Tipuri de anomalii genetice şi rolul acestora în patologia

hematologică. De la anomalii cromozomiale la mutaţii

genice: tipuri de modificări, mecanisme de apariţie, exemple
în patologia umana

Prof. Dr. Ana Maria Vladareanu

Sef Lucrari dr Aurora Arghir
Citogenetica

Stiinta care aplica metodele de studiu genetic, la nivel celular

Studiaza structura, functia si evolutia cromozomilor precum si

comportamentul cromozomilor in timpul diviziunii celulare
(mitoza si meioza)

Studiaza anomaliile cromozomiale si mecanismele de aparitie a

acestora
Repere istorice citogenetica umana
 TEHNOLOGII GENOMICE

1969
Hibridizare in 1977
situ Secventiere
Sanger

1995 2005
Tehnologie Secventierea de
microarray generatie
urmatoare

1985
Inventarea
1956 PCR
Stabilirea
numarului de
cromozomi la om
Stabilirea numarului normal de cromozomi la om
- inceputul citogeneticii clinice

Tjio JH & Levan A,

Hereditas 42:1-6, 1956 04.12.2020
Lore Zech – bandarea Q - 1970
Cromozomii umani
Ciclul celular si cromozomii
 Fazele ciclului celular

Ciclul celular consta din:

Interfaza – perioada de crestere celulara si dublarea cantitatii de ADN in pregatirea
diviziunii celulare
Diviziunea celulara – mitoza (celulele somatice)
Ciclul celular si cromozomii
Interfaza
G1- prima perioada de crestere celulara, anterioara
sintezei ADN
S- sinteza (duplicarea) ADN (cromozomii devin
bicromatidici)
G2- a doua perioada de crestere celulara si pregatire a
celulei pentru diviziune
Mitoza
profaza
metafaza
anafaza
telofaza
 Ciclul celular si cromozomii

• In interfaza cromozomii ocupa teritorii bine delimitate - teritorii cromozomiale

 Ciclul celular si cromozomii
• Cromozomul – organit nuclear vizibil microscopic in timpul diviziunii celulare
(perioada de condensare maxima)
• Functie – purtatorul informatiei genetice de la o generatie la alta
Cariotipul uman
• numar diploid (2n): 46 (doua seturi de origine
parentala diferita – materna si paterna)

• 22 perechi de autozomi

• 2 gonozomi

• Sex masculin 46,XY

• Sex feminin 46,XX

 Cariotip

Cariotip: setul de cromozomi caracteristic unei celule/individ/specii

Cariotiparea: aranjarea ordonata a cromozomilor unei celule in
functie de:
- marime (in ordine descrescatoare)
- pozitia centromerului
- modelul specific de benzi
Cromozomii umani
 Elemente morfologice si functionale
ale cromozomilor umani metafazici:

•Cromatidele

•Centromerul

•Telomerele
 Cariotipul =
rezultatul final al investigatiei citogenetice clasice

Diagnosticul citogenetic continua sa reprezinte standardul de aur pentru o serie de

indicatii specifice
 Onco-citogenetica

Studiul modificarilor cromozomiale dobandite, din celulele maligne

Investigatiile citogenetice esentiale pentru diagnostic, prognostic, monitorizarea
terapiei
Intelegerea patogenezei si aprecierea prognosticului
Prima anomalie specific asociata cancerului – cromozomul Philadelphia (Ph)
Modificarile genetice in afectiunile oncologice sunt dobandite, clonale
si somatice*.

Anomalii de secventa;
Dezechilibre genomice;
Modificari cromozomiale;
Alterari ale expresiei genice;
Modificari epigenetice ………

*Cu exceptia neoplasmelor ereditare cu mutatii germ-line

 Mitelman database of chromosome aberrations and gene fusions in
cancer

"Mitelman Database of Chromosome Aberrations and Gene Fusions in Cancer (2018).

