica la microorganism

Majoritatea experientelor de recombinare genica au fost facute pe colibacili (E-coli)
si mai tarziu pe sue incapabile sa supravietuiasca in intestinul omului.

Clonarea fragmentelor de ADN si ARN comporta anumite exigente:

tramscrierea corecta si efi cienta, cu conditia ca substratul proteic sa
nu fi e degradat de proteazele din celula receptoare; posibilitatea de
transfer cu ajutorul unui vector corespunzator; posibilitatea de
descifrare a mesajului genetic; posibilitata exprimarii noului

caracter care raspunde la actiunea unei noi protein enzimatice (J.Y.

Berthaux 1997)

Clonarea
Perpectiva bebeluilor clonai a mai fcut un pas spre a deveni realitate, dup ce
oamenii de tiin au extras celule stem din embrioni umani creai n laborator.
Celulele, obinute cu ajutorul tehnicilor de clonare prin care a fost creat oaia Dolly, au
potenialul de a regenera organe i esuturi deteriorate.
Cu toate acestea, reuita cercettorilor creeaz noi dezbateri pe tema clonrii umane n
laborator. Asta le-ar permite cuplurilor care au pierdut un copil s plteasc pentru crearea
unui "duplicat".
Prin tehnica de clonarea folosit, oamenii de tiin americani au transformat celule
epidermice umane n celule su embrionare, care se pot transforma la rndul lor n orice
esut sau organ al corpului omenesc.
Cercetatorul Shoukhrat Mitalipov spune c pentru experimente s-au folosit ovule din care
a fost extras ADN-ul. Apoi, n interiorul ovulului au fost puse celule ale pielii i s-a folosit un
mic oc electric, pentru ca acestea s nceap s se dezvolte n embrioni. Dup ce embionii
s-au dezvoltat 5-6 zile, din ei au fost obinute celule stem.
"Tehnica noastr ofer noi ci de a obine celule stem pentru pacien i cu esuturi sau
organe disfuncionale sau distruse", a declarat Shoukhrat Mitalipov.
Paul De Sousa, medic la Universitatea din Edinburgh, crede c metoda va ajuta i la
dezvoltarea unor tratamente eficiente pentru infertilitate.
n Marea Britanie, legea prevede c emrionii clonai nu pot fi implantai n copul unei femei
i trebuie distrui dup cel mult 14 zile de la crearea lor. n alte ri ns, nu exist
asemenea prevederi.
Josephine Quintavalle, militant a grupului Comment on Reproductive Ethics, susine c
savanii nu sunt interesai de obinerea celulelor stem, ci de clonarea n sine. Ea spune c
exist deja metode mai puin controversate prin care se pot obine aceste celule.
"Sper c scopul lor nu este reproducerea prin clonare", a spus Josephine.
La rndul su, doctorul David King, de la Human Genetics Alert, cere interzicerea la nivel
mondial a clonrii i susine c publicarea detaliilor tehnice ale procedurii este
"iresponsabilitatea dus la extrem".