16.

Hibridarea si cibridarea celular la plante si animale : principii, etape i aplicaii n

biotehnologii
Fenomenul de hibridare a celulelor a fost observat n anii 1960 cnd doi cercettori francezi au
cultivat mpreun dou linii celulare de oarece care aveau numrul modal (majoritar de !! respectiv 6"
cromozomi# constatndu$se c celulele hibride n%lobau apro&imativ cromozomii celor dou linii# avnd
11! $ 116 cromozomi'
Principii:
Hibridarea celulelor somatice presupune realizarea spontan sau indus a fuziunii ntre dou (sau mai
multe) celule somatice diferite rezultnd o celul hibrid care nglobeaz cromozomii celulelor parentale.
Agenii inductori ai fuziunii celulare care mresc frecven(a fuziunii sunt) virusul endai inactivat#
polietilen%licolul# virusul leucozei bovine# ionii de calciu (*a"+# deriva(i ai unor lipide#
electrofuziunea etc'
,ibridarea poate fi)
! intraspeci"ic# cnd se poduce ntre celule diferite apar(innd aceleeai specii (de
e&emplu ntre limfoblast & fibroblast murin-
! interspeci"ic# cnd se realizeaz ntre celule apar(innd unor specii diferite (de
e&emplu) om & oarece# oarece & %in# obolan & oarece# om & (n(ar#
,ibridarea ntre celule somatice de la aceeai specie duce la ob(inerea de homocarioni iar hibridarea
ntre cellule somatice de la specii diferite duce la ob(inerea de heterocarioni' Celulele hibride provin
doar din heterocarioni. .ceti heterocarioni fie nu se divid i dispar sau ncep s se divid i nucleii lor
fuzioneaz dnd natere unor celule hibride mononucleate'
#elula mononucleat care nglobea$ materialul genetic al ambelor linii parentale este un
sincarion sau o celul hibrid.
%&'(A)*A #*(+(*(') H%,)%-*
/zolarea celulelor hibride din amestecul de celule se poate face prin metode selective i neselective'
0etodele neselective presupun e&aminarea i selec(ia dup criterii morfolo%ice i de aceea sunt mai
dificile i nu se mai practic n prezent'
0etodele selective se bazeaz pe utilizarea unor medii de cultur selective# care favorizeaz
proliferarea celulelor hibride i inhib creterea sau chiar omoar specific celulele parentale' 1n astfel
de mediu este mediul HA. (,ipo&antin# aminopterin# timidin'
Hipo/antina este substratul pentru enzima hipo/antin!guanin!"os"oribo$il!trans"era$a sau H0P)..
Aminopterina inhib calea principal de sintez a precursorilor .23$ului- n prezen(a acesteia
celulele trebuie s se bazeze e&clusiv pe calea de salvare pentru sinteza precursorilor .23$ului
.imidina este substratul pentru enzima .imidin!1ina$a sau .2.
*ea mai obinuit metod de selec(ie a celulelor hibride se bazeaz pe biochimia sintezei .23$ului'
*ele mai multe celule eucariote au dou ci metabolice de sintez a precursorilor .23
$ calea principal sau de novo# responsabil de sinteza celei mai mari pr(i a precursorilor-
$ calea de salvare# o cale secundar obinuit# care folosete schelete moleculare deja e&istente'
Aminopterina inhib calea principal de sintez a precursorilor i a .23$ului- n prezen(a acesteia
celulele trebuie s se bazeze e&clusiv pe calea de salvare pentru sinteza precursorilor .23$ului
1
Calea de salvare utilizeaz mai multe enzime# dintre care dou au o importan( special pentru metoda
fuziunii celulare)
,4567 mediaz ncorporarea purinelor (.#4 n structura .23$ului'
i 78 mediaz ncorporarea pirimidinelor (7#* n structura .23$ului
*elulele care sunt defective (lipsite att n ,4567 (celulele ,4567$ ct i n 78 (celulele 78$ nu
pot ncorpora precursorii .23$ului prin intermediul cii de salvare- 5entru creterea celular i
selectarea celulelor fuzionate este necesar e&isten(a enzimelor ,4567 i 78 n mediul de cultur
.ehnica de lucru pentru i$olarea celulelor hibride
*elulele umane defective n 78
$
sunt amestecate cu celule de oarece defective n ,4567
$
ntr$un
mediu care con(ine aminopterin' 2ac are loc fuziunea acestor celule# fiecare linie de celule parentale
contribuie cu o copie de %ene care este defectiv pentru cealalt linie' Hibridul celular om / oarece
care se formeaz este hetero$igot pe gena H0P). (adic este ,4567+ 9 ,4567$ i hetero$igot
pe gena .2 (adic 78+9 78$ ' 5rintre celulele fuzionate se vor ntlni hibrizi oarece & oarece care
vor fi ,4567! 3! hibrizi om & om care vor fi 78$ n timp ce hibri$i celulari om / oarece vor avea
pre$ente genele active H0P).4 i .24 care codific cele dou enzime i astfel numai aceste celule
vor "i capabile s creasc pe mediul HA..