Mitelman F, Johansson B and Mertens F (Eds.),
http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman"
 Neoplasmele hematologice

Cele mai intens studiate afectiuni oncologice – celulele maligne usor

accesibile (maduva osoasa, sange periferic, ganglioni limfatici)
Studiile citogenetice – relevanta clinica. Numeroase anomalii
cromozomiale:
- esentiale pentru patogeneza hemopatiilor maligne;
- asociate cu entitati clinice distincte ;
- impact prognostic bine definit .
 Anomaliile cromozomiale in cancer

Caracter clonal

Definitia citogenetica a caracterului clonal: Mitelman F. 2004

- Prezenta aceleiasi trisomii sau modificari structurale in minim 2

celule
- Prezenta aceleiasi monosomii in minim 3 celule

ISCN 2016
Recomandari de utilizare a testelor citogenetice

CML
AML
ALL
MDS
CLL
MM
NHL
HCL
 Impactul analizei citogenetice in hemato-oncologie

parte a algoritmului de diagnostic

informatii comprehensive pentru:
-diagnostic
-prognostic
-monitorizare eficienta tratament
 Anomalii genetice in hemato-oncologie

N Engl J Med 2013; 368:2059-2074

 t(15;17)(q24;q21)

N Engl J Med 2013; 368:2059-2074

 t(8;21)(q22;q22)

Huret, JL; Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol

inv(16)(p13q22)
CROMOZOMUL PHILADELPHIA
 Cromozomul Philadelphia

Provenit din t(9;22) ce determina fuziunea genelor BCR (22q11.2)

şi ABL1 (9q34.1), si formarea a 2 gene hibride: 5’BCR/3’ABL1 şi
5’ABL1/3’BCR.
BCR/ABL1 reprezinta elementul central in patogeneza CML si este
situata pe cromozomul Ph
 t(9;11)(p22;q23) inv(3)(q21q26)

Cr 11 inelar izocromozom 8
Trisomie 8
Monosomie 7
46,XY,del(5)(q13q33)
 Anomaliile cromozomiale din hemopatiile maligne

Anomalii primare
- identificate la diagnostic, ca modificari solitare, frecvent asociate unor subtipuri
specifice de boala
- rol în stadiile timpurii ale transformarii maligne

Cele mai frecvente anomalii primare in leucemiile umane -translocatiile reciproce si

inversiile
 Anomaliile cromozomiale din hemopatiile maligne

Anomalii secundare
- apar aditional anomaliilor primare
- modificari neechilibrate de tipul monosomiilor/deletiilor, trisomiilor,
izocromozomilor
- nu apar randomic ci dupa un model de distributie dependent de anomalia
primara

Anomaliile secundare sunt corelate cu progresia tumorala in multe leucemii

umane
 Anomaliile cromozomiale din hemopatiile maligne

Recurente, specifice, neintamplatoare

-Tipice pentru tipuri tumorale specifice
-Considerate evenimente driver pentru aparitia tumorii
-Constituie elemente de diagnostic si prognostic

Intamplatoare
- Nu indeplinesc criteriul de clonalitate
- Pot afecta orice cromozom din celula tumorala
-Nu se raporteaza in buletinul de analiza
 Q1: cum poate fi descrisa aberatia cromozomiala din imagine……

A. t(9;22)
B. ins(22;9)
C. t(22;9)
D. del(22)
 Q2: cromozomul derivat este……?

A. Un cromozom de origine necunoscuta ce nu poate fi clasificat prin citogenetica clasica

B. Un cromozom cu aberatii structurale provenit din o anomalie ce implica mai multi
cromozomi sau mai multe anomalii in interiorul aceluiasi cromozom
C. Un cromozom cu structura neobisnuita ….
 Analiza cromozomiala clasica

Etape:
-Culturi celulare si prelucrarea acestora pentru obtinerea preparatelor
citogenetice

-Bandarea cromozomiala

-Analiza cromozomiala prin microscopie optica

 Culturi celulare primare
Conditii de recoltare

RECOLTAR TRANSPORT
E
Asepsie ±Anticoagulare Identificare probă Condiţii de mediu
Rapiditate
adecvate

