TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT

(PRINCIPIILE TEHNICILOR DE CLONARE

ŞI ANALIZĂ A ADN)

- programul “Proiect genom uman” (Human Genome Project)

(1990 – 2005);
-obiective principalele:
(1) cartografierea genică - stabilirea localizării pe cromozomi
a fiecăreia din cele 20.000-25.000 de gene;
(2) alcătuirea hărţilor fizice - măsurarea distanţei fizice care
separă genele;
(3) secvenţierea – stabilirea ordinii în care se succed cele
•> 3x109 nucleotide ale genomului uman în moleculele ADN.
- ADN recombinant = combinaţii obţinute între anumite secvenţe
de ADN uman /alte organisme şi molecule de ADN bacterian /
alte specii;
- aceste combinaţii noi au capacitatea de a:
- se replica nelimitat → clone de ADN,
- exprima informaţia genetică pe care o conţin într-o
celulă-gazdă.
- 2 mari categorii de tehnici ale ADN recombinant:
● clonarea ADN
● analiza ADN
Hibridizarea acizilor nucleici
- etapă obligatorie a multor tehnci ale ADN recombinant;
ADN extras din celule = dublu catenar → experimental:
► încălzire / tratament alcalin (pH13) → denaturare = desfacerea legăturilor de H
dintre nucleotidele complementare şi separarea
Încălzire, NaOH celor două catene;
Denaturare

► răcire lentă → renaturare = reasocierea

spontană a catenelor (complementaritate);

► răcire bruscă → monocatenele ADN rămân

separate → obţinerea de:
- hibrizi ADN-ADN - între molecule
Răcire,
ADN provenite de la specii diferite sau între
Renaturare
fragmente ADN obţinute artificial (sonde)
- hibrizi ADN-ARN.
Asocierea pe baza complementarităţii a unor secvenţe nucleotidice
diferite ca origine = hibridizare.
Monocatenelor ADN / ARN introduse deliberat în mediul de
renaturare – încorporare marker ► sonde genotipice;
- marcajul: ▪ izotopic (32P, 35S, 125I, 3H) → detectare
autoradiografică
▪ nonizotopic (dioxigenină) → detectare prin cuplarea
sondei cu un agent decelabil prin metoda fluorescenţei
/ colorimetrie

Sensibilitatea şi selectivitatea r. de hibridizare = f. înalte.

 1. CLONAREA ADN

Clonarea ADN = producerea unui număr mare de copii ale unei

secvenţe de ADN pe baza procesului de replicare a ADN.
- in vivo (clonare celulară) - prin procesul natural de replicare
- in vitro (clonare acelulară) - prin reacţia de polimerizare în lanţ (PCR).

A. Clonarea ADN in vivo

- etape:
1) Obţinerea fragmentelor de ADN
● secţionarea ADN cu ajutorul enzimelor de restricţie → fragmente
de ADN care vor fi amplificate şi analizate.
Enzimele de restricţie (ER):
= endonucleaze bacteriene care scindează moleculele ADN (prin
hidroliza legăturilor fosfodiester dintre nucleotide) la nivelul
unor zone strict specifice → fragmente de lungimi variabile =
fragmente de restricţie (FR);
- caracteristică esenţială a ER = specificitatea: o ER îşi exercită
activitatea endonucleazică numai asupra unei anumite secvenţe
nucleotidice (lungime – câteva pb) = situs de restricţie (SR) sau
situs de recunoaştere şi clivare.
Majoritatea ER → secţiuni care nu sunt situate (de obicei) la acelaşi nivel pe cele
două catene ale moleculei ADN → pe o porţiune de câteva nucleotide capetele FR
vor fi monocatenare:
monocatenare la unul dintre capete - desperecheate nucleotidele unei catene, la
celălalt - nucleotidele catenei opuse.
→ importanţă practică:
practică fragmentele ADN generate de o aceeaşi ER (capete coezive),
se pot lega între ele pe bază de complementaritate (chiar dacă au origini complet
diferite) → moleculă hibridă de ADN recombinant.

