NIVELUL CITOGENETIC

DE STUDIU AL
MATERIALULUI EREDITAR
Cromozomii umani:
- morfologie,
- metode de evidenţiere.
◼ Citogenetica conventională este utilă pentru
diagnosticul anomaliilor cromozomiale ce determină
dismorfii, tulburări de dezvoltare, retard mintal, dar
este limitată, neputând releva anomalii mai mici de
2-3 megabaze.
◼ Citogenetica moleculară se bazează pe asocierea
tehnicilor de biologie moleculară şi citogenetică.
Principiul tehnicilor de citogenetică moleculară este
vizualizarea unor secvenţe specifice de ADN după
hibridizarea acestora cu probe specifice ce au
ataşat un fluorocrom.
◼ Nivelul citogenetic

Cuprinde totalitatea metodelor de evidenţiere a

cariotipului la cazurile suspicionate de anomalii
cromozomiale.

Exista două metode utilizate:

MD = metoda directă, fară realizarea culturilor
celulare
MI = metoda indirectă, cu realizarea culturilor
celulare
Timpii de lucru ai MD şi MI:
1. Obţinerea celulelor în diviziune.

2. Blocarea mitozelor în metafază.

3. Hipotonizarea.

4. Fixarea.

5. Etalarea pe lamă.

6. Colorarea lamelor.

7. Observarea metafazelor.

8. Fotografierea.

9. Cariotiparea.
◼ Recoltarea de sânge
venos periferic se
realizează prin puncție
venoasă efectuată în
condiții sterile.
◼ Pentru a preveni
coagularea sângelui se
folosesc substanțe
anticoagulante
(heparină sodică).
◼ Celulele mononucleare
sunt purificate din sânge prin
centrifugare:
- Hematiile și granulocitele
sedimentează, iar
- limfocitele și monocitele
formează un pelet ce va fi
utilizat mai departe.
◼ Separarea limfocitelor.
◼ Limfocitele vor fi cultivate pentru 3 zile într-
un mediu de cultură corespunzator.
◼ Stimularea diviziunii celulare prin
adăugarea de substante mitogene cum
este fitohemaglutinina.
◼ După 3 zile, când există
un număr mare de celule
în diviziune se adaugă
colcemid (colchicină) ce
realizează blocarea
celulelor în mitoză.
Aceasta acţionează 45
minute, timp în care
tuburile sunt incubate la
37C.
◼ Urmează o
centrifugare:
- supernatantul se
aruncă,
- sedimentul se
prelucrează în
continuare.
Hipotonizarea
◼ permite balonizarea
nucleilor pentru
dispersia cromozomilor,
◼ se realizează prin
adăugare de soluţii
saline (KCl soluţie
hipotonă 0,55%).
◼ Fixarea se
realizează cu
ajutorul fixatorului
Carnoy (metanol şi
acid acetic în
proporţie de 3:1).
◼ Etalarea de lamă a preparatelor metafazice.
◼ Preparatele obţinute sunt analizate la
microscop.
http://www.youtube.com/watch?v=YjQoROu5KFg&feature=related
Indicaţiile efectuării analizelor
citogenetice
Indicațiile metodei directe

◼ Gravidele cu risc de a avea un copil cu

anomalie cromozomială (vilozități coriale).
◼ Diagnosticul, prognosticul și în unele cazuri
tratamentul hemopatiilor maligne;
◼ Diagnosticul diferențial între tumorile benigne
și maligne.
 Indicațiile metodei indirecte
◼ Gravidele cu risc de a avea un copil cu anomalie
cromozomială.
◼ Diagnosticul anomaliilor numerice și structuale
autozomale traduse fenotipic prin sindroame
plurimalformative.
◼ Hipogonadisme, disgenezii gonadale datorate
modificării numărului și structurii gonozomilor.
◼ Stabilirea sexului genetic:
- postnatal în intersexualități;
- prenatal dacă mama = purtătoare de genă patologică
r-X-legată.
Indicațiile metodei indirecte

◼ Diagnosticul Retardului mental (Sindrom cu X

fragil).
◼ Diagnosticul diferențial al bilolor genetice de
fenocopii.
◼ Diagnosticul de certitudine al sindroamelor
genice asociate cu instabilități cromozomiale.
◼ Depistarea eventualelor anomalii structurale
cromozomiale la persoanele care lucrează în
mediu toxic.
 Indicațiile metodei indirecte
◼ Eșecuri reproductive:
-sterilitate;
-infertilitate;
-existența unor: cromozomopatii în familie,
nașteri de feți morți, avorturi spontane multiple
-depistarea purtătorilor de anomalii cromozo-
miale balansate (inversii, translocații), fenotipic
sănătoși dar cu risc de a forma gameți
aneuploizi.
 Indicaţiile efectuării analizei
citogenetice
Diagnostic prenatal

Se indică la gravidele cu risc de a

avea un copil cu anomalie
cromozomială. În funcție de
vârsta gestaţională şi anomalia
suspcionată se poate recurge la
puncţie de vilozităţi coriale,
amniocenteză, cordocenteză,
biosie de ţesut sau de organ.

