Senzori si Biosenzori (II)

Analiza Probelor Biologice Curs 10

Principiul recunoasterii moleculare
+
+
semnal
semnal
analit analit complex complex receptor receptor
TRADUCTOR
Element de bio-
recunoastere
TRADUCTOR
Element de bio-
recunoastere
Semnal
Elementul de biorecunoastere
este imobilizat pe suprafata
traductorului.
Proba continand analit si alti
componenti este incubata cu
biosenzorul (A), analitul se
leaga in mod specific cu
elementul de
biorecunoastere si un
semnal este produs de
traductorul (B).
In cel de-al doilea exemplu,
proba nu contine analit ci
numai alti compusi (C).
Niciun semnal nu este obtinut
dupa incubare, din moment
ce nu are loc nicio interactie
intre elementul de
biorecunoastere si celelalte
componente.
Semnal
proportional cu
concentratia
analitului
Nu s-a obtinut
niciun semnal din
moment ce niciun
analit nu a fost
prezent
Legenda
Elementul de
biorecunoastere
Traductor
Analit
Alti compusi din
proba
A B
C D
Analiza directa cu biosenzori
Sunt nite senzori de mas extrem de
sensibili, capabili s msoare diferne de
ordinul nanogramelor.
QCM-urile sunt dispozitive piezoelectrice
fabricate dintr-o plcu subire de cuar, cu 2
electrozi de aur pe fiecare parte a plcuei
Cuar Electrod de aur
Electrod de aur
(partea ce msoar)
Aur (Au)
Platin(Pt)
Argint(Ag)
Ligand Contra-ligand
Anticorp Antigen, virus, celul
Inhibitori Enzime (liganzii sunt de obicei
analogi de substrat sau de cofactori)
Receptori Proteine membranare, celule
Acizi nucleici Proteine de legtur a acizilor
nucleici (enzime sau histone)
Hormoni, vitamine Receptori, proteine transportoare
antigen - anticorpi
protein - protein
contraligand - ligand
enzim - substrat
receptor - ligand
Moleculele pot fi imobilizate:
pasiv prin adsorbie prin interacii:
Hidrofobe
Ionice
Covalent prin reacii cu grupri specifice
Cea mai bun metod e imobilizarea
covalent (unele suprafete adsorb slab sau
nu pot adsorbi deloc), astfel crete si
activitatea biomoleculei, reducnd adsorbia
nespecific, i crescnd stabilitatea
Densitatea pe suprafa a liganzilor
trebuie optimizat
Densiti reduse dau un semnal
corespunztor redus
Densiti ridicate pot da interferene sterice
ntre liganzii moleculelor imobilizai steric,
mpiedicnd accesul la moleculele int
1) Situsuri active.
2) situsuri inaccesibile.
3) situsuri inaccesibile cnd situsurile vecine sunt
ocupate.
4) situsuri legate si restricionate
Modificarea suprafeei electrozilor de aur
pentru a crea grupe funcionale
Descarcare corona
Scufundare in agenti corozivi
Depunere electrochimic
Modificarea biomoleculelor petru legarea
covalent de suprafaa electrodului
Curarea suprafeei
Soluie chimic
Imobilizarea
biomoleculelor
Proteine
ADN-ss
Adiia agentului de blocare
Glicerin
6-mercapt-1-hexanol
Etanolamin HCl
Proteine
ADN-ss ADN-ss
Proteine
Interacia cu lanul
complementar
Proteine
ADN-ss ADN-ss
Proteine
Interacia cu
antigenul
Cristalele curate au fost
imersate intr-o soluie de etanol
i acid 16-mercaptohexanoic
(MHDA).
Cristalele modificate-MHDA au
fost tratate cu EDC NHS-
(carbodiimid) (N-
hidroxisuccinimid) pentru a
activa grupa terminal a
acidului carboxilic ntr-un ester
NHS.
Dup splare cu ap i uscare,
au fost adugai anti anti- -E coli E coli
O157:H7 (antigeni) pe electrozii
de aur i inui la 4 C (cel putin
15h). Excesul de anticorpi a
fost spalat cu PBS
EXEMPLE
Feritinele sunt o clas de proteine de depozitare larg rspndite la
vertebrate, neertebrate, plante, fungi i bacterii. Principala lor funcie este s
acumuleze i s detoxifice fierul intracelular. La concentraii ridicate de fier,
feritina poate fi disproporional de crescut. Nivelul ridicat de feritin se tie
c este un markerr nespecific al proceselor inflamatorii i neoplasmidice.
Concentraii ridicate sunt asociate cu diferite tumori :
Cancer de sn
Carcinoame celulare renale
Carcinoame hepatocelulare
Cancer de laringit
Neoplasmide maligne de maxilar, etc.
Sau cu boli precum:
Infecii cu HIV
Leucemie
Sindromul hemopatologic reactiv
Feritinele
Sa dezvoltat un nou imunosenzor ce
folosete anticorpi umani anti anti- -
feritin feritin(Abs) (Abs) imobilizai pe plcue
de aur al QCM.
