ELEMENTE DE GENETICĂ MOLECULARĂ

DR. CRISTINA MAMBET

MEDIC PRIMAR HEMATOLOGIE

 GENETICA MOLECULARĂ
▪ Studiul ADN-ului și a altor macromolecule izolate dintr-un
organism

▪ Analizează structura și funcția genelor la nivel molecular

≠ citogenetica – studiaza anomaliile cromozomiale
(numerice, structurale)

▪ Combinație de tehnici care izolează și analizează ADN-ul

sau ARN-ul transcris din anumite gene

▪ Studiază implicațiile modificărilor în structura și secvența

genelor asupra funcției proteinelor codificate

▪ Identifică mutațiile genetice care cauzează diverse boli

 TESTAREA MOLECULARĂ ÎN AFECȚIUNILE
HEMATOLOGICE EREDITARE
Valoare diagnostică în:

▪ Talasemii

▪ Siclemie

▪ Hemofilii

▪ Neutropenia congenitală

▪ Trombocitopenia congenitală
 BENEFICIILE TESTĂRII MOLECULARE ÎN
HEMATOLOGIA ONCOLOGICĂ
▪ Stabilirea sau confirmarea diagnosticului

▪ Evaluarea prognosticului și stratificarea pacienților

în funcție de risc

▪ Monitorizarea eficacității terapiei

▪ Monitorizarea bolii minime reziduale

▪ Administrarea unei terapii țintite în funcție de

anomaliile moleculare detectate
STRUCTURA PRIMARĂ A ACIZILOR NUCLEICI

▪ NUCLEOTID = unitatea de bază

Bază azotată
Pentoză
Grupare fosfat

ADN: adenină (A), guanină (G), citozină (C), timină (T)

ARN: adenină (A), guanină (G), citozină (C), uracil (U)
ADN: deoxiriboză ARN: riboză

Baza azotată + pentoză → nucleozid

Nucleozid + grupare fosfat → NUCLEOTID
STRUCTURA PRIMARĂ A ACIZILOR NUCLEICI
 REACȚIA ÎN LANȚ A POLIMERAZEI (PCR)

▪ Tehnica de bază a geneticii moleculare

▪ Imită in vitro capacitatea naturală de replicare a ADN-ului

▪ Inventator: Karry Mullis 1985 (premiul Nobel 1993)

▪ Amplificarea exponențială a secvențelor specifice de ADN→

copii multiple ale secvențelor ADN

▪ ADN polimeraza termostabilă

▪ Primeri specifici pentru amplificare

REACȚIA ÎN LANȚ A POLIMERAZEI (PCR)
 COMPONENTELE REACȚIEI PCR
1. MATRIȚA ADN
▪ Trebuie să aibă o integritate și o puritate înalte

▪ Cantitate necesară foarte variabilă: 1 ng-1µg

(50-100 ng în 20 µL volum de reacție)

▪ Nr. copii se dublează la fiecare ciclu de amplificare →

AMPLICON (produsul final al amplificării)

2. ADN POLIMERAZA
▪ Termostabilă
▪ Sintetizează moleculele de ADN din deoxiribonucleotide
▪ Taq (izolată din Thermophilus aquaticus)
 COMPONENTELE REACȚIEI PCR
3. PRIMERI
▪ Secvenţe scurte, monocatenare, cu lungimea maximă de 20-30
nucleotide

▪ Complementari cu matrița ADN

▪ Se atașează la capătul 3’ al catenei ADN

▪ Trebuie să conțină un număr egal din cele 4 baze

▪ Trebuie să se evite formarea de dimeri sau de structuri secundare

▪ Temperatura de hibridizare a primerilor trebuie optimizată în fiecare

reacție PCR
 COMPONENTELE REACȚIEI PCR
4. AMESTECUL DE NUCLEOTIDE

dATP, dGTP, dCTP şi dTTP - folosite pentru sinteza noii catene

ADN prin ataşarea lor la capătul primerilor

5. SOLUȚIA TAMPON (BUFFER) A POLIMERAZEI

pH 8.3 (TRIS, HCl, KCl)

6. CLORURA DE MAGNEZIU MgCl2

activează polimeraza

7. APĂ ULTRAPURĂ (FĂRĂ NUCLEAZE)

 ANALIZA ADN-ULUI PRIN ELECTROFOREZĂ

- Tamponul de încărcare conține un colorant (albastru de bromfenol

sau roșu de crezol) pentru vizualizarea frontului de migrare

- Benzile sunt vizualizate cu compuși fluorescenți (SYBR Green I

sau bromură de etidiu) prin iradiere cu lumină UV.
 VERIFICAREA INTEGRITĂȚII ADN

- Gel de agaroză 0.8%

- Marker de greutate moleculară 1kb
- Migrarea ampliconilor sub formă de benzi
compacte → ADN integru
DETECȚIA DELEȚIILOR

