Metode de studiu ale acizilor nucleici:

Toate se bazeaza pe tendinta normal a secventelor complementare de hibridiza=> adaugarea unor

fragmente ACTG marcate cu fluorocromi intr-un amestec AND va conduce la legarea lor de toate
secventele complementare TGAC

SCOP:

- Detecteaza modificari ale materialului genetic (mutatii, deletii, translocari)

- Prezenta unor organisme straine+tipul acestora (virusuri, bacterii, tulpini patologice)
- ADN fetal izolat din sangele matern
- ADN liber, circulant

1.PCR

=metoda folosita pentru obtinerea unui numar de copii ale unei gene, suficient de mare incat sa lege un
numar de molecule fluorescente de marcaj

! Secventa genei trebuie cunoscuta inainte de a se realiza PCR. De ce? Reactia de polimerizare in lant
este initiate de primer-oligonucleotide customizate care se leaga specific de anumite secvente din
structura ADN!

DE CE SE FOLOSESTE PROSTIA ASTA:

- Identificarea unei mutatii, folosind primeri customizati, complementari cu secventa mutant

- Identificarea unei allele modificate prin deletii/ aditii
- Detectarea de ADN viral/bacterian pt: diagnostic de infectie +evaluarea eficacitatii unei terapii

REZULTAT PCR:

-cantitativ: nr de copii ale genei detectate

-calitativ: detectarea unei deletii/ aditii- pt vizualizarea rezultatului se face ELECTROFOREZA !

2. ELECTROFOREZA

=metoda de separare a unor molecule dintr-un amestec intr-un camp electric

- Sarcina acizilor nucleici este (-)+ separarea lor se face in functie de dimensiunea fragmentului
analizat=nr de perechi de nucleotide care il formeaza
- Vizualizarea? Adaugarea unei substante fluorescente care se leaga de ADN dc

!!! qPCR( quantitative)

-masoara expresia genica +gradul de activarea al unei gene => cantitatea de ARNm dintr o proba

CUM? Este la fel ca PCR numai ca precedat de revers-transcrierea ARNm-> ADN c si poliomerizarea in
lant a acestuia
4. SECVENTIEREA GENICA next generation sequencing

-metoda de identificare a unei secvente de nucleotide intr-o gena/ fragment de AND

-utila in identificarea mutatiilor noi, necunoscute

-CUM SI AICI? Adaugare de nucleotide marcate cu fluorocromi, fiecare marcata cu un fluorocrom diferit
si sintetizarea unei catene complementare pe baza unei secvente necunoscute. Astfel, succesiunea
culorilor va oferi secventa initiala!

5. HIBRIDIZARE IN SITU

-se localizeaza o gena/ secventa de and pe cromozomi

-SE FOLOSESC SONDE AND MARCATE FLUORESCENT =FISH

-pt diagnosticul unor modificari deja cunoscute ca fiind asociate unei boli

Distributia normal presupune: prezenta a doua marcaje de interes (pt fiecare alela) asociate sondei
specific cromozomului pe care sunt localizate

6. HIBRIDIZAREA GENOMICA COMPARATIVA

=se pot detecta modificari la nivelul INTREGULUI GENOM al probei ( deletii/ insertii de fragmente
cromozomiale) comparative cu un control

-identificarea de novo a unor defecte cromozomiale

Manipularea materialului genetic in scop therapeutic:

CUM? – transfectii ( cu plasmide bacteriene )/ infectii ( cu virusuri)- introducerea unei noi secvente de
AND

-editarea sau excizia unui segment de AND

a) transfectii+ infectii

- se folosesc pentru producerea de proteine recombinante utilizate in terapiile biologice ( insulin,

eritropoietina )

-culturile bacteriene sunt transfectate cu plasmide continand gena proteinei de interes => bacteriile vor
produce proteina umana cu propriul system de sinteza si o vor elimina in mediu de unde va fi purificata
ulterior

b) editarea genica

=metoda prin care se elimina/ se adauga/ modifica punctiform un fragment de And dintr o celula cu
ajutorul unei nucleaze , ghidata la destinatie de o secventa de ARN customizata
PRINCIPIUL METODEI: Enzima Cas9, capabila sa taie AND, va fi directionata cu ajutorul unei secvente
complementare catre gena de interes. O data legata, ea va taia gena de interes. Celula va folosi propriile
mecanisme pt repararea catenei de AND.

