Sunteți pe pagina 1din 42

GENETICA

UMAN

CURS 2
B. STRUCTURA GENOMULUI UMAN
Genomul uman (GU) =
coninutul ADN celular sau
ansamblul integrat al celor 25 de molecule diferite de ADN (24 n
nucleu: 22 autosomi+X+Y i 1 n mitocondrii), = 3,2 miliarde de pb
GU = un genom nuclear (complex, 99,5% ADN) + un
genom mitocondrial (simplu i mic, 0,5%).
U.M.F IAI
2. STRUCTURA GENOMULUI UMAN
GU = un genom nuclear (complex, 99,5% ADN) +
un genom mitocondrial (simplu i mic, 0,5%).
U.M.F IAI
25.000 gene
2.1. GENOMUL NUCLEAR
Enorm (3,2 miliarde pb),
Fragmentat: (22A+X+Y) molecule de ADN + proteine
cromozomi
Complex, heterogen:
ADN nerepetitiv
ADN moderat repetitiv
ADN nalt repetitiv
ADN genic (25%) + ADN extragenic (75%)
U.M.F IAI
2.1. Genomul nuclear
a) ADN GENIC (25%)
Gena = unitatea de
informaie genetic
codific un produs
primar specific
(proteine sau ARN)

Structura genelor este
foarte complex - ADN
genic:
ADN codant = exoni
(10%)
ADN necodant (90%) =
introni, secvene reglare,
gene nefuncionale
(pseudogene) sau
fragmente de gene
U.M.F IAI

b) ADN EXTRAGENIC (75%)
Secvene netrasncrise
(necodante);

Funcii puin cunoscute:
- rol tampon a mutaiilor;
- mperecherea corect a
cromozomilor omologi n meioz i
schimbul egal (CO) de segmente
cromozomiale recombinare
genic surs de variabilitate !!!.
Alctuit din:
ADN nerepetitiv = secvene
unice sau un nr mic de copii
(60%)
ADN repetitiv (40%).
U.M.F IAI

(1) ADN EXTRAGENIC NEREPETITIV (60%)

SECVENELE UNICE sau
SECVENE NTR-UN NR MIC
DE COPII

DUPLICAII
SEGMENTALE (5% GU)
blocuri (~10Kb) ce
flancheaz genele (pe
acelai cromozom) ;
rol n sinapsa corect a
omologilor in meioz * .
Importan:
fiind identice - pot genera
erori de mperechere a
cromozomilor omologi
CO inegal mutaii:
duplicaii /deleii genice
BOLI GENOMICE
U.M.F IAI

(2) ADN EXTRAGENIC REPETITIV (40%)
ADN moderat repetitiv (~30%):
secvene scurte repetate de sute
de mii de ori, dispersate n genom
(ex SINEs i LINEs)

ADN nalt repetitiv (~10%):
secvene foarte scurte, repetate n
tandem , de milioane de ori;
3 tipuri:
ADN satelit
(blocuri HCRT la centromer,
telomere, CS) = rol structural;
ADN minisatelit
(minisatelii hipervariabili),
dispersat n toi cromozomii =
markeri genetici individuali =
folosii n amprenta genetic
ADN microsatelit
U.M.F IAI

3. GENOMUL MITOCONDRIAL
ADNmt cteva mii de copii
per celul = 0,5%
Genomul mitocondrial difer
de genomul nuclear:
mic (16.569 pb);
circular;
neasociat cu proteine;
fr ADN repetitiv;
compact: 97%=secvene
codante
37 de gene:
contigue,
fr introni.
Codul genetic mitocondrial
difer puin de cel nuclear
U.M.F IAI

GENOMUL MITOCONDRIAL
Genomul mitocondrial al
zigotului provine, prin ovul,
exclusiv de la mam.
ADNmt poate suferi mutaii
germinale sau somatice
Mutaiile germinale produc o
serie de boli degenerative n
SNC, SNP, muchi, etc,
care se transmit maternal:
de la mam la toi descendenii;
brbaii bolnavi nu transmit boala

U.M.F IAI

ADNmt poate suferi mutaii somatice, dup
natere:
produse de radicalii liberi de O
2
(generai n mitocondrii);
favorizate de structura ADNmit
(absena histonelor; densitate mare de gene; etc)
Mutaiile se acumuleaz rapid datorit absenei
mecanismelor de reparare
Determin scderea produciei de energie boli
degenerative, cancer i senescen
U.M.F IAI
1. APARATUL GENETIC AL CELULEI
(v. LP 1)
APARATUL GENETIC:
structurile celulare care conin ADN:
nucleul + mitocondriile

(1). NUCLEUL 99,5% ADN

ADN + proteine (fibre) CROMATIN

CROMOZOMI.