Proba ce contine celule viabile

 Examenul de cariotip

Cromozomii pot fi observati prin microscopie optica, in lumina

transmisa directa, doar in timpul diviziunii celulare (prometafaza si
metafaza)

Pentru obtinerea cromozomilor in metafaza sunt necesare celule care

se divid in mod spontan sau la care prin cultivare si tratamente in
vitro poate fi indusa capacitatea de diviziune

04.12.2020
 Examenul de cariotip

Maduva osoasa (in conditii normale si patologice), tumorile solide,

tesutul subcutanat, vilozitatile coriale contin celule cu capacitate
spontana de diviziune.

Sangele periferic, cu excepţia hemopatiilor cu descarcare periferica,

nu contine celule ce se divid spontan; prin utilizarea agentilor
mitogeni limfocitele T si/sau B pot fi transformate blastic, cu
obtinerea de diviziuni celulare.

04.12.2020
Studiul cromozomilor
 Iniţierea culturilor celulare
Evaluarea cantitativă – numărătoarea celulelor din eşantionul biologic - este esenţială pentru iniţierea culturilor
celulare.

Utilizarea unui număr constant de celule permite asigurarea unei creşteri optime a celulelor in vitro, precum şi standardizarea
procedurilor.
 Culturi celulare
conditii aseptice de recoltare si manipulare a produsului biologic;
transport rapid, in conditii adecvate

Elementele critice pentru obtinerea viabilitate celulara

culturilor celulare: anticoagulare eficienta

alegerea adecvata conditiilor de cultivare (mediul de cultura; +/- stimulare

mitotica; durata cultivarii, temperatura de cultivare, etc)
In hemato-oncologie – cultivarea se realizeaza pe perioade scurte
(~24-48-72h)
Medii de cultura uzuale
Procedura de prelucrare a culturilor – standardizata
Tehnici de bandare - GTG
 Echipamente pentru culturi celulare
Hote cu aer steril în flux laminar (clasa de
biosecuritate 2)
 Echipamente pentru culturi celulare
Microscop inversat
Incubator cu atmosfera
controlata de CO2
Echipamente pentru analiza in microscopie optica
 Analiza
microscopica
Hemato-oncologie: analiza si cariotiparea a minim 20 de metafaze
 Examenul de cariotip - avantaje:
-detectia anomaliilor calitative si cantitative;
-examinarea intregului genom intr-un singur experiment;
-tehnologii standardizate, validate pentru utilizarea in practica
medicala;
-sisteme uniforme de nomenclatura a cromozomilor si raportare a
rezultatelor

04.12.2020
 Examenul de cariotip - limite:
-rezolutie limitata (5-10 Mb);
-dificultatea de a obtine celule in diviziune pentru anumite
tesuturi/ situatii clinice;
-dificultatea de a elucida rearanjamentele complexe sau pe cele
care implica regiuni cromozomiale cu model de benzi similar.

04.12.2020
 Citogenetica moleculara
❑ Stiinta ce combina metodele de biologie moleculare cu cele citogenetice clasice.
❑ REZULTATE = cresterea rezolutiei investigatiei si diversificarea gamei de structuri ce pot fi
investigate.

Sonde specifice de locus m-BANDING

 Citogenetica moleculara
❑ Hibridizarea fluorescenta in situ (FISH) permite investigarea, cu specificitate înalta, a unor regiuni cromozomiale
selectate, in probe biologice fixate pe lama microscopica.
 Sonde ADN
(cel mai frecvent utilizate in laboratorul
clinic)

Sonde Sonde PNA, LNA

(acizi nucleici modificati)
FISH

Sonde ARN/ADNc

Sonde oligonucleotidice
 Protocolul FISH Preparatul citogenetic
standard

Sonda marcată fluorescent

Denaturare (~75°C)

Hibridizare (minim 16h)