Electroforeză ampliconi CALR

DETECȚIA INSERȚIILOR

Electroforeză ampliconi FLT3

 TEHNICA PCR CU ALELE SPECIFICE (ASPCR, ARMS-PCR)

- Utilă pentru discriminarea

unor alele ce diferă între ele
printr-o singură nucleotidă

- 2 reacții PCR: un primer

comun și un primer specific
fiecărei alele

- Un primer care nu este

completar cu matrița ADN
la capătul 3’ va fi refractar
la extinderea lanțului ADN
de către polimeraza Taq

- Rezultă 2 ampliconi de
mărimi diferite ce vor fi
detectați electroforetic
DETECȚIA JAK2 V617F PRIN ARMS-PCR
 ALTE VARIANTE ALE REACȚIEI PCR
NESTED PCR

Constă în realizarea a
două amplificări
succesive, utilizând
două perechi diferite
de primeri, dintre care
a doua flanchează o
secvenţă inclusă în cea
care a fost amplificată
cu prima pereche.
 ALTE VARIANTE ALE REACȚIEI PCR
MULTIPLEX PCR

În reacţie se introduc
mai multe perechi de
primeri.

Permite amplificarea
mai multor secvenţe
de interes în acelaşi
timp.
 ALTE VARIANTE ALE REACȚIEI PCR
REVERSTRANSCRIEREA (RT-PCR)

Se porneşte de la
ARNm.

Utilizează la început o
revers transcriptază
care copiază ARN într-
un ADN complementar
(ADNc).

Urmează o reacţie PCR

clasică folosind drept
matriţă ADNc.
TEHNICA REAL-TIME PCR
Q
Sonda TaqMan dublu marcată:
capătul 5’ - fluorocrom raportor (R)
capătul 3’ – quencher (Q)
Etapa 1: hibridizarea primerilor specifici

Etapa 2: Elongarea (extensia)

Taq cu activitate exonucleazică 5’→ 3’

clivează sonda între R și Q → emitere
fluorescență

Produsul PCR este sintetizat iar semnalul

fluorescent se va acumula la fiecare ciclu
PCR – fluorescența totală emisă va fi
direct proporșională cu nr. copii ale
secvenței ADN țintă
TEHNICA REAL-TIME PCR
 CUANTIFICAREA ALELEI MUTANTE JAK2 V617F
- Un amestec de primeri specifici și o sondă oligonucleotidică dublu marcată pentru
fiecare alelă JAK2 → 2 reacții PCR separate
- Cuantificare: 4 standarde, sub forma unor plasmide în diluții succesive (50, 500,
5000, 50 000 copii alelice/μL), pentru fiecare tip de alelă JAK2
- 2 curbe standard: se calculeaza nr. copii pentru alelă
- V617F% = nr. copii alelă mutantă /nr. total copii JAK2 (alela mutantă + alelă WT)
 SECVENȚIEREA BIDIRECȚIONALĂ SANGER
- Utilizează dideoxinucleotide (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP)
- Atunci când ADN polimeraza introduce în catena ADN nou sintetizată o
dideoxinucleotidă, în locul unei deoxinucleotide normale, extensia lanțului de ADN
va fi stopată → produși de extensie de mărimi diferite, care au la capătul 3’ o
dideoxinucleotidă, ce vor fi separați electroforetic

ddGTP ddATP ddCTP ddTTP

Se adaugă ddGTP, ddATP, ddCTP,

ddTTP câte una în fiecare tub ce
conţine ADN-ul ţintă. Se încarcă fiecare
într-un traseu separat pe gel

Cea mai mare

Pentru secvenţiere se va citi

ordinea de succesiune a
bazelor de la cea mai mică la
cea mai mare.
TCGAAGACGTATC

Cea mai mică

 SECVENȚIEREA SANGER AUTOMATĂ
- Fiecare bază nucleotidică este marcată cu un fluorocrom
- Cromatograma: peak-uri alternative colorate ce corespund succesiunii bazelor în
secvența ADN analizată
 ETAPELE SECVENȚIERII SANGER

