BAZELE GENETICII

VIRUSURILOR
 NOŢIUNI GENERALE
 Cercetările GV erau stopate de absenţa metodelor de cercetare.
 Soluţia a fost găsită de Dulbecco R. (1952) prin elaborarea
metodei coloniilor negative pentru virusurile citocide (Virusuri care
produc moartea celulei = citocide: virusul poliomelitei, virusul loxsakie, virusurile gripale,
virusul variolei etc. Aceste virusuri ,,inving’’ complet celulele, silindu-le sa fabrice
numai material viral. Celula devina , astfel ,,fabrica’’ de virusuri si in final moare).
 Studierea mutaţiilor a stat la baza elaborării hărţilor genetice.
 Analiza restricţională.
 Reacţia Polimerazică în Lanţ.
 Editarea genomului.
 GENETICA VIRUSURILOR
 Genomul viral (ADN sau ARN) este depozitarul
informației privind caracterele specifice virale.
 Fenotipul viral reprezintă totalitatea caracterelor care
sunt codificate de genomul viral.
 Caractere fenotipice: spectrul de gazde, tropism
tisular, caractere culturale (particularități
simptomatice, efecte citopatice, plaje), patogenitate
(om, animale), morfologie.
 Transfecția
(https://microbiologynote.com/ro/transfection-definition-types-principle-
applications/)
 Transfecția - introducerea de AND/ARN străin (material genetic al
genomului non-gazdă) în celulă. Scopul principal al transfecției este
de a modifica genomul gazdă pentru a exprima sau inhiba producția
proteinei.
 Fragmentele de ADN de interes este legată într-un vector care pot fi
AN virali plasmide, cosmide, BAC (cromozomi artificiali bacterieni),
YAC (cromozomi artificiali cu drojdie) sau HAC (cromozomi
artificiali umani).
 Cele mai frecvente metode de transfecție sunt transfecția mediată de
substanțe chimice, cum ar fi co-precipitația de fosfat de calciu,
lipozomi și metode fizice, cum ar fi electroporarea,
tehnica armei genice și microinjecția.
 ASEMĂNĂRI ÎNTRE TRANSFECȚIE ȘI TRANSFORMARE
• Sunt două tipuri de metode utilizate pentru introducerea ADN-ului străin în
celulele gazdă.
• Introducerea are loc prin membrana celulară și / sau anvelopa celulară.
• Transfecția este procesul de introducere deliberată a AN purificați în celulele
eucariote, în timp ce transformarea se referă la preluarea directă și la
încorporarea materialului genetic exogen din mediul său prin membrana
celulei.
• Ambele proceduri necesită ADN purificat și pot utiliza vectori pentru a
facilita transferul de gene.
• Trei metode utilizate în transferul genei:
- biologice,
- chimice,
- fizice.
 TRANSFECȚIA
AN viral este infectant la majoritatea v. (exceptie v. cu AN m.c. cu sens
negativ = myxov., reov.)
 Transfectia = inițierea infecției cu AN izolat și purificat, care diferă de
v. integru prin:
- randamentul redus,
- spectrul de gazde mare (inclusiv celule nepermisive),
- nu este afectată de anticorpi,
- este limitată de nucleaze și favorizată de polimeri bazici (protectori).
 Aplicații:

- prepararea de clone (populații virale omogene)

- manipulări genetice (recombinări).
 MUTAȚIILE LA VIRUSURI
Mutația = alterarea stabilă transmisă la descendenți
(mutații) a unei sau mai multor gene.
 Pentru descrierea mutaţiilor – ca schimbări în structura
genomului sau a genelor aparte, care condiţionează
variabilitatea eriditară a unui caracter sau proprietate, se
aplică termenul de “tip sălbatic”.
-Tipul sălbatic reprezintă o noţiune convenţională, care indică la
starea iniţială a unei anumite populaţii şi, de regulă, se aplică
doar în raport cu mutaţia concretă. Din această cauză V. sau
gena indicată ca sălbatică nu obligatoriu corespunde cu cea
obţinută din natură.
 M. trebuie să aibă o penetrare totală, să se vizualizeze bine, să
fie stabile şi să fie monotrope (urmare a unei singure mutaţii).
 DIVERSITATEA MUTAŢIILOR
VIRALE
o Substituții – înlocuirea unei baze cu alta
o Transversii – intercalarea unei secvențe nucleotidice
o Deleţii – pierderea unei secvențe nucleitodice,
o Inversii – schimbarea orientării unei secvențe
 Ts-mutaţiile - termosensibile
 Cs-mutaţiile – rezistente la frig
 Mutații morfologice
 Mutații care manifestă rezistență
 Mutații cu patogenitate scăzută
 Reversia mutațiilor
CLASIFICAREA M. DUPĂ CARACTERELE GENETICE PE CARE
LE MODIFICĂ
1. Mutațiile termosensibile (ts) și rezistente la frig (cs): v. cu proteine modificate,
imunogene, dar cu virulența atenuată.
2. Mutațiile dependente de gazde: multiplicare în celule nepermisive: v.adeno în
celule de origine umană.
3. Mutațiile morfologice: în culturi celulare: modificate sau dispariția efectelor,
modificarea plajelor pe embrionul de găină: poxvirusuri.
4. Mutațiile rezistente: la inhibitorii multiplicării: guanidina (v.polio); amantadina
(v. gripal).
5. Mutațiile cu patogenitate atenuată: acțiune combinată la cultivarea la
temperaturi suboptimale și pe specii depărtate (30-50 pasaje la v.polio, rujeolei și
rubeolei), tehnologii de inginerie genetică: deleție (SV40 și v.polio).
6. Reversia mutațiilor (revertanți): apare prin suprimarea determinată de altă
muțatie:
- intragenica (apropiată)
- intergenica (la distanță).
Pentru a explica apariția mutațiilor se folosesc
mecanismele:
-Erori de transcriere sau translație