Detecţie

Microscopie fluorescentă
 FISH

ADN tinta Sonda ADN

denaturare

renaturare

Homoduplex-uri ADN Heteroduplex-uri ADN Homoduplex-uri

ţintă ţintă - sondă sondă ADN
 FISH
LABORATOR DE HEMATO-PATOLOGIE

fibre de
cromatină
/ADN

nuclei cromozomi
interfazici metafazici

FISH

cromozomi
ţesuturi elongaţi
mecanic
 Sonde FISH
locus specifice

centromerice Cromozomiale telomerice

specifice

painting

pan-centromerice Cromozomiale pan-telomerice

nespecifice
 Sonde FISH

Sonde FISH specifice de locus

Rearanjari 11q23 – sonda
“MLL break - apart”
“MLL break - apart” – modelul normal de semnale
“MLL break - apart” – translocatie implicand gena MLL (KMT2A)
Sonda “PML / RARA dual color dual fusion”
Leucemia acuta promielocitara – sonda
“PML / RARA dual color, dual fusion”
Fuziuni genice rezultate din
translocatia reciproca t(15;17)
Sonda “BCR / ABL dual color, extrasignal”
Sonda “BCR / ABL tri-color, dual fusion”
 Sonda “BCR / ABL tri-color, dual fusion”

Model normal Fuziune BCR/ABL si deletie 9qder

Model normal cu suprapunere

intamplatoare a
cr 9 si 22
Sonda “IGH / MYC CEP 8 tri-color, dual fusion”
 Sonda “IGH / MYC CEP 8 tri-color, dual fusion”

IGH/MYC dual color-dual fusion

CEN 8

der(8)t(8;14)
Sonda “TP53 / CEP 17”
Sonda “TP53 / CEP 17” – model normal de semnale
 Sonde FISH

Sonde FISH centromerice

Sonda centromerica specifica – cromozom 7
Sonda centromerica specifica – cromozom 8
Sonda centromerica – cromozomi 13, 21
 Sonde FISH

Sonde FISH telomerice

Sonde telomerice specifice – cromozom 12
 Sonde FISH

Sonde FISH
painting cromozomial
WCP 7
WCP 14
Sonde MULTIPLEX FISH
SKY
M-FISH
Vizualizarea rezultatelor FISH
Microscopia epifluorescenta
 Aplicatii FISH

❖ Citogenetica clinica
❖ Citogenetica oncologica
❖ Cartografiere fizica
❖ Citogenetica comparativa
❖ Studiul arhitecturii nucleare
 Aplicatii FISH

❖ Identificarea anomaliilor citogenetice criptice: microdeleţii, translocaţii,

inversii, inserţii etc.
❖ Caracterizarea anomaliilor cromozomiale structurale complexe.
❖ Caracterizarea punctelor de rupere.
 Aplicatii FISH

❖ Detecţia aneuploidiilor.
❖ Elucidarea originii cromozomilor markeri.
❖ Detecţia de anomalii cromozomiale în celule în interfază (FISH
interfazic).
❖ Detecţia amplificărilor genice (oncologie).
 Analiza prin FISH a anomaliilor cromozomiale
structurale dobândite

❖Neoplasme hematologice / tumori solide.

❖Elucidarea regiunilor genomice participante în aceste rearanjări este importantă din
perspectiva diagnosticului şi a terapiei.
❖Anomalii complexe, heterogene - necesită FISH si/sau alte tehnici moleculare.
 LAL:
Citogenetică clasică: minim 2 culturi (MD şi culturi de 24,48h)
• 10 – 20 metafaze - cariotip cu anomalii
Analiza cromozomială
(bandare GTG) • 20 – 25 metafaze - cariotip normal

Cariotip normal / Cariotip cu modificări necaracteristice unui subtip Cariotip cu modificări vizibile
index mitotic redus LAL citogenetic caracteristice LAL

FISH
LAL-Pro-B MLL

LAL-Pre-B BCR-ABL1
LAL-Pre-B (copii) ETV6-RUNX1, sonde: crz. 4, 6, 8, 10, 14, 17, 18, 21

