Tipuri de anomalii genetice şi rolul acestora în patologia

hematologică. De la anomalii cromozomiale la mutaţii

genice: tipuri de modificări, mecanisme de apariţie, exemple
în patologia umana

Prof. Dr. Ana Maria Vladareanu

Sef Lucrari dr Aurora Arghir
 AFECTIUNE GENETICA

1960
1890- von Hansemann 1914 - Boveri
Nowell & Hungerford
 Celula Carcinogeneza
normala

Primul an

Al doilea an

Al treilea an

Al patrulea an

Acumulare de modificari
moleculare

Celula maligna

Transformarea maligna a celulei este un proces

complex, multistadial si de durata National Cancer Institute
Carcinogeneza

Boala manifesta
clinic
+ Conditii de
micromediu tisular

Expansiune clonala – stadii

subclinice

+ Status imun gazda

Celula cu transformare
maligna
 Citogenetica

 Stiinta care aplica metodele de studiu genetic, la nivel celular

 Studiaza structura, functia si evolutia cromozomilor precum si

comportamentul cromozomilor in timpul diviziunii celulare
(mitoza si meioza)
 Studiaza anomaliile cromozomiale si mecanismele de aparitie a
acestora
 Genomul uman
mitocondrial ~
16.500 perechi de baze

Genomul uman nuclear

– 24 molecule
cromozomiale diferite;
3 miliarde de perechi
de baze

https://mastergolflivestream.com
The Human Genome Project
1990-2003
 “The supersonic age

of genomics”
https://www.genomicsengland.co.uk/
about-genomics-england/the-100000-genomes-project/

http://www.internationalgenome.org/about /
  Initiativa One million genomes - 13 state europene semnatare.

 Acces comun la date de secventiere a intregului genom provenite de la 1 milion de indivizi, pana in 2022.
Descifrarea genomului uman a inceput cu stabilirea numarului normal de
cromozomi

Tjio JH & Levan A, Hereditas 42:1-6, 1956

 CROMOZOMUL
• Cromozomul – organit nuclear vizibil microscopic in timpul diviziunii celulare
(perioada de condensare maxima)
• In interfaza ocupa teritorii bine delimitate - teritorii cromozomiale
• Functie – purtatorul informatiei genetice de la o generatie la alta
 Citogenetica – ramura a geneticii ce se ocupa
cu studiul structurii si functiei cromozomilor

 Citogenetica clasica – studiul cromozomilor in diviziune

(metafaza), cu ajutorul microscopiei optice in lumina directa, si
analiza de cariotip

 Citogenetica moleculara - combina metode de biologie

moleculara cu metode citogenetice clasice si permite
vizualizarea, in microscopie epifluorescenta, a cromozomilor
intregi / anumitor regiuni cromozomiale cu o mai buna rezolutie
si specificitate.
 Citogenetica clasica - analiza de cariotip

 Cariotip: setul de cromozomi caracteristic unei celule/individ/specii

 Cariotiparea: aranjarea ordonata a cromozomilor unei celule in
functie de: marime (in ordine descrescatoare), pozitia centromerului
si modelul specific de benzi
Citogenetica moleculara – Hibridizarea in situ fluorescenta (FISH)

 FISH se bazeaza pe capacitatea de hibridizare a acizilor nucleici

 FISH utilizeaza sonde (fragmente de acizi nucleici sau
oligonucleotide) marcate fluorescent pentru a investiga cromozomii

fibre de
cromatină
/ADN

nuclei cromozomi
interfazici metafazici
FISH

cromozomi
ţesuturi elongaţi
mecanic
 Onco-citogenetica

 Studiul modificarilor cromozomiale dobandite, din celulele maligne

 Investigatiile citogenetice esentiale pentru diagnostic, prognostic, monitorizarea
terapiei
 Intelegerea patogenezei si aprecierea prognosticului
 Prima anomalie specific asociata cancerului – cromozomul Philadelphia (Ph)
 Neoplasmele hematologice

 Cele mai intens studiate afectiuni oncologice – celulele maligne

usor accesibile (maduva osoasa, sange periferic, ganglioni limfatici)
 Studiile citogenetice – relevanta clinica. Numeroase anomalii
cromozomiale:
- esentiale pentru patogeneza hemopatiilor maligne;
- asociate cu entitati clinice distincte ;
- impact prognostic bine definit .
 Anomaliile cromozomiale in cancer
Modificarile genetice in afectiunile oncologice sunt dobandite,
clonale si somatice (cu exceptia neoplasmelor ereditare cu
mutatii germ-line).