5’-------TCGA---------GAATTC-----------GGCC---------3’
3’-------AGCT---------CTTAAG-----------CCGG---------5’

   Taq1 – Thermus aquaticus;

Taq 1 EcoR1 HaeIII
Eco R1 – Escherichia coli;
HaeIII – Haemophilus
aegyptus
5’-------T CGA--------G AATTC---------GG CC--------3’
3’-------AGC T--------CTTAA G---------CC GG--------5’
- pentru fiecare ER există în genom numeroase SR; distanţa dintre aceste
SR este f. diferită → o multitudine de FR de lungimi variate (pot fi
separate electroforetic) în urma acţiunii unei anumite ER.

● Altă metodă de a obţine fragmente de ADN / gene utilizează ARN

mesager:
= produsul de transcripţie al genei;
- extras dintr-o celulă care îl sintetizează în cantităţi mari;
- molecula monocatenară de ARNm = matriţă pentru sinteza unei
catene de ADN complementar (ADNc) (← transcriptaza
inversă)
→ prin complementaritate se sintetizează şi cea de-a doua catenă → o
moleculă de ADNc bicatenar care corespunde exonilor genei.
 2) Formarea moleculelor de ADN recombinant
Vector plasmidic
ADN uman
- fragmentele (FR) ADN uman
→ inserate în vectori de clonare şi
Secţ.
cu
EcoRI Secţionare
Secţionarecu EcoRI
cu EcoRI cu ajutorul lor introduse într-o
celulă-gazdă → multiplicare.
Fragmente de restricţie (FR)
- unirea a două fragmente de
ADN de origini diferite →
Plasmide
moleculă de ADN recombinant:
moleculele de ADN din cele două
Transformare

Unirea FR pe baza
E.coli Celulă transformată
surse sunt secţionate cu aceeaşi
complementarităţii Însămânţarea
bacteriilor - mediu
de cultură cu tet’ ER → capete identice → se unesc
Moleculă de ADN
recombinant
Placă Petri
pe bază de complementaritate;
Colonie rezultată
din bacteriile fragmentele sunt legate cu
transformate,
rezistentă la tet’
ADN-ligaza.
Vectorii:
= molecule naturale ADN care transportă sevenţele ADN de analizat
- se replică independent de genomul gazdei.
- tipuri principalele:
► Plasmide:
= componente ale bacteriilor → conferă rezistenţă la diferite antibiotice;
- alcătuite dintr-o moleculă mică de ADN circular, dublu catenar
extracromozomial (replicat independent de cromozomul bacterian);
► Bacteriofagi:
= virusuri care infectează şi distrug bacteriile;
- alcătuiţi din ADN dublu catenar liniar (replicat independent şi rapid);
- cel mai frecvent - bacteriofagul lambda (λ) (atacă E. coli)
► Cosmide:
= vectori artificiali = hibrizi plasmid - situs cos bacteriofag λ.
Vectorii în care s-a introdus un fragment de ADN exogen = vectori recombinanţi.
3) Transformarea şi amplificarea
Introducerea unui vector într-o celulă bacteriană = transformare.
- moleculele de ADN recombinant - transferate în celule-gazdă (bacterii nepatogene
modificate), în care vectorii recombinanţi se vor multiplica independent de crz.
bacterian → mai multe copii identice.
- bacteriile transformate – multiplicate:
- în cazul utilizării vectorilor plasmidici - celulele bacteriene însămânţate pe
o placă de agar în care se plasează şi o genă de rezistenţă la antibiotic + antibioticul
faţă de care s-a indus rezistenţa → bacteriile transformate → rezistente → continuă
multiplicarea → fiecare formează o colonie sau clonă (= populaţie de celule
identice, provenite dintr-o singură celulă).
Plasmid
Moleculă de ADN Placă Petri
recombinant