LAL cu celule B mature MYC Formula de cariotip ISCN 2009

Opţional, dar recomandat:

La toate subtipurile: BCR-ABL1, MLL, MYC, ETV6-RUNX1, sonde pentru 4, 6, 8, 10, 14, 17, 18, 21

LAL cu celule T CDKN2A, SIL-TAL1, NUP214-ABL1

LAL celule B mature IGH-MYC

Genes, Chromosomes & Cancer 46:494-499 (2007)

LAM:
Citogenetică clasică: minim 2 culturi (de 24 şi 48h)
• 10 – 20 metafaze - cariotip cu anomalii
Analiza cromozomială
(bandare GTG) • 20 – 25 metafaze - cariotip normal

Cariotip normal / Cariotip cu modificări necaracteristice unui subtip Cariotip cu modificări vizibile
index mitotic redus LAM citogenetic caracteristice LAM

FISH
Subtip LAM Gene sau fuziuni genice

M3/M3v PML-RARA
M4eo CBFB

M4/M5 MLL Formula de cariotip ISCN

Analiză citogenetică pe mai puţin de 10 metafaze SAU cariotip aparent normal: 2009
PML-RARA, RUNX1-RUNX1T1 (AML-ETO), CBFB, MLL, 5q31, 7q31, TP5

Genes, Chromosomes & Cancer 46:494-499 (2007)

LLC:
FISH Citogenetică clasică: minim 2 culturi (de 24 şi 72h)
LLC cu celulă B: stimulare cu PWM/ TPA/oligonucleotide+IL2
11q23: ATM
cen12 LLC cu celulă T: stimulare cu PHA
13q14: D13S319, D13S25, D13S272
17p13 TP53

Opţional, dar recomandat:

13q34 LAMP1
Analiza cromozomială
Diagnostic incert: IGH.CCND1, IGH-BCL2
(bandare GTG)
Opţional: 6q23 (MYB), 12q15 (MDM2), 14q32 (IGH) • 10–20 metafaze pentru cariotip cu anomalii

• 20–25 metafaze pentru cariotip normal

Formula de cariotip ISCN

2009

Genes, Chromosomes & Cancer 46:494-499 (2007)

 LMC
Citogenetică clasică: minim 2 culturi (de 24 şi 48h) si MD
• 10 – 20 metafaze - cariotip cu anomalii
• 20 – 25 metafaze - cariotip normal
Analiza cromozomială
(bandare GTG)

Cariotip normal / Cariotip cu anomalii, fără Cariotip cu modificări vizibile

index mitotic redus t(9;22) citogenetic şi Ph+

FISH Opţional: FISH BCR-ABL1

BCR-ABL1 pentru detectarea deleţiilor der(9) sau a
sau translocaţiilor variante
alta tehnică moleculară (PCR)

Formula de cariotip ISCN 2009

Genes, Chromosomes & Cancer 46:494-499 (2007)

 NMP
Citogenetică clasică: minim 2 culturi (de 24 şi 48h)
• 10 – 20 metafaze - cariotip cu anomalii
Analiza cromozomială • 20 – 25 metafaze - cariotip normal
(bandare GTG)

Cariotip normal / Cariotip cu anomalii nespecifice Cariotip cu modificări vizibile

index mitotic redus citogenetic specifice

FISH
Opţional, dar recomandat:
- BCR-ABL1
Formula de cariotip ISCN 2009
- PDGFRB
- HES-CEL: FIP1L1-PDGFRA

Genes, Chromosomes & Cancer 46:494-499 (2007)

 SMD
Citogenetică clasică: minim 2 culturi (de 24 şi 48h)
• 10 – 20 metafaze - cariotip cu anomalii
Analiza cromozomială • 20 – 25 metafaze - cariotip normal
(bandare GTG)