Unele din avantaje ar fi : sensibilitate
ridicat, specificitate ridicat,
necesit un numar redus de probe,
reutilizare ridicat.
Cristalul a fost imersat ntr-o soluie
de cistamin.
n continuare a fost imersat ntr-o
soluie apoas de glutaraldehid.
apoi cristalul a fost imersat ntr-o
soluie de anticorpi (Ab) (IgM).
Cristalul a fost blocat cu o soluie de
glicerin-PBS.
EXEMPLE
Arta manipulrii atomilor individuali i a moleculor
pentru a construi stucturi cu proprieti dirijate
Construcia acestor stucturi necesit inventarea unor
dispozitive de asamblare la nivel nanometric
Capacitatea ansamblurilor de a se autopreplica este o
cerin de baz a sistemelor nanometrice
Este un domeniu interdisciplinar ce reunete cunotine
din domenii precum fizic, chimie, biologie, matematic,
tiina materialelor, etc.
Este stucturat pe dou dimensiuni, Nanotiine i
Nanoinginerie
Nanofabricaie, nanomecanic, nanorobotic,
nanocompozite i compozite nanostructurate,
nanobiotehnologie, nanomedicin, medicamente
inteligente, textile inteligente, biosenzori,
sisteme microelectromecanice (MEMS),
sisteme nanoelectromecanice
(NEMS),electronic molecular, microfluidic,
Conexiunea dintre ramurile nanotehnologiei o
constituie MEMS i NEMS, discipline noi create
odat cu dezvoltrile din nano i microlitografie,
microelectronic i stereolitografie
Legile fizice nu ngrdesc posibilitatea de a dezvolta
structuri i uniti la o scar foarte mic, de dimensiune
nonometric
Structurile de dimensiuni nanometrice sunt mai
compacte, mai uoare, mai rapide i mai ieftine
Necesit o energie de funcionare mai redus dect
unitile la scar micro
Ofer posibiliti inedite, cum ar fi un control la nivel
molecular
Cu ct dimensiunea se reduce cu att fenomenele
cuantice sunt mai pronunate, iar defectele sunt mai
puin pronunate
NEMS sunt caracterizate de dimensiuni cuprinse ntre 1
nm i 100 nm i spre deosebire de MEMS dimensiunile
mici sunt relevante pentru aplicaia unitatii nanometrice
dezvoltata
Metodele de construcie folosite sunt top-down(de la
mare la mic) precum i bottom-up(de la mic la mare)
Limita de miniaturizare a structurilor va fi cand fiecare
structur va fi definit la nivelul moleculelor i atomilor,
cnd partea activ a structurii va fi o molecul sau un
atom
Dezvoltarea NEMS se afl ntr-un stadiu incipient i
deocamdat doar structuri elementare bazate pe
nanostructuri n faz solid sau nanofluide au fost
dezvoltate
Nanotehnologii la nivel celular i molecular
Proprieti electrice i mecanice ale celulelor i
moleculelor
Dezvoltarea dispozitivelor Lab-on-a-chip cu ajutorul
MEMS i NEMS pentru manipularea celulelor
Dezvoltarea biosenzorilor pentru detecie molecular
i studiul rspunsului celulelor la diferii stimuli
Biosenzor-dispozitiv sensibil la un stimul fizic sau chimic
(cldur, aciditate, metabolism etc.) care transmite
informaii despre procesele vitale
Microbiosenzori
Nanobiosenzori
Micro si nanobiosenzori reprezinta in mod cert
una din directiile viitoare din domeniul
biosenzorilor.
Posibilitatile par nelimitate atunci cand
combinam aceste arii diferite si sperantele
rezolvarii problemelor curente: prepararea
probelor, portabilitate, detectia moleculelor,
pana la viteze analitice veritabile si fiabilitate.
Multe obstacole tipice pentru subsisteme si
pentru senzori bioanalitici vor trebui depasite
pentru a indeplini toate aceste cerinte.
Realizari recente:
dezvoltarea unui sistem complet automat de
preparare a probelor pentru detectia
organismelor patogene.
dezvoltarea unei biosenzor bazat pe fibre optice
folosind bacteri recombinate pentru detectia
toxicitati mediului.
dezvoltarea unui microsenzor in care anticorpii
au fost discret imobilizati pe o varietate de
suprafete, prin aceasta asigurandu-se o
separare a elementelor de biorecunoastere.
BIOCHIPUL
-lab on a chip-
Biosenzorul identifica
prezenta sau absenta a
33 de specii animale
diferite in orice produs
alimentar prin detectia
secventelor ANDspecifice.