Transformare
E.coli
Celulă transformată
Colonie rezultată din
Însămânţarea bacteriile transformate,
bacteriilor - mediu rezistentă la tetraciclină
de cultură cu
tetraciclină
- totalitatea coloniilor - FR clonate (conţin şi ADN de analizat) → bancă sau
bibliotecă ADN (DNA library):
- în funcţie de colecţia de FR pe care o conţin:
- biblioteci ADNc (cuprind numai secvenţele nucleotidice ale genelor
active transcripţional)
- biblioteci genomice.
Clona care conţine FR de interes nu are nici un caracter distinctiv (bibliotecile
sunt „fără catalog”) → screening-ul sistematic colonii / plăci de liză;
→ secvenţa căutată poate fi identificată:
▪ direct (hibridizare cu sonde complementare)
▪ indirect (purificarea proteinelor produse de clonele bacteriene +
recunoaşterea lor cu anticorpi monoclonali).
Amplificarea prin clonare - procedură laborioasă, complicată şi mare
consumatoare de timp.
 5’ 3’
ADN-
polimeraza
+
amorse
b. Clonarea ADN in vitro - Reacţia
Taq I
polimerizării în lanţ (PCR – polymerase
Încălzire,
chain reaction)
5’ 3’
denaturare,
hibridizare Principiu: replicarea semiconservativă in vitro
Ciclul 1

amorse
- extrem de simplă, rapidă, economică şi complet
Taq adaugă
nucleotide automatizată.
la amorse
Eşantionul ADN - în cantitate foarte mică, introdus
Încălzire într-un tub cu următorii reactivi:
Denaturare
Ciclul 2

● ADN - polimerază termostabilă – Taq

Polimerizare
● 4 dezoxiribonucleotide trifosfat
● 2 oligonucleotide sintetice = amorse (primeri):
Repetare
ciclu - secvenţa nucleotidică - complementară cu
secvenţele ADN care flanchează capetele
segmentului de amplificat;
- la nivelul lor - iniţiată activitatea ADN-pol.
 5’ 3’
ADN-
polimeraza
+ Etape:
amorse
Taq I
1) denaturarea termică (95°C) a segmentului ADN

5’
Încălzire, 3’
de amplificat → amestec de fragmente
denaturare,
hibridizare monocatenare;
Ciclul 1

amorse

Taq adaugă 2) răcire uşoară → amorsele se poziţionează şi

nucleotide
la amorse hibridizează cu secvenţele complementare
(situate
Încălzire
Denaturare la capătul 3’) de pe fiecare catenă;
3) pornind de la amorse, ADN-polimeraza începe să
Polimerizare
adauge dezoxiribonucleotide în sensul 5’-3’ pe
Repetare
ciclu matriţe (= monocatenele segmentului ţintă).

Reîncălzirea mediului → iniţierea unei noi reacţii de

polimerizare.
- procesul = ciclic: la sfârşitul a n cicluri, în mediul de reacţie - 2n molecule ADN
dublu catenar (copii ale secţiunii ADN dintre amorse).
- cantitatea optimă - < 30 cicluri de reacţie → în tub există câte 109 copii ale
secvenţei iniţiale, obţinută în ~ 3 ore (durata unui ciclu = 5 minute).
- surse ADN:
ADN celule din frotiuri, pete de sânge, spermă, foliculi piloşi etc.
- dezavantaje majore metodă:
- necesitatea cunoaşterii secvenţelor capetelor ADN-ţintă (pentru
fabricarea amorselor);
- cantitatea foarte mică de produs;
- frecvenţa destul de mare a erorilor de împerechere.

Metoda PCR - aplicată şi pentru molecule de ADNc = RT-PCR

(reverse transcriptase PCR)
 2. Metode de analiză a acizilor nucleici

Analiza ADN: - studiul structurii genelor şi a genomului uman;

