GENOMICA

1. CARTOGRAFIEREA CARACTERELOR MENDELIENE

2. DEZECHILIBRU DE LINKAGE

3. SECVENTIEREA GENOMULUI UMAN SI PROIECTUL GENOMULUI UMAN

4. NUTRIGENOMICA

5. PROTEOMICA

1. CARTOGRAFIEREA CARACTERELOR MENDELIENE

Cartografierea genica=determinarea localizarii unei gene pe un anumit cromozom.

Utilitate:

-intelegerea mecanismelor bolilor genetice,

-diagnosticul bolilor genetice,

-stabilirea riscului de recurenta in familie,

-eventual tratament.

Realizarea unei harti complete a genomului uman , o enciclopedie a tuturor genelor si bolilor
genetice associate lor, a devenit punctual cheie al geneticii .

Cartografierea genelor a fost o etapa prealabila necesara in abordarea si finalizarea Genomului

Uman.

Cartografierea genica =localizarea unor gene care determina boli monogenice sau susceptibilitate la
boala,

Cartografierea genelor pe cromozomii umani s-a realizat folosind doua metode:

-cartografierea genetica

-cartografierea fizica.

Cartografierea genetica reprezinta evaluarea tendintei a doua segmente de ADN, o gena morbida si
un marker, de a segrega impreuna in meioza, si de a se transmite inlantuite de la parinti la
descendenti

Prin studiul fenomenelor de inlantuire si recombinare genica omoloaga (crossing over in meioza) se
poate masura diastanta intre locii genetici.

Localizarea unei gene morbide incepe cu studiul familiilor in care se manifesta boala.

La membrii acestor familii se studiaza distributia bolii si a unor markeri polimorfi , urmarind
inlantuirea intre gene morbida si un anumit marker. Pentru a fi utili in cartografiere, markerii trebuie
sa fie inalt polimorfi, si astfel creste probabilitatea ca familiile sa fie informative.

Datorita marimii genomului uman trebuiesc analizati sute de marker pentru a gasi o inlantuire.

Daca markerul si gena morbida se afla pe loci foarte apropiati pe acelasi cromozom, ele au tendinta
de a se transmite impreuna=CO-SEGREGARE.
Daca distanta creste, exista posibilitatea de crossing over si iar segmentele nealele segrega si se
transmit separat, formand combinatii noi (recombinanti).

Cu cat distanta fizica intre gene este mai mare, cu atat creste probabilitatea unui eveniment
recombinant.

Distanta intre loci se poate determina comparand genotipurile urmasilor cu cele ale parintilor si
evaluand frecventa (fractia) de recombinare. Este definita ca scorul LOD(logarithm of
odds)=proportia descendentilor recombinanti/numarul total de descendenti.

Unitatea de masura intre doi loci=Morgan, in onoarea lui Thomas Morgan care a descoperit 1910
fenomenul de crossing-over.

Un centiMorgan=distanta genetica in care se produc recombinari cu frecventa de 1%

1cM echivalent cu o secventa ADN de 1Mb.

analize de inlantuire(linkage)

Sunt bazate pe studiul familiilor, reprezinta o metoda valoroasa de cartografiere deoarece permite
stabilirea pozitiei unor gene (loci) pe acelasi cromozom=SINTENIE, a ordinii si distantei intre ele.

In present tehnicile noi bazate pe microretele permit testarea rapida a sute de mii de SNPs-uri
raspandite in genom pentru a urmari CO-SEGREGAREA cu un anumit fenotip (boala).

Genele situate pe acelasi cromozom au tendinta de a se transmite de la parinti la descendenti, prin

gameti, impreuna in bloc.

Fenomenul prin care genele nealele situate in immediate proximitate pe acelasi cromozom nu
segrega (nu se separa) in meioza si au tendinta de a se transmite impreuna in succesiunea
generatiilor=inlantuire genica=linkage.

Genele dintr-o regiune cromozomiala care se transmit impreuna formeaza un grup de

inlantuire=haplotip.

Fenomenul de inlantuire genica nu este unul abasolut deoarece numai genele situate foarte aproape
una de alta se vor transmite impreuna (inlantuite ex genele C,D,e ce determina grupul sangvin Rh
localizate pe cromozomul 1 se transmit totdeauna impreuna).

