Sunteți pe pagina 1din 35

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN VETERINAR BUCURETI FACULTATEA DE MBUNTIRI FUNCIARE I INGINERIA MEDIULUI SPECIALIZAREA PROTECIA MEDIULUI

MICROBIOLOGIE - NOTE DE CURS Conf. Dr. Irina Grebenian

MORFOLOGIA BACTERIILOR 1. Bacteriile sferice (cocii) au form sferic, ovoid, elipsoidal, reniform, diametrele celulei fiind aproximativ egale. Cocii se pot grupa n ase subtipuri morfologice n funcie de poziia celulelor fiice dup diviziune: -coci simpli sau izolai; -diplococi celulele sunt grupate cte dou Streptococcus pneumoniae; -streptococi celulele formeaz lanuri Streptococcus thermophilus; -tetracoci celulele sunt grupate cte patru Micrococcus tetragenes; -sarcina celulele sunt grupate n cuburi Sarcina lutea; -stafilococi celulele sunt grupate sub form de ciorchine Staphylococcus aureus 2. Bacterii cilindrice (bacili) au form de bastonae care pot fi filamentoase sau sferic-ovale cocobacili Bacillus subtilis, Clostridium sp., Lactobacillus plantarum, Pseudomonas sp. Bacilii pot fi drepi sau uor curbai cu capete drepte sau rotunjite, pot fi izolai sau grupai cte doi diplobacili, n lanuri streptobacili, palisad (ca un gard), rozet sau stea. 3. Bacterii spiralate sau elicoidale cuprind trei subtipuri morfologice: -vibrionul n form de virgul Vibrio cholerae; -spirilul n form de spiral cu spire rigide Spirillum volantus; -spirocheta n form de spiral cu spire flexibile Treponema, Leptospira 4. Bacterii filamentoase sunt reprezentate de actinomicete i prezint asemnri morfologice cu fungii, formeaz hife cu tendin de ramificare i spori. Bacteriile din genul Streptomyces sunt cunoscute ca fiind productoare de antibiotice: streptomicina, cloramfenicolul, kanamicina, tetraciclina; enzime i compui antitumorali.

5. Bacterii ptrate au fost izolate din ape hipersaline din Peninsula Sinai; prezint vacuole cu gaz care dispar la presiune; formeaz grupuri de 8-16 ptrate. n funcie de condiiile de mediu, bacteriile i pot modifica forma acest proces numindu-se pleomorfism la Ptoteus mirabilis celulele pot fi de form bacilar (de obicei) sau filamente lungi (mai rar) i la Haemophilus celulele pot fi sub form filamente sau cocobacili. 1.2. STRUCTURA CELULEI BACTERIENE 1.2.1. PERETELE CELULAR Este un nveli rigid care asigur celulei protecie fa de ocurile osmotice, susinere mecanic i determin forma celulei bacteriene. Celulele lipsite de perete celular se numesc protoplati. Particip la procesul de cretere i diviziunea celular. Conine constitueni cu rol de factori antigenici, de receptori pentru bacteriofagi, de recunoatere a celulelor capabile de conjugare. Conine enzime autolitice care degradeaz peptiglicanul n cursul sporulrii sau biosintezei peretelui celular. La eubacterii peretele celular este constituit din peptidoglican murein. La arhebacterii peretele celular este constituit din pseudomurein. Peptidoglicanul este un polimer alctuit din: -acidul N-acetilmuramic i N-acetil glucozamina unite ntre ele prin legturi -1,4 glicozidice, formnd lanuri liniare (componenta glicanic); -tetrapeptid (componenta proteic) constituit din: *aminoacizi cu dou grupri amino (lizina) ntre care se stabilesc legturi ncruciate ntre lanurile glicanice; *aminoacidul acid diaminopimelic n funcie de structura i de compoziia chimic, peretele celular bacterian poate fi colorat specific, bacteriile fiind ncadrate din acest punct de vedere n trei tipuri: 1. Gram pozitive; 2. Gram negative; 3. acidorezistente. 1.Bacteriile Gram pozitive 80-90% din greutatea uscat a peretelui celular este reprezentat de peptidoglican; Peretele celular conine acizi teichoici i acizi teichuronici legai covalent de peptidoglican; Peretele celular poate fi degradat de lizozim care hidrolizeaz legturile dintre acidul N-acetil muramic i N-acetil glucozamina, sau endopeptidaze care rup legturile dintre tetrapeptidele din peptidoglican; 2. Bacteriile Gram negative Peretele celular nu conine acizi teichoici i teichuronici; Prezint membran extern care este constituit din (fig. 1): -fosfolipide (35%); -lipopolizaharide (50%); -proteine membranare globulare; -lipoproteine; -proteine cu rol n transportul membranar (porine).