Aplicare:
Sanatate, Economie, Legalitate, Religie
Electrozii
Detectie
multipla
Biozenzori
Eliberarea controlata
Bazati pe
chipuri/arrays
anticorpi,
probe bazate pe
activitate, suprafete
activate chimic
Utilizarea
Utilizarea
biochipurilor
biochipurilor
cu ADN
cu ADN
Detectia Detectia polimorfismului polimorfismului apo apo- -lipoproteinei lipoproteinei E din E din sangele sangele uman uman
Detectia Detectia genelor genelor specifice specifice legate de legate de speciile speciile de de Mycrocystis Mycrocystis
Denaturarea Denaturarea oxidativa oxidativa a ADN a ADN
Detectia Detectia hibridizarii hibridizarii ADN legate de ADN legate de virusul virusul hepatitei hepatitei B B
Interactia Interactia intre intre AND AND cu: cu: echinomicina echinomicina, , mitomicina mitomicina, , tiotepa tiotepa, ,
complexul complexul Cu(II) Cu(II)- -mitoxantrona mitoxantrona
Determinarea Determinarea originii originii unor unor boli boli
IN ANALIZA CLINICA: IN ANALIZA CLINICA:
Detectia Detectia aminelor aminelor aromatice aromatice toxice toxice
Detectia Detectia aducturilor aducturilor formate formate intre intre benzo[ benzo[ ]pyrene ]pyrene si si ADN ADN
Detectia Detectia interactiei interactiei intre intre ADN ADN si si carboplatinici carboplatinici
Detectia Detectia substantelor substantelor mutagenice mutagenice: :
atrazina atrazina, PCB, PAH, , PCB, PAH, bifenoli bifenoli, , daunomicina daunomicina, , aflatoxina aflatoxina B1 B1
Exemple de biosenzori
Test de sarcina
Detecteaz Detecteaz proteina proteina hCG hCG din din urina urina. .
Interpretarea Interpretarea si si analiza analiza datelor datelor se se efectuate efectuate de de
catre catre utilizator utilizator. .
Dispozitiv de monitorizare a glucozei
(pentru pacientii cu diabet zaharat)
Monitorizeaza nivelul de glucoz din sange.
Interpretarea i analiza datelor sunt efectuate
de catre un microprocesor.
Biosenzor pentru depistarea
bolilor infectioase
Analiza datelor si interpretarea
acestora este realizata de
catre un microprocesor
Biosenzori Wireless
MOLECULA TINTA
Acetaminophen
Nanobiosenzori
Detectia Listeria
din sange
n imaginea din stanga (f=2MHz) se observa amestecul celor dou
tipuri de celule supuse fenomenului de separare electrica.
n imaginea din dreapta (f=20MHz) se observa E.Coli E.Coli n apropierea
marginei electrozilor i Saccaromyces Saccaromyces departe de marginea electrozilor
(cmp electric minim).
Tehni c a moder n a c r eat devi c e-ur i
c ar e au ur mat oar el e avant aj e:
Foar t e mi c i
Por t abi l e
Usor de ut i l i zat
I ef t i ne
Identificare natural
Identificare artificial
Producerea receptorilor olfactivi
Fabricarea nanoelectrozilor
Transferul proteinelor pe nanoelectrozi
Interpretarea semnalului electric al proteinelor
Interpretarea semnalului electric al nanobiosenzorilor
Integrarea unor nanosenzori diferiti in retele
Performan
Specificitate/Selectivitate: Combinarea mai multor receptori
olfactivi poate duce la un nivel ridicat al selectivitatii
Percepia: Mamiferele pot detecta sute de mirosuri diferite
Pragul fiziologic minim: de la 10
-14
M
Aplicaii
Medicin: detectarea mirosului agresiv al corpului n scopul
depistarii unor boli
Protecia mediului: monitorizarea on-line a proceselor
industriale de mediu
Securitate: identificarea prin miros
Controlul calitii alimentelor: uniti portabile accesibile ca
pre folosite pentru controlul alimentelor
Siguran: roboi pentru recuperarea oamenilor care au suferit
accidente
Receptorii olfactivi sunt instabili odat ce sunt
extrai din membrana lor biologica, astfel
proteinele trebuie sa fie introduse in membrane
Paii pentru transfer
1. Funcionalitatea metalului din care sunt construii
nanoelectrozii
2. Prepararea unei membrane artificiale n care va fi
introdus proteina (tehnica Langmuir)
3. Transferul membranei pe nanoelectrod (tehnica
Langmuir-Blodgett)
Recunoasterea moleculara se realizeaza prin componenta din
senzor formata din o molecula gazda (proteina) ce se leaga
selectiv cu analitul tinta (oaspete) ce urmeaza a fi identificat
(odorizantul).
Secvene de domenii
hidrofobe i hidrofile
Structura membranar
Sunt cuplai la o proteina
Sistemul receptorilor olfactivi
poate fi format din drojdii,
celule ale mamiferelor, celule
ale insectelor
Ridohpsina Ridohpsina bovina bovina este o
protein deja testata pentru
un astfel de receptor