Aplicaiile celulelor hibride
1. cartogra"ierea genelor
5. producerea de anticorpi monoclonali
1. #A).'0)A6%*)*A 0*7*(') #+ A8+.')+( H%,)%&%(') #*(+(A)%
Prin cultura celulelor hibride timp ndelungat se observ eliminarea pre"erenial a
cromo$omilor unei specii. :n cazul celulelor hibride om & oarece are loc eliminarea cromozomilor
umani # fenomen care a fost apoi folosit cu succes pentru ntocmirea hr(ii %enetice la om# adic pentru
plasarea %enelor n anumite locusuri pe cromozomii umani'
.ehnica de lucru presupune utilizarea unor linii celulare de oarece defective n anumite enzime' 2e
e&emplu atunci cnd au fost utilizate la hibridare celule de oarece defective n 78 (78
$
acestea nu se
puteau dezvolta sin%ure n mediu ,.7' 5entru a ;i putea sintetiza precursorii i pentru a fi sintetizat
.23$ul era nevoie de %ena 78 activ' .ceast alel este furnizat de celulele umane iar hibrizii om &
oarece# heterozio%o(i 78
+
978
$
# pot sintetiza precursorii .23 prin intermediul cii de salvare' :n
mediul de cultur s$au dezvoltat doar aceti hibrizi' 5rin cultivarea lor ndelun%at hibrizii au pierdut
cromozomii umani cu e&cep(ia cromozomului 1<' 2e aici s$a tras concluzia c pe acest cromozom se
%sete %ena responsabil pentru sinteza timidin$=inazei (78 i astfel a fost carto%rafiat aceast %en
pe cromozomul 1< uman' /n mod similar# prin hibridarea celulelor umane cu celulele de oarece
,4567$# s$a observat c hibrizii celulari re(in cromozomul uman 9 i pot fi selec(iona(i n mediu ,.7
iar aceast %en a fost plasat pe cromozomul uman >'
5. %7.*&A -* A7.%#')P% :'7'#('7A(% #+ A8+.')+( #*(+(*(') -* .%P
H%,)%-':A
"
#elulele hibridoma sunt celule hibride# rezultate din fuziunea celulelor tumorale mielomatoase cu
celule lim"oide izolate de la oareci imuniza(i n prealabil cu un anti%en dat (hematia de oaie' /n
hibridul celular sunt e/primate at;t genele din celulele mielomice care asi%ur reproducerea
celular inde"init, ct i genele din lim"ocitele oarecilor imuni$ai care asigur speci"icitatea
produciei de anticorpi.
Liniile de celule tumorale folosite pentru obinerea hibridoamelor:
5ot fi folosite numai acele linii mielomatoase mutante caracterizate prin pre$ena unui de"ect
metabolic indus e/perimental (lipsa unei anumite enzime' .ceste celule pot fi ntre(inute n
cultur i pot fi eliminate cu uurin( dintr$un amestec n care sunt prezente i alte tipuri de
celule care nu au deficien(a metabolic'
Limfocite folosite pentru obinerea hibridoamelor
5entru ob(inerea unor anticorpi monoclonali de natur murin se pot folosi celule limfoide
izolate din splina oarecilor imuniza(i intravenos cu anti%enul mpotriva cruia vor fi produi
anticorpii'
5entru ob(inerea hibridoamelor de natur uman# uneori pot fi folosite celulele limfoide din
splin sau din %an%lioni limfatici' *ea mai facil surs de limfocite umane este sn%ele
periferic' ?imfocitele periferice# izolate din sn%e sunt purificate prin nlturarea limfocitelor 7
supresoare# n prezen(a anti%enului dorit i sunt cultivate in vitro pe medii selective
+.%(%&A)%) Anticorpii monoclonali sunt utilizai pentru )
$ tratamentul unor "orme de cancer) de e&emplu# anumite tipuri de leucemii# unele limfoame
(tumori ale celulelor limfocitare# unele tumori ale colonului# ale snului sau ale pancreasului
etc'# prezint anti%ene specifice la suprafa(a membranelor celulare tumorale i ca urmare ele pot
fi (inte pentru anticorpii monoclonali specifici acestor anti%ene'
$ pentru diagnosticul precoce n tumori maligne sau metasta$e
$ testarea compatibilitii ntre donor i receptor n ca$ul gre"elor
$ combaterea unor boli virale
#%,)%-A)*A #*(+(A)<
#ibridarea celular este o variant a hibridrii celulare n care va "u$iona o celul intact nucleat
cu o celul enucleat (citoplast n prezen(a virusului Sendai sau a polietilen%licolului'
*itoplasmele enucleate sunt denumite citoplati n timp ce nucleii purifica(i se numesc carioplati.
!uzionarea unor celule "ntre#i de la o linie celular cu citoplati provenii de la o alt linie celular$
"n prezena virusului Sendai$ va conduce la obinerea de cibrizi.
.plica(iile cibridrii celulare )
transferul la cibrizi a unor caractere "enotipice determinate de ereditatea citoplasmatic#
studiul in vitro al "enomenului de mbtr;nire celular#
demonstrarea incompatibilit(ii interspecifice (pentru e&presia unor %ene umane n hibrizi i
cibrizi om & oarece'
@