- Reacția PCR de amplificare a secvenței ADN țintă

- Electroforeza în gel de agaroză pentru vizualizarea și eventual

extracția din gel a ampliconilor

- Reacția de secvențiere propriu-zisă ( 2 reacții separate de

amplificare cu primerul F și respectiv primerul R)

- Purificarea produșilor de secvențiere

- Separarea fragmentelor ADN prin electroforeză capilară și

detecția emisiei fluorocromilor

- Analiza bioinformatică a secvențelor obținute

Cromatogramă cu evidențierea mutației MPL W515L (A) comparativ cu MPL WT (B)
 SECVENȚIEREA DE NOUĂ GENERAȚIE (NGS)

- Secvențiere paralelă masivă – milioane de reacții de secvențiere în paralel!

- Comparativ cu secvențierea Sanger: este posibilă multiplexarea – sunt secvențiate

simultan mai multe gene (NGS țintită), întregul exom (WES) sau întregul genom
(WGS)

- Sunt secvențiate matrițe ADN amplificate clonal (dintr-un singur fragment)

- Dezavantaj: sunt generate milioane de secvențe ADN (citiri, reads) scurte (45-150
pb) comparativ cu secvențierea Sanger (400- 1000 pb) ce vor trebui asamblate

- Amplificarea de mai multe ori a unei regiuni țintă cu generarea unei secvenții de
consens pentru a crește acuratețea citirilor individuale

- Pentru analiza datelor NGS este nevoie de un număr adecvat de citiri care se
suprapun

- Pot fi detectate variante nucleotidice unice (SNV), inserții/deleții mici

 ETAPELE NGS PE PLAFORMA ILLUMINA

1. Pregătirea „bibliotecilor” de ADN

- fragmentarea aleatorie a probei de ADN genomic
- ligarea unor adaptori specializați la ambele capete ale fragmentelor
 ETAPELE NGS PE PLAFORMA ILLUMINA

2. Generarea „clusterelor”

- Încărcarea bibliotecii ADN pe o

micromatrice de sticlă ce conține
sute de mii de oligonucleotide
complementare cu adaptorii ligați,
capabile să capteze
fragmentele de ADN

- Ambele capete ale fragmentelor

ADN pot hibridiza, astfel că fiecare
fragment legat va fi amplificat
„în punte” într-un cluster clonal
(mii de copii ale unui fragment ADN)
 ETAPELE NGS PE PLAFORMA ILLUMINA

3. Secvențierea prin sinteză

- metodă reversibilă ciclică de terminare a lanțului ce detectează individual bazele

marcate fluorescent, pe măsură ce acestea sunt încorporate în catena nou formată
pe baza secvenței de ADN țintă
- vor fi secvențiate ambele capete ale fragmentelor de ADN dintr-o bibliotecă („pair-
end” sequencing) și vor fi înregistrate ciclic emisiile fluorescente ale fiecărui cluster.
 ETAPELE NGS PE PLAFORMA ILLUMINA

4. Alinierea și analiza bioinformatică a datelor

- secvențele citite vor fi aliniate la genomul de referință și analizate cu ajutorul unor

software-uri specializate.
 NGS ÎN NEOPLAZIILE MIELOIDE

- Diverse paneluri ținitite (25-120 gene) în neoplaziile mieloide

● mutații somatice inactivatoare în gene implicate în controlul epigenetic cu impact

asupra metilării ADN-ului (TET2, DNMT3A, IDH1/2), histonelor și structurii
cromatinei (ASXl1, EZH2)
● mutații somatice ale moleculelor de semnalizare (NF1, NRAS, CBL, PTPN11,
FLT3, SH2B3)
● mutații în gene ce codifică factori de transcripție (TP53, CUX1, IKZF1, ETV6,
RUNX1)
● mutații somatice ale componentelor spliceosom-ului ce afectează procesarea
ARNm (SRSF2, SF3B1, U2AF1)

- Leucemia acută mieloidă (LAM): mutații somatice recurente în majoritatea

cazurilor

- Sindroame mielodisplazice (SMD): mutații somatice la aprox. 90% din pacienți

 INTERPRETAREA REZULTATELOR NGS

- Discriminarea mutațiilor somatice driver de polimorfisme sau

mutații pasagere

- Discriminarea mutațiilor somatice driver de mutații ale liniei

germinale patogene

- Discriminarea mutațiilor somatice driver de mutații asociate

CHIP

- Discriminarea alterărilor genetice veritabile de artefacte PCR,

post-PCR și secvențiere

Utilizarea bazelor de date: COSMIC, dbSNP, CliniVar