Cariotip normal / Cariotip cu modificări vizibile

index mitotic redus citogenetic

FISH
Opţional:
Toate subtipurile:
- 5q31, Formula de cariotip ISCN 2009
- cen7, 7q31,
- cen 8,
- TP53,
- 20q,
- cen Y.
Genes, Chromosomes & Cancer 46:494-499 (2007)
Fiber FISH
MULTICOLOR SPECTRAL KARYOTYPING -
SKY
SKY
FISH PANTELOMERIC
FISH cu sonde subtelomerice specifice
pentru cromozom
M-FISH cu sonde centromerice
Studiile FISH:
AVANTAJE - rezolutie pana la 100-200 kb;
- posibilitatea de investigare a celulelor ce nu se afla in diviziune (FISH interfazic).

LIMITARI – investigarea unor regiuni tintite nu a intregului genom pentru sondele

specifice de locus, uzual folosite in laboratorul clinic.

04.12.2020
❖Tehnologiile FISH sunt instrumente versatile, indispensabile pentru elucidarea
anomaliilor cromozomiale complexe şi/sau submicroscopice si pentru
validarea/completarea rezultatelor array-CGH.
❖Studiile FISH permit un diagnostic mai rapid si de mai mare acurateţe.
 Q3: Care dintre afirmatiile de mai jos este adevarata….?

A. Citogenetica clasica poate fi utilizata pentru analiza celulelor in interfaza si in metafaza

B. Unele clone maligne nu prolifereaza in vitro si astfel citogenetica clasica nu detecteaza
toate aberatiile
C. FISH este util pentru detectia aberatiilor criptice
Q4: Imaginile de mai jos sunt un exemplu de….

A. Translocatie detectata cu sonde pentru translocatii

B. Sonda tip break apart ce detecteaza o translocatie
C. Sonda specifica de locus ce detecteaza o deletie
D. Sonda centromerica ce detecteaza o monosomie
LEUCEMIA CRONICA
MIELOIDA
INCEPUTUL …….

1960 - Nowell şi Hungerford identifica

cromozomul Philadelphia
– prima anomalie
asociată specific unei neoplazii
CROMOZOMUL PHILADELPHIA
 Cromozomul Philadelphia – provine din
translocatia reciproca a cromozomilor 9 si 22
INVESTIGATIA GENETICA IN LMC

Etapa esentiala pentru diagnostic si monitorizarea moleculara

a raspunsului la terapie.

Metode curente:
- citogenetica clasica (examen de cariotip) ±
citogenetica moleculara (FISH);
- genetica moleculara (metodologii PCR, secventiere).
INVESTIGATIA GENETICA IN LMC

La diagnostic:
- examen citogenetic (+/- FISH);
- teste moleculare (PCR calitativ pentru stabilirea tipului de
transcript).

Monitorizare:
- Examen citogenetic pana la obtinerea remisiunii
citogenetice;
- PCR cantitativ (qPCR) monitorizarea moleculara a
raspunsului la terapie .
TERAPIA IN LMC

Repere istorice

Arsenic
Iradierea splinei
Busulfan
Hidroxiureea
Alo transplant
Chimioterapie
Interferon
Imatinib
Dasatinib,
Nilotinib

1865 1903 1953 1964 1975 1983 1999 2005

dupa Soverini S, 2013
 LMC in era TKI : scopul final il reprezinta raspunsul molecular

Odata cu TKI a fost introdus un nou “concept” – raspunsul molecular (RM)

Raspuns hematologic complet

Raspuns citogenetic complet

Raspuns molecular major

Transcript de fuziune nedetectabil

 CML – “poveste de succes”
LMC – HEMOPATIE
MALIGNA

genele implicate in
LMC – AFECTIUNE
t(9;22) – BCR 22q11
descoperirea CRONICA
cromozomului Ph si ABL1 9q34
CONTROLABILA
PRIN TERAPIE

1960 1973 1985 2001

cromozomul Ph
provine din prima terapie
cu tinta moleculara
translocatia
reciproca t(9;22)