Pentru genele situate mai la distanta una de alta pe acelasi cromozom inlantuirea genica poate fi
incomplete, ele putand fi separate prin crossing over.

Epilepsy, ataxia, sensorineural deafness, tubulopathy, and KCNJ10 mutations.

Five children from two consanguineous families presented with epilepsy beginning in infancy and
severe ataxia, moderate sensorineural deafness, and a renal salt-losing tubulopathy with
normotensive hypokalemic metabolic alkalosis.

We investigated the genetic basis of this autosomal recessive disease, which we call the EAST
syndrome (the presence of epilepsy, ataxia, sensorineural deafness, and tubulopathy).

Genotypes were examined with the use of a multipoint parametric linkage analysis and haplotype
reconstruction performed with SimWalk (version 2.91) for an autosomal recessive model with
complete penetrance and a disease allele frequency of 0.001 (deCode SNP map with Asian allele
frequencies).8
Mendelian inconsistencies were checked with the use of PedCheck (version 1.1); unlikely genotypes
were filtered with the use of Merlin (version 1.1, alpha 3). 11,12 The SimWalk haplotype output files
were visualized with HaploPainter.13

A haplotype reconstruction (Panel A) for the locus on chromosome 1 shows identical alleles
(indicated by the same color) in the linked region in all affected patients. The numbers (i.e., 1 or 2)
next to the alleles indicate the respective status of the single-nucleotide polymorphisms used for
genotyping.

Recombinations in Patients 1-1 and 1-2 define this region.

The parametric multipoint linkage analysis of the whole genome for Family 1 (Panel B) has a single
significant peak, with a maximum lod score of almost 5 on chromosome 1. Genetic distance (in
centimorgans) and individual chromosomes (1 to 22) are indicated on the lower and upper x axes,
respectively.

METHODS:

Whole-genome linkage analysis was performed in the four affected children in one of the families.
Newly identified mutations in a potassium-channel gene were evaluated with the use of a
heterologous expression system. Protein expression and function were further investigated in
genetically modified mice.

RESULTS:

Linkage analysis identified a single significant locus on chromosome 1q23.2 with a lod score of 4.98.
This region contained the KCNJ10 gene, which encodes a potassium channel expressed in the brain,
inner ear, and kidney. Sequencing of this candidate gene revealed homozygous missense mutations in
affected persons in both families. These mutations, when expressed heterologously in xenopus
oocytes, caused significant and specific decreases in potassium currents. Mice with Kcnj10 deletions
became dehydrated, with definitive evidence of renal salt wasting.

CONCLUSIONS:

Mutations in KCNJ10 cause a specific disorder, consisting of epilepsy, ataxia, sensorineural deafness,
and tubulopathy. Our findings indicate that KCNJ10 plays a major role in renal salt handling and,
hence, possibly also in blood-pressure maintenance and its regulation.

IDENTIFIED MUTATIONS

Sequencing of the complete coding region of KCNJ10 revealed a homozygous missense mutation,
c.194GC (p.R65P), in the four affected patients in Family 1 and another homozygous missense
mutation, c.229GC (p.G77R) for Patient 2-1.

Parents were heterozygous for the respective mutations

Supported by the Intramural Research Programs of the National Human Genome Research Institute,
National Institutes of Health, the Special Trustees of the Great Ormond Street Hospital, St. Peters
Trust for Kidney, Bladder, and Prostate Research, the Grocers Charity, the David and Elaine Potter
Charitable Foundation, and Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB699).

Generation and validation of a zebrafish model of EAST (epilepsy, ataxia, sensorineural

deafness and tubulopathy) syndrome
To test potential therapeutics, suitable disease models are needed.
Because the mouse Kcnj10 knockout has a much more severe phenotype (including brain
dysmorphology and neonatal death) than humans with EAST syndrome, it is not an ideal model.

Here, the authors set out to develop a model of EAST syndrome using zebrafish, because zebrafish
embryos and larvae are ideal for in vivo, high-throughput drug discovery.

GWAS=genome wide association studies

Sunt analize de asociere, bazate pe studii populationale.

In acest caz se studiaza frecventa unui set de markeri la un grup de personae afectate de o anumita
boala, comparative cu un grup de persoane sanatoase.

GWAS sunt utilizate pentru identificarea unor variante genetice cauzatoare de boli complexe,
multifactoriale.