Terapia genica:

=introducerea unor gene in organism, pt corectarea unui defect ( o deletie/ suplimentare de gene
inactive)

-curierul: virusuri care patrund in celula si se insereaza in genom- de obicei sunt utilizate adeno
associated viruses

CONS: nu se poate controla locul de insertie al virusului in genom si distributia sa la nivel tisular

Metode de studio al proteinelor :

Fenotipul morfologic cellular este sustinut de fenotipul proteic =combinatia specifica de proteine
produse de celula

Impachetarea cromatinei sau interferentele ARN pot modifica expresia genica

Structurile proteinelor:

-primara: liniara,prezinta ordinea aa in lantul polipeptidic

-secundara: elice a si pliuri b

-tertiara: mai multe structure secundarea sunt conectate spatial in motive structural ( buzunar
enzymatic, motiv de legare de AND), unite prin regiuni de tranzitie

-cuaternara: mai multe strct. tertiare sunt asamblate in di tri nmeri+- grupari prostetice adaptate
functiei proteice

Buzunar enzymatic

-are o zona de acomodare a structurii si o zona catalitica

Zona de acomodare- format din mai multe a elice legate intre ele prin oligonucleotide nestructurate

Zona catalitica – mai multe zone de a elice care inconjoara structure de b pliu. In mijloc -> domeniul
catalytic

-aplicatii clinice: pt implicarea lor in cancer- kinase (au un buzunar enzymatic in care leaga specific ATP-
ul pt a-l folosi la fosforilarea substratului

=> s-au creat inhibitori de kinase prin adaugarea unei molecule sintetice mici in buzunarul enzymatic

Motivul de legare AND- BAZIC: elice-bucla-elice

-prezinta: regiunea de dimerizare+ regiunea de legare de AND( predominand aminoacizi bazici)

Metode de studiu ale proteinelor:

1. Separare +purificare
2. Caracterizare a structurilor
3. De identificare
- Bazate pe fizico-chimic (masa, sarcina electrica, capacitate de ionizare, Pi, spectrometria de
masa)
Interactiuni enzima-substrat
- Bazate pe anticorpi- imunomarcarea, imunofluorescenta, imunoelectronomicroscopie, elisa,
western blot, imunofenotipare, citometrie in flux
4. Metode de studio al efectului biologic

PENTRU CE SUNT FOLOSITE?

-izolare/caracterizare/identificare/ (semi-)cuantificare unei singure protein

-detectarea/semi cuantificare unui set de protein

-analiza compozitiei proteice a unui produs biologic

Materia prima:

-solutie de protein (=lizate proteice), extrase din celule tratate cu detergent. DE CE? Pentru a asigura
extractia si a proteinelor membranare.

-produse biologice

!!proteinele membranare, spre deosebire de cele citosolice, au domenii hidrofobe care interactioneaza
cu bistratul lipidic => solubilitatea lor in solutii apoase este scazuta.

Electroforeza

CUM FUNCTIONEAZA AICI? Separarea, intr un gel cu ochiuri de diverse marimi sau in faza fluida, folosind
un camp electric, a proteinelor dintr-un amestec, pe baza proprietatilor fizico-chimice

- Electroforeza SDS-PAGE( sodium duodecilsulfat in poliacrilamida-gel)=> GREUTATE

MOLECULARA
- Sarcini electrice- izofocusare+ electroforeza capilara

Pt identificarea structurii proteice:

-structura tridimensionala: cristalografia cu raze X, crioEM

- modificari de structura 3D care apar la activarea proteinei

CRISTALOGRAFIA CU RAZE X:

-imprastierea razelor X la trecerea printr-o proteina cristalizata det. aranjamentul tridimensional al

atomilor

-cu softuri speciale -> model de structura tertiara

-cristalizarea se face in solutie, de aceea metoda este realizabila doar pt proteinele citosolice
(hidrosolubile)

CrioEM

-MET prin care fluxul de e- strabate o proba necontrastata, tinuta la temperature de -190 C in azot lichid

-sunt achizitionate multe imagini care sunt suprapuse pt reducere zgomotului+crestere contrast

-DE CE FOLOSESC? Analiza structurii native a unei proteine, care sunt prea mari pt a fi cristalizate
efficient

! +se pot analiza si proteina membranare!!

Alegerea metodei depinde de contextul biologic. Ex: unele proteine sunt in cant mari in conditii
fiziologice (albumina plasmatica)+ usor de detectat prin diverse metode, altele sunt putin exprimate, dar
aeasta situatie se poate schimba in procese patologice (anticorpi in anumite infectii)

SPECTROMETRIA IN MASA:

=transformarea ionilor din faza lichida -> ioni in faza gazoasa, accelerarea si separarea acestora in fct de
raportul de masa/sarcina electrica, detectia si inregistrarea spectrului

-folosita in proteomica -> permite identif unui nr mare de protein

-Domenii:

a) Clinic: profil proteic, analiza hemoglobinei, testare pt droguri

b) Biotehnologie: caracterizare puritate compus- spectrul trebuie sa indice prezenta unui singur vf de
detective

evaluarea stabilitatii in timp a unui produs- proteina recombinanta instabila/ sufera proteoliza- vf cu
masa din ce in ce mai mica

METODE DE CUANTIFICARE:

-absolute-unitati SI

-relative-control intern

Principii: -reactie de culoare, masurata prin spectrofotometrie si raportata la o curba standard

-masurarea intensitatii fluorescentei, raportata la un control

Controlul=protein constitutive, produse in mod constant, fara semnale externe : enzyme ale met
glucidic, proteine ale citoscheletului