Cromatina i cromozomii = dou modaliti diferite
de organizare morfo - funcionl a materialului
genetic n inetrfaz i diviziune.

(2). MITOCONDRIILE 0.5% ADN,
origine exclusiv matern.
U.M.F IAI

2. CROMATINA (v. LP )
2.1. EUCROMATINA I HETEROCROMATINA
U.M.F IAI
Caracteristici EUCROMATINA HETEROCROMATINA
Condensare Fin dispersat Puternic condensat
(cromocentri)
Colorare Slab Intens
Replicare n faza
S
Precoce Tardiv
Activitate
genetic
Activ Inactiv

Compoziie
chimic
Predomin p.b. C - G;
ADN nerepetitiv; proteine
nehistonice
Predomin p.b. A - T; ADN
repetitiv;
proteine histonice
Rol morfologic Alctuiete benzile
R pozitive (sau G
negative)
Alctuiete benzile
R negative (sau G pozitive)
CROMATINA = ADN + proteine
Exclusiv n nucleu!
Dou tipuri morfo-funcionale
distincte:
- EUCROMATINA
activ genetic
dispersat
- HETEROCROMATINA
inactiv genetic
condensat
(cromocentri)
EUCROMATINA I HETEROCROMATINA (v. LP )
HETEROCROMATINA:

constitutiv constant n structura cromozomilor:
benzi G, benzi C (cen, Yq, p A, CS)

facultativ diferit n celule / organisme diferite
(hetrocromatinizarea o form de reglaj genic)
ex., cromatina sexual
U.M.F IAI
2.2. CROMATINA SEXUAL (v. LP )
CROMATINA SEXUAL - definiie:
un corpuscul de HCRT,
cu particulariti morfologice bine definite,
care permite identificare NR cromozomilor sexuali
- determinarea sexului genetic (XX sau XY);
- anomaliile cromozomilor sexuali (XO, XXX, XXY).
La femeie: cromatina X (corpusculul Barr)
La brbat: cromatina Y (corpusculul F)
U.M.F IAI
poziie, mrime,
form ali
cromocentri
Morfologie v.LP
= cromocentru
ORIGINEA CROMATINEI SEXUALE
CROMATINA X:
rezult prin inactivarea unui cromozom X (la femeile XX) va forma
(prin heterocromatinizare) corpusculul Barr



Ipoteza Lyon (1961):
(1) inactivarea cromozomului X este total; ambele sexe
un singur X activ.
(corect = parial* regiuni/gene active n ambii cromozomi X)
(2) se produce precoce (i.u) i este definitiv;
(posibil = uneori reversibil)
(3) are loc la ntmplare (X
M
sau X
P
) i independent n fiecare celul
(posibil = uneori ne ntmpltoare)
U.M.F IAI
Numrul c. Barr = suma cromozomilor X inactivi
(numrul cromozomilor X = nr. c. Barr + 1)
U.M.F IAI
DIAGNOSTIC Femeie Brbat
Nr. C. Barr
0 1 2 0 1 2
Sex genetic
(n stri intersex)
XX XY
Anomalii de numr
cromozomi sexuali
n obs. clinice de
disgenezii gonadice
XO XXX XXY
XXYY
XXXY
CROMATINA SEXUAL
CROMATINA Y:
reprezint heterocromatina de pe 2/3 distale bra lung
cromozom Y
(colorat cu flurocromi ex., quinacrin i vizibil
la microscop UV ca un corpuscul fluorescent )
corpuscul F)
exclusiv la barbati
Nr. corpusculi F = nr. cromozomi Y
ex., brbaii XYY au 2 corpusculi F
U.M.F IAI
2.3. STRUCTURA SUPRAMOLECULAR A
CROMATINEI
Analiza cromatinei la
microscopul electronic
evideniaz un sistem
ierarhizat de
compactare a
moleculei de ADN
fibre de cromatin,
de dimensiuni diferite,
alctuite din ADN,
histone i proteine
nehistonice.
U.M.F IAI
1) Filamentul cu nucleozomi (10nm)
Un segment de ADN (146 pb)
- se nfoar (1 tur i 3/4)
- n jurul unui "miez" histonic,
cilindric (8 mol.) un
NUCLEOZOM.
Nucleosomii legai printr-un
segment de ADN liniar (60
p.b.) FILAMENTUL CU
NUCLEOZOMI
(~ "irag de mrgele").
FN - meninut mpachetat de
ctre histona H1, ce leag doi
nucleozomi vecini.
Rat de "compactare" a ADN
nativ este de circa 10:1
U.M.F IAI