GWAS sunt studii bazate pe ipoteza ca variantele alelice ce determina susceptibiltatea la o boala
comuna se asociaza mai frecvent decat ne asteptam cu anumiti markeri care definesc o anumita
regiune genomica (haplotip).

Identificarea haplotipului asociat bolii permite definirea regiunii in care este localizata varianta
cauzala.

In ultimii ani proiecte international cum sunt Hap Map si 1000Genomes au permis identificarea
>18milioane SNPs si caracterizarea blocurilor de inlantuire genetica=haplotipuri la indivizi care apartin
populatiilor diferite.

Haplotip

Sunt regiuni care se transmit in bloc si in interiorul carora probabilitatea de recombinare este mica.

Prin GWAS s-au identificat asocierei semnificative a aproximativ 800SNPs ce implica sute de loci in
numeroase boli multifactorile.

Astfel s-au identificat gene associate cu degenerescenta maculara(CFH), boala coronariana

(CDKN2A/2B), diabetul zaharat (TCF7L2, SLC30A8), obezitatea (INSIG2,FTO).

Aplicatiile cartografierii genomului uman

Cunoasterea organizarii si functionarii aparatului genetic.

Realizarea hartii genice =anatomiagenomului uman.

Elucidarea unor mecanisme patogenice in boli monogenice sau multifactoriale.

Dezvoltarea de metodologii noi de diagnostic cu ajutorul markerilor ADN.

Dezvoltarea strategiilor de terapie genica.

2.DEZECHILIBRU DE LINKAGE

Este o caracteristica populationala, si nu familiala, ce depinde de distanta genetica intre loci si

vechimea mutatiei.
Frecventa teoretica cu care se gasesc anumite haplotipuri in populatie se calculeaza prin frecventele
individuale ale genelor allele ce-l alcatuiesc. Daca se compara frecventa teoretica cu cea reala, exista
2 situatii:

1. Frecventa reala nu difera semnificativ de frecventa teoretica=echilibru de inlantuire

2. Daca frecventa reala in populatie a unui anumit haplotip este mai mare decat frecventa
teoretica=se produce o asociere alelica preferentiala=dezechilibru de inlantuire (linkage
disequilibrium).

Acest lucru se explica prin faptul ca bolnavii au un stramos comun (efect de fondator).

3. PROIECTUL GENOMULUI UMAN

20 Centre, 6 Tari, inceput 1990

Lansat in 1990 initial cu o durata de 15ani, Proiectul si-a propus secventierea genomului uman
haploid (22A+X+Y, 3,2Gb), constand in identificarea si localizarea genelor ce alcatuiesc genomul.

A implicat 3 etape majore:

1) Secventierea unor fragmente mai mici,

2) Asamblarea genomului cu ajutorul unor programme computerizate care ordoneaza, orienteaza si

asambleaza secventele segmentelor mici,

3) Adnotarea genomului, identificare elementelor structurale si atasarea informatiei biologice (functie

si expresie) la aceste elemente =adnotare functionala.

O prima schitaa genomului uman a fost gata in iunie 2000 si publicata la 15 februarie 2001 in doua
versiuni,

Nature de catre IHGSC

Science de compania privata Celera Genomics.

Ambele versiuni raportau secventierea a 96% din eucromatina (2,69Gb) si erau incomplete si
imperfecte.

Dintre datele obtinute la aceasta prima secventiere a genomului uman mentionam:

Secventele codante reprezinta <5% din genom, iar numarul prognozat de gene era 30-35.000.

Astfel genele sunt insule intr-un ocean de ADN necodant.

Asadar genomul nu poate fi considerat ca o simpla succesiune de gene pe cromozomi, ci o structura

cu arhitectura complexa in care genele sunt dispersate pe cromozomi si separate prin largi regiuni
intergenice, necodante!

Numarul genelor la om este relative mic!

Ex 6000 gene-drojdie,

13.000 gene drosofila,

18.000 gene vierme,

26.000 plante.
Diferenta majora la om este reprezentata de complexitatea proteinelor, structura lor modulara care
permite combinatii noi!

Genomul a doua persoane neinrudite este identic 99,9% din secventele nucleotidice.

Astfel individualitatea este data de 0,1% (3milioane pb) care determina variatii personalizate de
secventa.