Efectuarea cariotipului fetal poate fi indicată şi în cazul avorturilor

spontane sau cu feţi decedaţi in utero, caz în care se poate
recurge la una dintre metodele de prelevare enumerate mai sus
sau puncţie intra-cardiacă pentru avorturile tardive.
◼ Analiza citogenetică în cazurile cu neoplazii
sau tumori
Realizarea cariotipului din maduva hematogenă
este utilă pentru diagnosticul evaluarea
prognosticului şi indicaţiile terapeutice la
pacienţii cu leucemie.
 Caracterizarea structurală a
cromozomilor umani
◼ Momentul optim pentru studiul cromozomilor este
metafaza, etapă a diviziunii mitotice în care
cromozomii apar complet spiralizaţi şi dispersaţi
astfel încât să poată fii analizaţi.
◼ Cromozomii metafazici sunt bicromatidici, datorită
replicării semiconservative a ADN-ului din faza S a
interfazei.
◼ În interfază, materialul ereditar se regăseste sub
forma cromatinei, cromozomii nu pot fi vizualizaţi
datorită despiralizării moleculelor de ADN.
◼ Numărul cromozomilor este caracteristic fiecărei
specii, astfel în celulele somatice umane există
2 seturi cromozomiale – 2 x 23 cromozomi
(2n=46).
◼ Fiecare set cromozomial conţine 22 cromozomi
autozomi şi un cromozom sexual, denumit şi
gonozom sau heterozom.
◼ În celulele diploide există 44 de cromozomi
autozomi şi 2 gonozomi, XX la sexul feminin,
respectiv XY la sexul masculin.
◼ Cei 2 cromozomi ce formează o pereche se
numesc cromozomi omologi, ei prezintă
morfologie identică, dar au origini diferite, unul
este de origine maternă, iar omologul său de
origine paternă.
◼ La sexul masculin, cromozomii gonozomi
(XY) nu sunt omologi, morfologia celor 2
cromozomi este diferită, iar majoritatea
genelor de la nivelul cromozomului Y sunt
implicate în procesul de masculinizare,
genele somatice fiind reduse numeric.
◼ Gameţii sunt celule haploide şi conţin un
singur set cromozomial – n cromozomi
(n=23).
◼ Modificarea numărului de cromozomi
specific celulei se numeşte aneuploidie şi
determină o stare patologică.
 Elemente structurale obligatorii
Cromatidele surori reprezintă două copii
identice de cromatină unite la nivelul
centromerului.
Cromatidele surori conţin gene identice
rezultate în urma replicării ADN în timpul
interfazei.
Cromatidele surori pot fi definite ca două
lanţuri nucleoproteice identice rezultate
prin replicare unei monocatene de ADN.
Ca urmare, exceptând etapa post crossing
over a meiozei, pe locusuri omoloage ale
cromatidelor se găsesc alele identice, spre
deosebire de cromozomii omologi ce nu
prezinte alele identice pe locusuri
omoloage.
◼ Telomerele reprezintă secvente de ADN repetitive la nivelul
extremitătilor rotunjite ale cromozomilor, cu rol în menținerea
arhitecturii cromozomiale si în replicare.
◼ Termenul provine din limba greacă, unde telos=capăt, iar
meros=parte. Telomerele îmbiedică fuzionarea cromatidelor, iar
pierderea telomerelor determină formarea cromozomilor în ring.
◼ Centromerul, constricţia primară reprezintă regiunea de
ADN unde cromatidele surori se unesc.
◼ Centromerul are rolul de adeziune a cromatidelor surori, în
formarea kinetocorilor şi realizarea crosing over-ului în
meioză.

◼ La nivelul centromerului se formează kinetocorii:

proteinele se leagă de centromerul ce reprezintă o ancoră
pentru formarea fusului de diviziune necesar pentru
migrarea cromatidelor către cei doi poli în timpul anafazei
şi telofazei.
◼ Perturbări ale functiei centromerului rezultă în alinierea
incorectă sau nesepararea cromatidiană.
 -cromozomi metacentrici, braţele p sunt egale cu braţele q (p=q)
-cromozomi submetacentrici, braţele p sunt mai scurte decât braţele q
(p˂q)
-cromozomi acrocentrici, braţele p sunt foarte scurte în raport cu
braţele q (p˂˂q)
◼ Kinetocorii sunt reprezentaţi de
complexe mari de proteine şi ADN ce
se formează la nivelul centromerului
având rol în ataşarea cromatidelor de
microtubulii fusului de diviziune.
◼ Kinetocorii conţin două regiuni:

-internă, ce este în strânsă legătură cu

ADN-ul centromeric formând o
cromatină specializată ce persistă pe
toată perioada ciclului celular
-externă, ce interacţionează cu
microtubulii. Aceasta este o structură
foarte dinamică, conţine mai multe
componente asamblate şi funcţionale
numai în timpul diviziunii celulare.
Elemente structurale facultative
(neobligatorii)
Constrictia secundară

= element structural neobligatoriu

◼ cromozomii 1, 9, 16 prezintă constricţie
secundară pe braţul q ceea ce poate determina
variaţii morfologice între cromozomii omologi
(polimorfism conformaţional)
◼ cromozomii acrocentrici, prezinta constricţiile
secundare la nivelul braţelor p.
Sateliţii
◼ = formaţiuni rotunjite, elongate ce apar
la nivelul cromozomilor acrocentrici
◼ Prin asocierea a doi sau mai multi
cromozomi acrocentrici se formează o
asociaţie satelitară.
◼ Numărul asociaţiilor satelitare creşte cu
vârsta şi în cazul infecţiilor virale.
◼ Prezenţa asociaţiilor satelitare constituie
un factor predispozant pentru
nondisjuncţii cromozomiale (cu
formarea aneuploidiei).