16.

Hibridarea i cibridarea celular la plante i animale : principii, etape i aplicaii n biotehnologii

Hibridarea celular
Hibridarea celular, hibridarea somatic sau hibridarea parasexuat, presupune fuziunea spontan sau
indus, a dou celule somatice, diferite n urma creia rezult un hibrid somatic, care nglobeaz materialul
genetic nuclear i citoplasmatic al formelor parentale. Rezult astfel o celul binucleat, denumit
homocarion, dac celulele parentale sunt de acelai fel, sau un heterocarion* dac fuzioneaz celule diferite.
Hibrizii celulari sunt produi numai de ctre heterocarioni. Dup parcurgerea unui ciclu celular, cei doi nuclei
fuzioneaz, formnd un sincarion, respectiv o celul mononucleat, care nglobeaz materialul genetic al
ambelor linii parentale.
La animale, fuziunea celulelor somatice se realizeaz uor, deoarece aceste celule prezint numai
membran plasmatic, fr perete celular. Hibridarea somatic se obine prin cultivarea celulelor parentale pe
un mediu artificial, n prezena virusului Sendai, inactivat cu ajutorul radiaiilor UV, a ionilor de calciu i la un
pH cuprins ntre 7-8. La animale s-au obinut celule hibride parasexuale de omxoarec, ginxoarec, etc.
Hibridarea celular la plante este condiionat de obinerea prealabil a protoplatilor. Protoplastul este o
celul vegetal nud, nconjurat de membrana plasmatic, adic o celul a crei perete celular a fost
ndeprtat prin digestie enzimatic cu pectinaz i celulaz.
Cultura protoplatilor se realizeaz pe un mediu de baz MS (Murashige-Skoog, 1962), care conine zahr,
vitamine, substane minerale i hormoni de cretere, la temperatura de 24-26C, lumin difuz i pH de 5,55,7.
Fuziunea protoplatilor poate avea loc n mod spontan, atunci cnd densitatea este de IO3-IO6
protoplati/ml, sau n mod indus, sub aciunea unor factori favorizani, fizici sau chimici. Agenii fuzionani
chimici sunt reprezentai de polietilenglicol (PEG), ionii de calciu, azotatul de sodiu i pH de 10.
Fuziunea protoplatilor se realizeaz prin centrifugare sau electrofuziune n prezena ageniilor favorizani
fizici. Electrofuziunea protoplatilor are loc sub aciunea impulsurilor electrice, la o intensitate de 9-12|iA, o
tensiune de 200V/cm, aplicate alternativ, cteva secunde. Fuziunea protoplatilor are loc n cmp electric care
i polarizeaz devenind formaiune dipolic, ceea ce le asigur deplasarea i aranjarea n lanuri dispuse
perpendicular pe electrozi. ocul electric ulterior, de 2000V/cm, cu durata de 10-50jisec va determina ruperea
membranelor celulare i fuziunea protoplatilor. Tehnologia obinerii de hibrizi celulari la plante ncepe cu
izolarea enzimatic a
Actualmente ansamblul acestor operaii este posibil la un numr limitat de specii: tutun, petunia, tomate,
lucerna. n anul 1978 a fost creat pomata prin hibridarea parasexual a cartofului cu tomatele. Acest hibrid
deosebit a demonstrat foarte bine importana fuziunii protoplatiilor, dar a rmas totui o curiozitate de
laborator, tar aplicaie agronomic, deoarece florile sunt sterile.
A produce plante noi nu este unicul scop deoarece, fuziunea protoplatiilor ofer i alte oposibiliti:
introducerea de organite celulare, cloroplaste, mitocondrii. De exemplu informaia genetic privind rezistena
la diferite erbicide este localizat n cloroplaste iar cea de sterilitate mascul (ms), n mitocondrii. n anumite
cazuri prin fuziuni de protoplati se pot remedia deficiene aprute n urma hibridrii intraspecifice. Hibridul
(Raphanus sativum x Brassica olerace) x Brassica oleracea este steril, fr valoare agronomic, deoarece
plantele prezint defecte clorofiliene (sunt galbene) i florile nu au nectar. Pentru a se nltura aceste
deficiene s-a procedat la fuziune de protoplati hibrizi cu protoplati normali de la rapi. n felul acesta s-a
reuit regenerarea unor plante care posed recombinarea favorabil a celor trei informaii genetice; nucleul i
cloroplastele de la rapi i mitocondriile de la ridiche (G. Pelletier i colab.,1983). Plantele sunt verzi florile
au nectar i sunt mascul sterile. Tehnica de fuziune a protoplatilor apare astfel ca un instrument
complementar al metodelor tradiionale, deosebit de promitor, pentru a atinge obiective pn acum
inaccesibile.
Izolarea celulelor hibride are loc pe baza unor proprieti fizice sau morfologice ale hibrizilor, care nu apar
la formele parentale (structur, culoare, fluorescent) precum i prin utilizarea unor markeri genetici de

rezisten la antibiotice, erbicide ori a unor mutante biochimice auxotrofe.

