ROMÂNIA

MINISTERUL EDUCAŢIEI NAȚIONALE

ŞI CERCETĂRII ŞTIINŢIFICE
UNIVERSITATEA „VASILE ALECSANDRI” DIN BACĂU
Facultatea de Științe
Str. Calea Mărăşeşti, nr. 157, Bacău, 600115
Tel. ++40-234-542411, tel./ fax ++40-234-571012
www.ub.ro; e-mail: stiinte@ub.ro

Analiza genomului
Hibridizarea acizilor nucleici

Biolog masterand: Huțuțui Georgiana Mădălina

Anul I
Specializare: Biologie medicală

-2017-
 Hibridizarea

Procesul prin care se realizează

renaturarea a două catene de ADN sau
ARN provenite de la molecule diferite,
rezultând molecule bicatenare de tip:
ADN:ADN, ADN:ARN, ARN:ARN.

Fig.1 Hibridizarea acidului nucleic

https://wec4life.wikispaces.com/Nucleic+Acid+Hybridization
 Principiul metodei și caracteristicile unei sonde moleculare
Atașarea unei sonde de ADN monocatenar la secvența țintă a unui
cromozom, pe baza complementarității.

Dimensiuni:
10-10000 nucleotide

Sa nu contina
Să nu hibridizeze cu
Sonda moleculară complementaritate
non-ținte
intracatenara

Marcate cu:
Decelabile dupa
-izotopi radioactivi
hibridizare -compusi
neradioactivi
 Sinteza chimică sau
enzimatică (PCR) marcată Strategii de marcare:
Sonda
Izolarea și
moleculară
Digestia purificarea (secvente oligo- sau 1.Marcare directă-enzimele legate
acidului secventelor polinucleotidice) prin intermediul unui spacer
nucleic cu nucleotidice 2.Încorporare enzimatică
endonucle
aze de 3.Introducerea de haptene
restricție
4.Fotomarcarea ADN și ARN
5.Marcarea în cursul sintezei
6.Marcarea cu chelați fluorescenți
ai lantanidelor
7.End-labelling enzimatic
Obținere sonde moleculare
8.Acidul nucleic-țintă
 Strategii de
hibridizare

Tehnici în fază
solidă

Southern-blot Hibridizarea in Hibridizarea

dot-blot hibridizarea Northern-blot sandwich-hibridizarea
hibridizarea situ coloniilor

*Transferul Permite analiza Implică un sistem

Fixarea acidului Idem* cu Se aplică simultană a acizilor
nucleic ADN-țintă deosebirea celulelor ca compus din 3
(tratat cu nucleici din elemente: sonda
monocatenar că ținta o atare, fixate multiple colonii
țintă pe suport enzime de constituie sau de captură, legată
restricție și bacteriene, după de faza solidă,
solid. ARN. înghețate, transferul acestora
denaturat) de amprentelor acidul nucleic-
pe gelul de de pe suportul de țintă și sonda
celulare și creștere pe
agaroză pe un culturilor de marcată, care dă
suport solid. membrana de semnalul.
celule. hibridizare.
 Strategii de
hibridizare

Tehnici în soluție

În sistem omogen În sistem heterogen

De 5-10 ori mai rapid decât hibridizarea pe suport solid

 Metode de hibridizare a acizilor nucleici

Metoda FISH Metoda array CGH

Fig.3 Metoda array CGH

Fig.2 Metoda Fish http://www.reprogenetics-hh.de/pages/array-CGH.html

https://www.prlog.org
Metoda FISH
Principiul metodei
Hibridizarea fluorescentă in situ
(FISH) reprezintă o tehnică citogenetică
moleculară utilizată în scopul identificării
anomaliilor cromozomiale, numerice și
structurale.
La secvența-țintă a unui cromozom
se atașează, pe baza complementarității, o
sondă de ADN monocatenar (de circa 40 kb)
marcată fluorescent.
Acest tip de hibridizare este
vizualizat la microscopul cu fluorescență,
dotat cu filtre de excitație și emisie, pentru
facilitarea citirii semnalelor zonei țintă. Sunt
numărate și analizate semnalele prezente în o
sută de celule. Fig, 4. 3 semnale fluorescente care indica
sindromul Down
Sindromul Down este indicat de 3
semnale fluorescente specifice pentru http://www.swus.com.au/amniocentesis
cromozomul 21.
 FISH metafazic
FISH interfazic