Oamenii difera printr-o pereche de baze(SNPs) la aprox. 1000pb!

14 aprilie 2003, la 50ani de la descoperirea structurii ADN, a fost anuntata versiunea aproape
completa a genomului uman, inaugurandu-se era genomicii.

Informatii aduse de versiunea finisata

Contine aproximativ genele care codifica proteine, dar numarul lor este mai mic decat in versiunea
initial, fiind estimate la 20-25.000

Cresterea numarului de gene ARN, al caror consecinte medicale raman a fi elucidate.

O parte majora a ADN-ului necodant , considerat inutil, pare sa aiba functii importante, neelucidate
complet.

Rata mutatiilor la barbat >2x mai mare decat la femei.

S-a descoperit remarcabila plasticitate a genomului uman, demonstrandu-se nasterea si moartea

genelor umane si evidentiind duplicatii segmentare.

Prin proiectul ELSI au fost puse in discutie problem etice-protectia datelor individuale, aspect sociale-
inegalitatea de acces la aplicatiile testelor moleculare,

Aspecte legale-patentarea datelor, metodelor,genelor.

Plasticitatea remarcabila a genomului uman, demonstrate prin studiul nasterii si mortiigenelor

umane.

Nasterea genelor se face prin duplicatie, cele mai recente duplicatii intereseaza aprox. 1200 gene,
majoritatea fiind genele receptorilor olfactivi, genele correlate cu imunitatea sau reproducerea.

Moartea genelor se produce prin mutatii care transforma genele in pseudogene non-procesate,
nefunctionale.

S-au identificat 37gene care au murit recent prin mutatii care le fac gene nefunctionale!

Pseudogenele sunt secvente asemanatoare genelor, dar nefunctionale datorita unor mutatii
inactivatoare.

Numarul lor estimate la 12.600!(Ensembl, 2011).

Studii recente in cadrul proiectului ENCODE au aratat ca unele pseudogene procesate sunt transcrise
active si ar putea fi pseudogene reactivate.

Totusi dupa publicarea versiunii finisate (2004) a genomului uman, a urmat resecventierea cu noi
tehnici a fiecarui cromozom.

2006 a fost re-secventiat cromozomul 1,

2007 declarata terminate secventa intregului genom (build 36).

2009 Genome Reference Consortium(GRCh) publica versiunea a 37-a a genomului uman, structura sa
este aprope complet descifrata.

Proiectul Genomului Uman-componente :

1) ADN-ul genelor care codifica proteine si secvente inrudite (pseudogene) -1/3

2) ADN-ul extragenic, 2/3, reprezentat de genele ARN, duplicatii segmentare si AND repetitiv.

Secventele codante transcrise si translatate care corespund exonilor genelor pentru proteine
reprezinta doar 1,1% din genom.

5% din secventele genomului uman sunt conservate in evolutie, si sunt reprezentate de elemente
functionale de baza-gene care codifica proteine, ARN, regiuni de reglarea transcriptiei.

Restul genomului =secvente ADN care au evoluat rapid si divergent.

Inca sunt lucruri de facut

Intelegerea-functiei

-expresiei

-reglarii genelor

-rolul AND-ului intergenic, sunt date ce trebuiesc completate

-variatiile genetice intre indivizi si populatii..

Procesul de adnotare structurala si functionala a genomului uman a generat mai multe proiecte :
HapMap=proiect care isi propune realizarea unei harti haplotipice a genomului uman, care cuprinde
modele comune ale variatiei genetice, in special SNPs, necesare pentru a stabili modul in care aceste
variante pot influenta sanatatea, predispozitia la boli si raspunsul la factori de mediu si medicamente.

ENCODE= (ENCyclopedia Of Dna Elements)= identificarea si adnotarea elementelor functionale ale

genomului.

Genome 1000=catalog detaliat cu variatiile structurale ale genomului uman, prin analiza genomurilor
a cel putin 1000 persone din grupuri entice diferite.

OMICA

Studiul structurii, organizarii si functiei genomului uman se numeste genomica.

Proteomul reprezinta ansamblul de proteine sintetizate/exprimate intr-un organit cellular, celula,

tesut, organ care asigura functia structurii respective.