 Caracter clonal

 Definitia citogenetica a caracterului clonal: Mitelman F. 2004

- Prezenta aceleiasi trisomii sau modificari structurale in minim 2

celule
- Prezenta aceleiasi monosomii in minim 3 celule

ISCN 2016
 Tipurile de anomalii genetice din hemopatiile
maligne

Anomalii cromozomiale structurale

Anomalii cromozomiale echilibrate :
-Translocatii reciproce
-Inversii
Anomalii cromozomiale neechilibrate :
-Translocatii neechilibrate
-Deletii
-Duplicatii/amplificari
-Izocromozomi
 Tipurile de anomalii genetice din hemopatiile
maligne

Anomalii cromozomiale submicroscopice

Anomalii submicroscopice:

-Translocatii, inversii, insertii criptice;

-Deletii si duplicatii/amplicarii submicroscopice; (variatii ale numarului de copii
ADN)
 Tipurile de anomalii genetice din hemopatiile
maligne

Anomalii cromozomiale numerice

Modificari numerice ce afecteaza una sau mai multe perechi cromozomiale:

•Trisomii, monosomii
•Hiperdiploidie
•Hipodiploidie
Modificari ce afecteaza intregul set cromozomial (ploidia):
•Triploidie
•Haploidie
 Tipurile de anomalii genetice din hemopatiile
maligne

Anomalii structurale de secventa

Mutatii:
-substitutii, deletii, insertii ale unei nucleotide (mutatii punctiforme) sau mai multor
nucleotide;
-repetitii / expansiuni ale unor secvente scurte, de obicei trinucleotidice sau
tetranucleotidice (mutatii dinamice).
 Tipurile de anomalii genetice din hemopatiile
maligne

Anomalii cantitative ale expresiei genice

Supra- expresia genica sau expresie redusa a unei gene;
Modificarea concomitenta a expresiei mai multor gene - model anormal de expresie
genica

Anomalii epigenetice

Anomalii ale metilarii ADN

Anomalii ale metilarii / acetilarii histonelor
 t(15;17)(q24;q21)

N Engl J Med 2013; 368:2059-2074

 t(8;21)(q22;q22)

Huret, JL; Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol

inv(16)(p13q22)
 Recomandari de utilizare a testelor citogenetice

 CML
 AML
 ALL
 MDS
 CLL
 MM
 NHL
 HCL
 Impactul analizei citogenetice in hemato-
oncologie

 parte a algoritmului de diagnostic

 informatii comprehensive pentru:
-diagnostic
-prognostic
-monitorizare eficienta tratament
 LAL:
Citogenetică clasică: minim 2 culturi (MD şi culturi de 24,48h)
• 10 – 20 metafaze - cariotip cu anomalii
Analiza cromozomială
(bandare GTG) • 20 – 25 metafaze - cariotip normal

Cariotip normal / Cariotip cu modificări necaracteristice unui subtip Cariotip cu modificări vizibile
index mitotic redus LAL citogenetic caracteristice LAL

FISH
LAL-Pro-B MLL

LAL-Pre-B BCR-ABL1
LAL-Pre-B (copii) ETV6-RUNX1, sonde: crz. 4, 6, 8, 10, 14, 17, 18, 21

LAL cu celule B mature MYC Formula de cariotip ISCN 2009

Opţional, dar recomandat:

La toate subtipurile: BCR-ABL1, MLL, MYC, ETV6-RUNX1, sonde pentru 4, 6, 8, 10, 14, 17, 18, 21

LAL cu celule T CDKN2A, SIL-TAL1, NUP214-ABL1

LAL celule B mature IGH-MYC

Genes, Chromosomes & Cancer 46:494-499 (2007)

LAM:
Citogenetică clasică: minim 2 culturi (de 24 şi 48h)
• 10 – 20 metafaze - cariotip cu anomalii
Analiza cromozomială
(bandare GTG) • 20 – 25 metafaze - cariotip normal

Cariotip normal / Cariotip cu modificări necaracteristice unui subtip Cariotip cu modificări vizibile
index mitotic redus LAM citogenetic caracteristice LAM

FISH
Subtip LAM Gene sau fuziuni genice

M3/M3v PML-RARA
M4eo CBFB

M4/M5 MLL Formula de cariotip ISCN

Analiză citogenetică pe mai puţin de 10 metafaze SAU cariotip aparent normal: 2009
PML-RARA, RUNX1-RUNX1T1 (AML-ETO), CBFB, MLL, 5q31, 7q31, TP5

Genes, Chromosomes & Cancer 46:494-499 (2007)

LLC:
FISH Citogenetică clasică: minim 2 culturi (de 24 şi 72h)
LLC cu celulă B: stimulare cu PWM/ TPA/oligonucleotide+IL2
11q23: ATM
cen12 LLC cu celulă T: stimulare cu PHA
13q14: D13S319, D13S25, D13S272
17p13 TP53

Opţional, dar recomandat:

13q34 LAMP1 Analiza cromozomială
Diagnostic incert: IGH.CCND1, IGH-BCL2
(bandare GTG)
Opţional: 6q23 (MYB), 12q15 (MDM2), 14q32 (IGH) • 10–20 metafaze pentru cariotip cu anomalii