Aceste modaliti de izolare a hibrizilor celulari sunt aplicate la un numr limitat de specii, iar n cazul
utilizrii lor, nu poate fi demonstrat la nivel molecular transferul caracterului respectiv.
In prezent este frecvent utilizat ca marker de selecie neomicin-fosfotransferazfl II (NPTII), o enzim ce
detoxific prin fosforilare compuii aminoglucozidici.
Dup izolarea celulelor hibride, urmeaz regenerarea plantelor hibride, sub aciunea hormonilor vegetali,
din grupa auxinelor i a kinetinelor (Fig. 14.11).
Importana hibridrii celulare se regsete n special n programele de ameliorare a plantelor. Prin fuziunea
protoplatilor se pot obine hibrizi ntre specii incompatibile sexuat sau hibrizi asimetrici, ca urmare a
eliminrii selective a unor cromosomi la hibrizii obinui din specii ndeprtate.
Hibrizii simetrici sau asimetrici se obin n urma fuziunii celulare caz n care informaia genetic nuclear
aparine ambelor specii, respectiv acetia rezult prin pierderea potenial (unidirecional) a cromosomilor
aparinnd unuia dintre speciile parentale.
Formarea hibrizilor asimetrici este consecina incompatibilitii somatice i este cu att mai pregnant cu
ct formele parentale sunt mai ndeprtate genetic.
Fuziunea protoplatilor de la aceeai specie conduce la obinerea unor varieti poliploide, operaiune ce
necesit foarte mult timp dac este realizat pe alte ci. Prin hibridare somatic pot fuziona genomuri
nucleare, care unesc caractere agronomice favorabile.
n domeniul animai, o realizare deosebit o reprezint obienrea hibridoamelor, prin fuziunea dintre
limfocitele B i celulele mielonice, celule hibride care permit obinerea anticorpilor monoclonali n cantiti
mari i la preuri reduse.
Cibridarea celular
Cibridarea celular este o variant a hibridrii celulare care const n fuziunea a dou celule somatice n
urma creia rezult un cibrid celular care nsumeaz materialul genetic citoplasmatic de la ambele celule, dar
poart materialul genetic nuclear doar de la o singur celul. Citoplasmelc enucleate se numesc citoplad, iar
nucleii purificai se numesc carioplati.
Citoplaiii conin majoritatea organitelor celulare fiind capabile s realizeze sinteze proteice specifice.
Tehnologia cibridrii a permis transferul unor caractere determinante de plasmagene la cibrizi i posibilitatea
de cartare a genelor.
Obinerea cibrizilor se realizeaz prin diverse metode care pretind n general etape de lucru asemntoare.
n toate cazurile celulele formelor parentale sunt pregtite diferit. Astfel, o celul este cu structur activ, n
timp ce, ceea de-a doua are nucleul inactivat: chimic (iodoaeetat) ori prin iradiere, sau este enucleat.
Hibridarea somatic cu celulele normale, provenite de la specii ndeprtate filogenetic dar la care are loc
eliminarea selectiv a cromosomilor de la un singur partener, genereaz de asemenea cibrizi.
Hibridarea celular a asigurat formarea de cibrizi cu caracteristici determinate de gene citoplasmatice.
Astfel, s-a realizat ntr-un timp scurt convertirea unor linii androfertile n linii citoplasmatic androsterile,
utilizate n procesul producerii de smn hibrid fr castrare, rezolvndu-se n consecin problema
controlului polenizrii ncruciate. De asemenea, cibridarea celular permite manifestarea unor noi combinaii
dintre mitocondrii i cloroplaste.
Prin cibridare celular este posibil manipularea genelor citoplasmatice, n vederea obinerii unor linii
celulare rezistente la boli i duntori, stresul climatic, exces de sruri, pesticide etc.
Variabilitatea somaclonal
Variabilitatea somaclonal poate fi definit ca variabilitatea genetic existent la plantele regenerate in
vitro din culturi de celule sau esuturi somatice. Deoarece toate celulele unui organism au o origine comun,
iar la baza multiplicrii celulelor somatice st mecanismul mitozei, care are un caracter conservativ, asigurnd
identitatea celulelor fiice, toi descendenii ar trebui s fie identici. Totui, n timpul procesului de cultivare in

vitro a celulelor i esuturilor, pot avea loc modificri frecvente. n totalitatea lor, aceste modificri formeaz
variabilitatea somaclonal, care se transmite ereditar.
Cauzele variabilitii somaclonale
Poliploidia i aneuploidia sunt frecvente n culturile in vitro. Poliploidia este generat de activitatea
incorect a fusului de diviziune sau endoreduplicrii cromosomilor. Aneuploidia poate fi generat de
comportarea defectuoas a cromosomilor n mitoz (nondisjuncii) sau de fragmentarea nuclear, urmat de
mitoz.