sindroame
dismorfice

Produse de microdeleții
Detecția sexului sau microduplicații
Anomalii numerice genetic
(48-72h)
Sindromul Williams,
Prader-Willi, Angelman,
Di George
Se realizează pe nuclei interfazici fără să fie
Presupune ca primă etapă de lucru
nevoie de efectuarea de culturi celulare. Se
obţinerea unor culturi celulare
folosesc sonde de ADN corespunzătoare
(limfocite din sânge periferic sau
regiunilor centromerice ale cromozomilor 18,
amniocite recoltate prin
X, Y (CEP18, CEPX, CEPY), respectiv sonde
amniocenteză în săptămânile 15-17
locus specifice pentru cromozomii 13 şi 21
de sarcină)
(LSI13, LSI21)
Rezultatul investigaţiei este obţinut
în două săptămâni.
Metoda arrayCGH
 Metoda arrayCGH

Specimen recoltat: 6 mL sânge venos.

Recipient de recoltare: vacutainer ce conține EDTA ca anticoagulant.
Cauze de respingere a probei: folosirea unui alt tip de anticoagulant; probe vechi,
coagulate, hemolizate sau contaminate bacterian.
Stabilitate probă: maxim 72 ore din momentul recoltării probei până la intrarea
acesteia în lucru.

Lamele array conţin zeci de mii de sonde care ţintesc multiple gene şi regiuni
cromozomiale.  
Această metodă examinează întregul genom și permite identificarea precisă și
rapidă a unor anomalii cromozomiale neechilibrate asociate cu modificări ale numărului
de copii ADN (microdeleţii şi microduplicaţii)
Identificarea CNV (copy number variants / variații ale numărului de copii ADN).
Acestea se clasifică în 5 categorii:
1.benigne
2.variații cu semnificație necunoscută (VOUS) posibil benigne
3.VOUS cu semnificație incertă
4.VOUS posibil patogenice
5.VOUS clar patogenice.
Fig. 5 Diferite tipuri de
variații ale numărului de
copii (CNV)

Roșu = pierdere de
material genetic
Albastru = câștig de
material genetic
Maro = rearanjament
complex
 Concluzii

Metoda FISH are o sensibilitate și o specificitate de 100%, detecția fiind posibilă

întotdeauna a tuturor anomaliilor numerice ale celor 5 cromosomi: 13, 18, 21, X și Y.
Avantajul acestei tehnici o constituie rapiditatea. Ca si dezavantaj, metoda nu permite
identificarea anomaliilor numerice ale celorlalți cromosomi și nici a anomaliilor
cromosomice structurale.
Metoda array CGH prezintă rata detecției de CNV patogenice la copiii cu retard
de dezvoltare, dizabilitate intelectuală și anomalii congenitale multiple, de 18-20 %, față de
3% prin cariotipul clasic. Detectează duplicații și deleții submicroscopice, rearanjamente
cromozomiale neechilibrate, diferite grade de mozaicism. Spre deosebire de cariotipul clasic,
tehnica array CGH nu necesită cultură celulară.
Ca și dezavantaje, această tehnică nu identifică modificări cromozomiale
echilibrate (translocații, inversii, inserții), mutații punctiforme, mozaicismul de nivel scăzut.
De asemenea, prin această tehnică, nu pot fi furnizate informații despre natura structurală a
anomaliilor identificate. Poate detecta CNV cu semnificație neclară.
 Rezoluție Interogare Detectează Cultură
întreg rearanjamente celulară
genom echilibrate

Cariotip ~5 Mb  DA DA DA
clasic

FISH ~40-250 kb NU DA DA/NU

arrayCGH ~60kb DA DA NU

Secvențiere 1 bp DA NU NU
ADN

Sursă: www.synevo.ro
 Bibliografie
https://wec4life.wikispaces.com/Nucleic+Acid+Hybridization
https://es.scribd.com/document/144223691/Testul-FISH
http://www.saptamanamedicala.ro/articole/Hibrizitatea-fluorescenta.html
http://www.encyclopedia.com/science-and-technology/biology-and-genetics/genetics-and-
genetic-engineering/dna-hybridization
http://lectiidebiologie.ro/2016/03/denaturarea-renaturarea-dibridizarea-adn/
https://www.synevo.ro/testare-genetica-tehnici/
http://www.rasfoiesc.com/educatie/chimie/OBTINERE-de-SONDE-de-ACIZI-NUC61.php
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18432698
http://anatop.usmf.md/wp-content/blogs.dir/164/files/sites/164/2014/08/LP12-Analiza-
genelor.pdf
https://www.synevo.ro/cariotip-molecular-hibridizarea-genomica-comparativa/

Gavrilă Lucian, Genomica, volumul II, Editura Enciclopedică București 2003