- studiul bolilor (← mutaţii ADN) + dg. unor boli
→ genele din bibliotecile ADN - recunoscute pe baza principiului
hibridizării acizilor nucleici.
a) Analiza ADN genomic uman prin tehnica Southern blot
FR umane (câteva sute de mii): separate prin metoda electroforezei
în gel: moleculele ADN – încărcate electric (-) → migrează către
anod (viteză 1/~cu GM) → FR separate electroforetic se dispun într-
un ansamblu de benzi ADN:
- invizibile în gelul de agaroză → impregnarea cu colorant
specific - bromura de etidiu (devine fluorescent în lumina UV).
Analiza structurii FR - metoda marcării radioactive a ADN =
Southern blot
Etape:
1) fragmentarea ADN genomic (extras din celule) cu ER
corespunzătoare;
2) separarea FR prin electroforeză (pe baza dimensiunii lor);
3) denaturarea chimică a fragmentelor ADN bicatenare incluse în gel;
4) transferarea prin capilaritate (blotting) a monocatenelor de pe gel
pe membrană de nailon / nitroceluloză → o copie a modelului de
benzi din gelul de agaroză;
5) hibridizarea moleculelor ADN de pe membrană cu o sondă marcată
radioactiv (complementară cu secvenţa urmărită) → complexe dublu
catenare stabile în zonele în care se află secvenţele complementare;
6) detectarea autoradiografică a complexelor dublu catenare (contact
cu un film foto).

Importanţă:
- evidenţierea prezenţei / absenţei unui fragment de ADN-ţintă.
- detectarea polimorfismelor lungimii fragmentelor de restricţie → dg.
ADN indirect.
Aceeaşi procedură - şi pentru ARN (= Northern Blot) sau proteine (=
Western Blot).
 Moleculă ADN

Enzime de restricţie

Fragmente de restricţie (FR)

Electroforeză în gel

FR separate după GM
+ denaturate chimic

Membrană
nitroceluloză Benzi ADN
Gel cu benzi ADN

Gel Filtru
Tampon Nitroceluloză

Material absorbant

Transferul FR pe
membrană
Membrană
nitroceluloză cu
FR ce reproduc
benzile din gel

Hibridizare cu sondă
radioactivă

Autoradiografie
b) Analiza cu sonde oligonucleotidice specifice alelelor (allele
specific oligonucleotides - ASO)

- important: dg. b. monogenice produse de mutaţii cu bază moleculară cunoscută;

- utilizează ca sonde 2 / mai multe oligonucleotide sintetice (15-20 pb) care
corespund (în sensul complementarităţii bazelor) :
- una secvenţei genice normale
- celelalte secvenţelor modificate prin mutaţie.
- utilizată în dg. prenatal al unor afecţiuni produse de mutaţii punctiforme
- ex. anemia drepanocitară ← mutaţia punctiformă a codonului 6 – GAG
al genei care codifică lanţurile -globinice ale Hb → codonul GAG se
transformă în GTG → substituirea Glu cu Val în poziţia 6;
- pentru diagnostic se utilizează:
● sondă (CTC) complementară cu secvenţa genei normale
● sondă (CAC) complementară cu secvenţa genei patologice;

→► hibridizarea ADN extras din celulele lichidului amniotic numai

cu sonda specifică mutaţiei → afectare fetală certă;
► hibridizarea cu ambele sonde → starea de heterozigot;
► reacţia negativă cu sonda pentru gena patologică → excluderea
bolii.
c) Hibridizarea in situ
= hibridizarea sondelor marcate izotopic/chimic cu secvenţele
specifice din moleculele ADN/ARN → vizualizare direct pe
preparatele celulare sau cromozomiale;
- dezavantaje: rezoluţie insuficientă şi durată mare obţinere rezultate
→ abandonarea tehnicilor care folosesc probe marcate radioactiv →
tehnica FISH (fluorescence in situ hibridization) sau hibridizare in
situ prin marcare fluorescentă:
- relativ simplă şi nu foarte costisitoare;
- fluorocromi utilizaţi: acidul 7-amino-4-metilcumarin-3
acetic (AMCA), fluoresceina, Texas red;
- aplicată în citogenetica moleculară pentru:
▪ analiza nucleilor interfazici sau a cromozomilor metafazici
cu sonde ADN;
▪ “pictarea” cromozomilor (chromosome painting) – detectează
cromozomi singulari sau numai părţi componente (cen, t);
▪ detectarea întregului genom
ex. M-FISH (24 culori).