-Mutații missens

-Codificarea difectuasă a aminoacizilor

-Mutații nonsens

-Procese reparatorii a difectelro apărute

APARIȚIA ȘI CAPTAREA EXPERIMENTALĂ A
VIRUSURILOR
 Spontane – la care polimerazele ARN-dependente nu
eleimină secvențele greșite
 Induse – cu aplicarea agenților mutageni (fizici, chimici)
 TIPURILE DE VARIAŢII
ANTIGENICE A VIRUSURILOR
 VIRUSURI
 La infectarea mixtă a celulelor se înregistrează 2 tipuri de relaţii:
- Complementarea,
- Recombinarea.
 Complementarea - reprezintă relaţia dintre produsele V., care asigură
mărirea masei şi productivităţii unuia sau a ambilor parteneri. Se
bazează pe faptul că unul sau ambele V. prezintă celuilalt produse
proteice la care acesta este defectat. Poate servi pentru separarea V. după
grupele funcţionale.
 Recombinarea – interacţiunea fizică dintre genomele virale la infectarea
mixtă. Apar genomuri noi, care conţin în ansamblu informaţia genetică,
ce lipsea la formele parentale.
 COMPLEMENTAREA
 apare când două virusuri cu genom incomplet
cultivate simultan își completează produsele codificate
de genele lipsă.
 este o interacțiune fenotipică la care se manifestă
rezultate alternative:
- virusuri defective în regiuni diferite (trans): genele
nemutante sintetizează anumite proteine.
- virusuri defective în aceiasi regiune (cis) nu
sintetizează aceste proteine.
 RECOMBINAREA
Recombinarea = modificarea structurii acidului nucleic prin aport de material
genetic și schimburi de segmente genomice omologe intre virusurile
diferite.
Mecanisme de recombinare:
 recombinarea intramoleculară este prezentă la:
- v . ADN (adenov., herpesv., poxv.), între perechi de mutații ts, ruperi și
reasocieri în catenele de acizi nucleici parentali prin încrucișare reciprocă
(crossing-over). Intervin enzimele celulare.
- v. ARN cu genom nesegmentat (v.polio, coronav.) recombinat. Se face prin
copieri alternative.
 reasortarea genomică: v. cu genom segmentat (myxov., reov.).
Recombinanții au genom cu segmente combinate întâmplător (v.gripale
au o frecvență de recombinare de 50%).
 RELAŢIILE GENETICE SIMILARE
HIBRIDĂRII
 La infectarea mixtă se mai înregistrează şi alte tipuri de
relaţii:
- Hibridarea bifactorială,
- Hibridarea trifactorială,
- Hibridarea polifactorială
- Reactivarea genetică - reprezintă un tip de recombinare,
când unul sau ambii parteneri nu sunt infecţioşi, iar la
îmbinarea mixtă se formează urmaşi cu caractere ale
procesului patogen.
 RELATII INTERVIRALE NEGENETICE
 apar prin infecție mixtă,
 se exprimă doar fenotipic,

 nu sunt stabile,

Se cunosc următoarele tipuri:

- mixaj fenotipic: intre v. înrudite.
- poliploidia: la v. anvelopate (myxov., paramyxov.) la care mai
multe nucleocapside au același înveliș.
- transcapsidarea: progenii se maturează defectuos prin
asamblarea inversă a capsidelor parentalilor (la
picornavirusuri, baculovirusuri).
 RELAŢIILE NEGENETICE DINTRE
VIRUSURI
La infectarea mixtă a celulelor se înregistrează diferite tipuri de
relaţii negenetice, care cauzează mascarea genotipului virusului
adevărat.
- Caracterul heterozigot al organismelor din natură şi proprietăţile
homozigote ale virusurilor,
-Interferenţa – reducerea activităţii biologice a virusurilor, care se
caracterizează cu indici similari.
-Supresia - relaţia de inhibare fenotipică a unui V. mutant de către
altul, cu indici deosebiți.
Sinergismul – interacţiunea dintre produsele virale la infectarea
mixtă, în care se înregistrează sporirea indicilor de productivitate.
INFECȚIA CU VIRUSURI INTERFERENTE
Infecția cu un virus poate fi în unele cazuri defavorabilă
infecției simultane sau suprainfecției cu un al doilea virus.
Acest tip de relație între două virusuri se numește
interferență. Mecanismul interferenței este într-o mare
măsură dependent de reacțiile celulare determinate de
prezența virusului, decât de activitatea autoreplicantă și
codificantă a acestuia.
 Organismele sau celulele infectate cu un virus manifestă uneori rezistență față de o infecție
simultană sau succesivă cu un alt virus. Acest fenomen poartă numele de interferență la care
participă 2 virusuri interferente: virusul inductor, care realizează primul infecția și provoacă
interferența și virusul revelator, care se suprapune primului și permite aprecierea efectului
interferent al acestuia.
 Din punct de vedere al naturii celor două virusuri, interferența poate fi omologă, heterologă
și autointerferența. În funcție de efectul virusului inductor asupra virusului revelator,
interferența poate fi stimulatoare și inhibitoare. Cel de al doilea tip este mai frecvent și mai
bine studiat. Interferența poate fi indusă de un virus viu, cât și de un virus inactivat. Timpul
de inducție al interferenței este foarte scurt, de 1-2 minute în cazul interferenței omologe și
mai lung, de 4-5 ore, în cazul interferenței heterologe. Durata acțiunii interferente depinde
de natura celor două virusuri, fiind mai scurtă (26-60 ore) în cazul interferenței omologe și
mult mai lungă în cazul celei heterologe. Gradul de rezistență al virusurilor revelatoare
poate fi diferit față de efectul inhibitor al aceluiași virus inductor.
Se cunosc mai multe mecanisme care explică interferența între două virusuri.
Cel mai frecvent este excluderea mutuală în faza de adsorbție. La această fază virusul
inductor împiedică accesul în celulă al virusului revelator. Rezistența celulelor față de
virusul revelator dispare după 26-60 ore, timp în care receptorii se regenerează.
Fenomenul Von Magnus explică autointerferența în cazul virusului influenței și se bazează
pe informația obținută în experiențele cu ouăle embrionate inoculate cu cantități mari de
virus al influenței, când se sintetizează, alături de virionii compleți, și particule defective,
care intră în relații de autointerferență cu virusul complet. Explicația fenomenului rezidă în
suprasolicitarea dispozitivelor de biosinteză ale celulei care nu mai reușește să traducă
integral informația genetică a virusului.
Blocarea replicării intracelulare explică interferența heteroloagă dintre diferite virusuri. În
acest caz pătrunderea în celulă a virusului revelator nu este împiedicată, dar virusul
inductor inhibă replicarea și biosinteza intracelulară a acestuia.
 PERFECTAREA HĂRȚILOR GENOMICE
1. Metode genetice - plasarea caracterelor specifice
genetice (markeri) liniar prin:
- recombinare: depinde de distanta dintre gene.
- reasociere: detectarea segmentelor parentale pe progeni
2. Metode fizice și biochimice
 la v. ARN:
- endonucleaze de restricție: clivează catena ADN la o
secvența nucleotidică specifică.
- Analiza și clonarea genelor cu aplicarea
antibioticului Pactamicina, care inhibă sinteza anumitor
proteine virale.
HĂRŢILE GENETICE ALE VIRUSURILOR
 Este reprezentarea schematică a mutaţiilor virusurilor dispuse în ordine
lineară cu indicarea distanţelor dintre ele. Se obţin în baza analizei
recombinaţionale.
 Hărţi recombinaţionale.
 Hărţi de schimb a segmentelor.
 Harţi restricţionale.
 Harţi fizice (heteroduplexe).
 Harţi transcripţionale.
 Harţi translaţionale.

NB!
Aplicarea virusurilor în ingineria genică,
de sinestătător!
Vă mulţumesc pentru
atenţie