2) Fibra de cromatin (30nm)
Filamentul cu nucleozomi se spiralizeaz n
solenoid fibra de cromatin (FC) (30 nm)
Rat de "compactare" a filamentului cu nucleozomi
este de circa 5:1
U.M.F IAI

3) Fibra pliat n bucle laterale (300 nm)
FC (30 nm) se pliaz n
bucle laterale ataate la
un schelet de proteine
nonhistoince FPBL =
300nm
O bucl (domeniu crs)
de ~75Kb cteva gene =
unitate funcional (de
transcripie i replicare).
Rat de "compactare" este
de circa 10:1
U.M.F IAI
4) Cromozomul metafazic (300 nm)


n profaz fibra de
cromatin se
condenseaz (20:1)
cromatida (700 nm)
unui cromozom
Cromozomii grad
maxim de condensare
n metafaza diviziunii
U.M.F IAI

STRUCTURA SUPRAMOLECULAR A CROMATINEI
sintez


ADN FILAMENT F I B R A F I B R A CROMATIDA
CU DE PLIAT UNUI
NUCLEOSOMI CROMATIN N BUCLE CROMOZOM

INTERFAZA DIVIZIUNE

Fiecare cromatid are o singur molecul de ADN
organizat n mai multe structuri succesive i ierarhizate,
compactat de ~ 10.000 ori, pentru a face posibil:
localizarea n nucleu
distribuia corect a materialului genetic n diviziune
U.M.F IAI
STRUCTURA SUPRAMOLECULAR A CROMATINEI
Sintez
Buclele fibrei de 300 nm se
fixeaz neregulat de scheletul
proteic:
zone cu mici aglomerri =
cromomere
zone mai laxe

Prin condensarea cromatidei n
profaz,
cromomerele se unesc i
formeaz benzi intens
condensate i colorate (benzi
G + = heterocromatin)
care alterneaz cu benzi mai
puin condensate i mai clare
(benzi R + = eucromatin).
U.M.F IAI

STRUCTURA SUPRAMOLECULAR A CROMATINEI

Sintez

Fiecare cromozom are o
structur intern
eterogen
caracteristic
(permite identificarea
lui
precis)
U.M.F IAI

3. CROMOZOMII UMANI
CROMOZOMI = organite
nucleare care fixeaz
intens colorani bazici
(chroma + soma)

Funcii:
Transport + distribuie
materialul genetic n cursul
diviziunii stabilitatea
proceselor ereditare.
Asigur recombinarea
genetic n meioz
U.M.F IAI

3.1. MORFOLOGIA CROMOZOMILOR UMANI
a). Elemente comune tuturor cromozomilor:
(1) COMATIDELE
- Crz = bicromatidian dup
replicare;
- Cromatidele surori 1
molecul de ADN + Pr
U.M.F IAI
Cromatidele
Centromerul
Telomerele


a). Elemente comune tuturor cromozomilor
(2) CENTROMERUL

locul de ataare a cromatidele
surori (prin proteina ISS)
unic constricie primar
mparte cromatidele n braele
p i q
poziie fix determinat de o
secven ADN repetitiv (ADN
satelit) identic la toi
cromozomii) + ADN specific
fiecrui cromozom;
cromozomi M, SM, A
U.M.F IAI

a). Elemente comune tuturor cromozomilor
(2) CENTROMERUL

Rol esenial pentru
SEGREGAREA
cromozomilor din
cursul diviziunii
celulare:

La ADN cen se
fixeaz proteine
CENP = kinetocorii
locul de fixare a
filamentelor fus de
diviziune ce vor
tracta cromatidele la
poli (n anafaz)
U.M.F IAI
a). Elemente comune tuturor cromozomilor
(3) TELOMERELE = structuri
specializate, formate din ADN
repetitiv + proteine asociate,
care acoper i protejeaz
capetele cromozomilor.