Proteomica=studiul functiei unor structuri pe baza expresiei globale a proteinelor (cu ajutorul
electroforezei bidimensionale, cromatografiei, spectometriei de masa)

Genomul este o structura fixa,

Proteomul este dinamic, variaza temporal si spatial si in anumite conditii de mediu.

Provocari ale proteomicii/ versus genomica:

1) o gena poate codifica mai mult de o proteina!

Ex genomul uman are aprox 21.000 gene care codifica proteine, dar numarul total de proteine >
250.000-1.000.000.

2) Proteinele sunt dinamice, interactioneaza, sunt sintetizate/degradate.

3) Proteinele sufera modificari posttranslationale=pot varia de la o persoana la alta, in conditii de

mediu diferite, sau la aceeasi persoana in functie de varsta sau medicamente administrate.

4) concentratiile pot fi extreme de variabile. In cancer de exemplu se crede ca cele mai importante
proteine sunt cele in concentratii foarte mici-dificil de evaluat!

4.PROTEOMICA

Cand vorbim de proteom ne putem referi la proteomul unei specii, a unui organ (ex ficat). Proteomul
nu este constant, difera de la celula la celula si se schimba cu timpul.

Mai mult, activitatea proteica este modulate si de alti factori aditionali genelor.

Proteomica investigheaza:

-unde si cand proteinele sunt exprimate,

-rata de producer/degradare a proteinelor,

-cum sunt proteinele modificate,

-miscarea proteinelor in compartimentele subcelulare,

-implicarea proteinelor in caile metabolice,

-interactiunea proteinelor.

Posibile aplicatii:

-in evaluarea riscului de sarcini cu boli genetice,

-predictia nasterii premature

-preeclampsia

-infectia intraamniotica.

5.NUTRIGENOMICA

Reprezinta aplicarea genomicii, proteomicii, metabolomicii in cercetari nutritionale, pentru a stabili

efectele alimentatiei asupra functiei genomului precum si actiunile benefice/nocive ale
componentelor dietei la nivel individual sau populational.

Substantele nutritive influenteaza raspunsuri fiziologice ce afecteaza stabilitatea si expresia

genomului sau amprentarea (imprinting).

Intelegerea acestor mecanisme va ajuta la evaluarea beneficiilor/riscurilor diferitelor recomandari

dietetice, precum si prevenirea instalarii unor boli, managemetul bolilor cornice.
 Principala provocare a cercetarilor din domeniul nutritiei este complexitatea si dificultatea integrarii
factorilor aditionali (stilul de viata!), care afecteaza rezultatele si fac dificila interpretarea.

Studiile pe termen lung in medicina sunt gold standard.

Studiile nutritionale sunt influentate de complianta redusa pe termen lung, modificari inevitabile ale
stilului de viata.

Dereglarile metabolice sunt recunoscute in multe afectiuni.

Identificarea proceselor metabolice caracteristice bolilor si dezvoltarea de strategii care

blocheaza/corecteaza aceste cai pot fi o alternative promitatoare in managementul bolii.

Nutrigenomica-cancer

Mai mult anumiti nutrient nu servesc numai ca substrat sau produsi ai reactiilor enzimatice, dar pot
actiona ca si reglatoriai expresiei genice si pot juca un rol in modularea cailor metabolice , fie in
domeniul preventiei sau al tratamentului.

In cancer este cunoscuta dereglarea metabolica. Celulele canceroase preferasa utilizeze anumiti
nutrient, ca glucoza si glutamatul ca sursa de energie. De asemenea metabolismul lipidic este crescut
rezultand mediatori ca eicosanoizi, ce creeaza un micromediu suportiv celulelor tumorale.

Folosind nutrienti care pot modula aceste cai si sa interfere cu particularitatile metabolice din cancer,
interventiile nutritionale sunt astfel capabile sa inhibe dezvoltatrea celulelor canceroase.

Mai mult fata de tratamentele conventionale, nutrientii pot fi combinati sigur/sau pot exista in natura
combinatii effective pentru tinte multiple!

All humans have the same set of genes.

Our differences come from the tiny variations in those genes.

Those variations influence not only in how you look or behave different to others But in how your
body reacts differently to external factors.

Especially how it reacts to the foods you eat and lifestyle you live.

For example, some have great difficulty metabolising caffeine. For others, it could be alcohol.

Some have issues that increases their risk of Alzheimers disease, known as APOE4.