• 20–25 metafaze pentru cariotip normal

Formula de cariotip ISCN

2009

Genes, Chromosomes & Cancer 46:494-499 (2007)

 LMC
Citogenetică clasică: minim 2 culturi (de 24 şi 48h) si MD
• 10 – 20 metafaze - cariotip cu anomalii
• 20 – 25 metafaze - cariotip normal
Analiza cromozomială
(bandare GTG)

Cariotip normal / Cariotip cu anomalii, fără Cariotip cu modificări vizibile

index mitotic redus t(9;22) citogenetic şi Ph+

FISH Opţional: FISH BCR-ABL1

BCR-ABL1 pentru detectarea deleţiilor der(9) sau a
sau translocaţiilor variante
alta tehnică moleculară (PCR)

Formula de cariotip ISCN 2009

Genes, Chromosomes & Cancer 46:494-499 (2007)

 NMP
Citogenetică clasică: minim 2 culturi (de 24 şi 48h)
• 10 – 20 metafaze - cariotip cu anomalii
Analiza cromozomială • 20 – 25 metafaze - cariotip normal
(bandare GTG)

Cariotip normal / Cariotip cu anomalii nespecifice Cariotip cu modificări vizibile

index mitotic redus citogenetic specifice

FISH
Opţional, dar recomandat:
- BCR-ABL1
- PDGFRB Formula de cariotip ISCN 2009
- HES-CEL: FIP1L1-PDGFRA

Genes, Chromosomes & Cancer 46:494-499 (2007)

 SMD
Citogenetică clasică: minim 2 culturi (de 24 şi 48h)
• 10 – 20 metafaze - cariotip cu anomalii
Analiza cromozomială • 20 – 25 metafaze - cariotip normal
(bandare GTG)

Cariotip normal / Cariotip cu modificări vizibile

index mitotic redus citogenetic

FISH
Opţional:
Toate subtipurile:
- 5q31,
Formula de cariotip ISCN 2009
- cen7, 7q31,
- cen 8,
- TP53,
- 20q,
- cen Y. Genes, Chromosomes & Cancer 46:494-499 (2007)
 Selectarea testelor genetice

 In functie de momentul evolutiv:

-diagnostic
-recadere
-monitorizare boala minima reziduala
 In functie de rezolutie/ sensibilitate/specificitate
 In functie de structurile genetice pe care le studiaza / tipul defectului genetic
 In functie de accesibilitate/standardizare.
LEUCEMIA CRONICA MIELOIDA
INCEPUTUL …….

1960 - Nowell şi Hungerford identifica

cromozomul Philadelphia
– prima anomalie
asociată specific unei neoplazii
 Repere istorice

September 2007 Journal of Clinical Investigation 117(8):2036-43

DOI: 10.1172/JCI31691
 Cromozomul Philadelphia – provine din
translocatia reciproca a cromozomilor 9 si 22
INVESTIGATIA GENETICA IN LMC

Etapa esentiala pentru diagnostic si monitorizarea moleculara

a raspunsului la terapie.

Metode curente:
- citogenetica clasica (examen de cariotip) ±
citogenetica moleculara (FISH);
- genetica moleculara (metodologii PCR, secventiere).
INVESTIGATIA GENETICA IN LMC

La diagnostic:
- examen citogenetic clasic (+/- FISH);
- teste moleculare (qPCR sau PCR calitativ pentru stabilirea
tipului de transcript).

Monitorizare:
- Examen citogenetic pana la obtinerea remisiunii
citogenetice;
- PCR cantitativ (qPCR) monitorizarea moleculara a
raspunsului la terapie .
 Inhibitori de tirozin kinaze

Mechanistic Evidence in Evidence-Based Medicine: A Conceptual Framework

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK154588/figure/results.f2/
Inhibitorii de tirozin kinaze au revolutionat tratamentul CML

Raspuns hematologic complet

Raspuns citogenetic complet

Raspuns molecular major

Transcript de fuziune nedetectabil

 CML – “poveste de succes”
LMC – HEMOPATIE
MALIGNA

genele implicate in
LMC – AFECTIUNE
t(9;22) – BCR 22q11
descoperirea CRONICA
cromozomului Ph si ABL1 9q34
CONTROLABILA
PRIN TERAPIE

1960 1973 1985 2001

cromozomul Ph
provine din prima terapie
cu tinta moleculara
translocatia
reciproca t(9;22)
DE RETINUT!

Cancerul este o afectiune genetica.

Cancerele sunt rezultatul acumularii succesive

de defecte genetice ce genereaza fenotipul malign.

Investigatia genetica este esentiala in managementul

clinic al pacienţilor pentru diagnostic, estimarea
prognosticului si orientarea terapiei.

Anomaliile genetice din cancer necesita

utilizarea unor paneluri de teste genetice pentru
caracterizare diagnostica si monitorizare.