Funcii:
meninerea integritii structurale;
asigurarea replicrii complete;
poziionare cromozomilor omologi n
nucleu
U.M.F IAI
b). Elemente caracteristice unor cromozomi
(1) SATELIII = mase mici de
heterocromatin ataate pe braele
scurte ale cromozomilor acrocentrici
(exceptnd Y) = variante normale

(2) CONSTRICIILE SECUNDARE= blocuri
de heterocromatin situate pe 1q, 9q,
16q lng centromer = variante
normale

(3) SITUSURILE FRAGILE = lacune
necolorate pe cromatidele unor
cromozomi. Majoritatea = variante
normale; excepie fra Xq27 asociat cu
retard mintal
= Sdr. X fragil (RMLX-1:4000 nn)
U.M.F IAI
c). Elemente specifice fiecrui cromozom: BENZILE
Prin diferite tratament
se observ pe
cromozomii metafazici o
serie continu de benzi
longitudinale,
- unele intens colorate
(benzi G)
- ce alterneaz cu benzi
slab colorate (benzi R)
U.M.F IAI

c). Elemente specifice fiecrui cromozom: BENZILE
Benzile reflect
structura
intern,
heterogen, a
cromozomilor.
Fiecare
cromozom are
un model
caracteristic de
benzi
identificarea sa
precis.
U.M.F IAI

3.2. TEHNICI DE ANALIZ CROMOZOMIAL
(v LP)
a). Principiile metodelor (!!!)
(1) Obinerea de celule n diviziune:
Culturi celulare: limfocite, fibroblaste, celule fetale (
amniocentez);
- 0,5 ml snge periferic (recoltat steril, pe heparin) mediu
cultur cu PHA (stimuleaz diviziunile) 72 ore
esuturi care se divid activ: mduv osoas ( punvie
medular), trofoblast ( placentocentez);
(2) Obinerea de celule n metafaz: blocare cu colchicin
(3) Obinerea preparatelor: hipotonizare, fixare, etalare
pe lame, colorare, tehici de marcaj n benzi.
(4) Analiza preparatelor* cariotip
U.M.F IAI
EVOLUIA
TEHNICILOR DE ANALIZ CROMOZOMIAL
(v LP)
(1) TEHNICI DE GENERAIA I
(1956)
- cromozomi uniform
colorai;
- identificare imprecis*

(2) TEHNICI DE GENERAIA II
(1970)
- marcaj n benzi G sau R
cromozomi metafazici
(400 benzi);
- identificare precis
U.M.F IAI


TEHNICI DE ANALIZ CROMOZOMIAL (v LP)
(3) TEHNICI DE
GENERAIA III (1977)
- nalt rezoluie:
cromozomi
pro-matafazici
(550 benzi) sau
profazici
(850 benzi)
- o band = 3-5 Mb
U.M.F IAI
M PM P


TEHNICI DE ANALIZ CROMOZOMIAL
(v LP)
(4) TEHNICI DE GENERAIA IV
(1991)
- citogenetic molecular
- FISH metafazic
- se pot identifica f. precis
remanierile cromozomiale i
microdeleiile
- FISH interfazic
U.M.F IAI
Ce este FISH ?
tehnic de analiz
cromosomic
F fluorescence
I in
S situ
H hybridization
Hibridare fluorescent
in situ
Tehnic molecular
pentru detecia
anomaliilor cromosomice
Tehnic molecular
pentru localizarea
secvenelor genice
PRINCIPIUL TEHNICII FISH
Hibridare (formare de legturi de hidrogen) ntre o sond specific
de ADN (marcat fluorescent sau imunohistochimic) i secvena
complementar prezent ntr-un anumit segment cromosomic

hibridizarea se bazeaz pe legea complementaritii bazelor
azotate, conform creia n moleculele de ADN se formeaz
urmtoarele perechi:
A-T
C-G
PRINCIPIUL TEHNICII FISH

a. Proba i ADN int
b. Marcarea probei
indirect (stg.) i direct
(dr.)
c. Denaturarea probei i a
ADN-ului int
d. Hibridarea ntre prob
i ADN-ul int
e. Fixarea fluoroforului la
hapten (marcaj indirect)
AVANTAJELE TEHNICII FISH
SENSIBILITATE I SPECIFICITATE CRESCUTE
TIMPUL SCURT DE OBINERE A REZULTATELOR DEFINITIVE;
POSIBILITATEA ANALIZEI DE CELULE N DIVIZIUNE SAU
INTERFAZ
REZOLUIE MARE (sonde de pn la 40 kb)
DEZAVANTAJELE TEHNICII FISH
COSTUL RIDICAT AL SONDELOR I REACTIVILOR;
COSTUL RIDICAT AL APARATELOR FOLOSITE
GRADUL NALT DE TEHNICITATE