1.2.2. SPAIUL PERIPLASMIC Compartiment prezent doar la bacteriile Gram negative, este delimitat la exterior de membrana extern, iar la interior de membrana citoplasmatic. La nivelul su sunt eliminate enzime precum: fosfataza alcalin, fosfodiesteraza ciclic, DN-aze, RN-aze sau alte proteine neenzimatice cu rol de legare i transport a diferitelor substane (glucide, aminoacizi, ioni anorganici). Chemoreceptorii ce sunt implicai n rspunsul chemotactic sunt localizai la nivelul spaiului periplasmic. 1.2.3. MEMBRANA PLASMATIC Separ citoplasma de suprafaa intern a peretelui celular, de care este lipit datorit diferenei de presiune osmotic ntre coninutul celular i mediul extern. Reprezint singura structur citoplasmatic permanent a celulei bacteriene cu rol de delimitare a spaiului intracelular. Este constituit din dou straturi de fosfolipide n care sunt incluse proteine membranare. Bistratul fosfolipidic prezint o extremitate hidrofob orientat spre interiorul membranei i una hidrofob orientat spre exteriorul membranei. Proteinele membranare sunt inclavate n bistratul fosfolipidic, fiind asociate cu regiunea hidrofob a lipidelor i avnd rol n transportul unor substane n interiorul celulei. Poate forma sisteme de membrane (mezosomii) care se ramific n citoplasm sau care se pot separa devenind entiti aparent independente. Funcioneaz ca o barier osmotic, fiind impermeabil pentru anumite tipuri de molecule i permeabil pentru altele. 1.2.4. CITOPLASMA Este considerat ca fiind un sistem coloidal complex format din proteine, glucide, lipide, ap, substane minerale. Aspectul variaz n funcie de vrsta microorganismului i de condiiile de mediu: -la celulele tinere apare ca o mas dens, omogen, intens colorat; -la celulele mbtrnite capt o structur granular, cu vacuole evidente i o coloraie slab. Conine cantiti mari de ARN (ceea ce explic bazofilia intens n celulele tinere). n interiorul citoplasmei se gsesc: nucleoidul, ribosomii, incluziunile, vacuolele i ceilali constitueni ai protoplastului. 1.2.5. NUCLEOIDUL Constituie echivalentul bacterian al nucleului de la celulele eucariote, fiind lipsit de membran nuclear i inclavat direct n citoplasm. Este constituit dintr-o macromolecul de ADN cu dimensiuni foarte mari (1400 m lungime i 2,5 nm diametru) n raport cu dimensiunea celulei bacteriene (0,5-1 m x 3-6 m) ceea ce presupune o mpachetare a ADN. Greutatea molecular a ADN cromosomal bacterian variaz ntre 109 i 1010, coninnd 4x106 perechi de nucleotide. Bacteriile sunt haploide avnd un singur cromosom, ns n celulele tinere aflate n faza exponenial de cretere pot fi 2-4 copii cromosomale provenite din replicarea rapid a cromosomului parental. 1.2.6. RIBOSOMII Sunt particule nucleoproteice intracitoplasmatice, formate din ARNr i proteine ribosomale, fiind implicate n procesul de sintez a proteinelor. Celulele aflate n faza de cretere logaritmic au n citoplasm 1.500 pna la 100.000 de ribosomi. Ribosomii prezeni n celulele procariote au constanta de sedimentare 70 S i sunt alctuii din dou subuniti:

-subunitatea mare de 50 S format din molecule de ARNr 23 S i ARNr 5 S asociate cu 34 proteine ribosomale diferite; -subunitatea mic 30 S format din ARNr 16 S i 21 proteine ribosomale diferite. Sunt componente importante ale sistemului de traducere a informaiei genetice, la nivelul lor realizndu-se reacii ce determin iniierea, alungirea i terminarea sintezei lanului peptidic. Prezint situsuri prin care interacioneaz cu ARNm i ARNt legnd specific ntre ele moleculele de aminoacizi i determinnd formarea proteinelor. n timpul biosintezei proteice ribosomii se grupeaz i formeaz poliribosomi ceea ce asigur eficien mai mare acestui proces. 1.2.7. SPORUL Reprezint o form primitiv de difereniere celular ce const n formarea, n celula vegetativ a bacteriilor Gram pozitive, a unui nou tip de celul cu o ultrastructur, compoziie chimic i enzimatic diferit, ceea ce-i confer rezisten mare la condiii nefavorabile de mediu. Tipuri de spori: -endosporul se formeaz n interiorul unei celule vegetative, prezint rezisten mare la condiiile de mediu; -sporii de origine hifal de la actinomicete (Streptomyces, Nocardia); -chitii descrii la Azotobacter provin din transformarea celulelor vegetative; -gonidiile; -mixosporii, heterocistii i akineii. n funcie de poziia unde se formeaz endosporii pot fi difereniate taxonomic bacteriile: ecuatorial (Bacillus anthracis), subterminal (B. cereus), terminal (Clostridium tetani). Sporul este format din: -nveli sporal (structur lamelar complex); -cortex (format din peptidoglican modificat); -sporoplasm; -nucleoplasm. 1.2.8. INCLUZIUNI INTRACELULARE Sunt formaiuni structurale inerte care apar n citoplasma bacteriilor la sfritul perioadei de cretere activ. Sunt structuri legate de activitatea metabolic a celulei, fiind materiale de rezerv care se acumuleaz n diferite regiuni ale celulei atunci cnd cultura se dezvolt lent sau nu se mai dezvolt. n funcie de compoziia chimic, incluziunile pot fi clasificate astfel: -polimeri organici incluziuni de glicogen, amidon, poli--hidroxibutirat, cianoficin (n cazul cianobacteriilor) polimer format din acid aspartic i arginin; -polimeri anorganici incluziuni de polimetafosfat; -incluziuni anorganice simple granule de CaCO3, sulf coloidal (n cazul bacteriilor sulfuroase. n cazul bacteriei Bacillus thuringiensis s-au evideniat incluziuni (care nu au rol de depozit) proteice parasporale, cu structur cristalin, de tipul endotoxinei. Vacuolele sunt structuri intracitoplasmatice sferice cu diametru de 0,3-0,5 m, totalitatea lor formnd vacuomul. Vacuolele prezint o membran lipoproteic monostratificat, conin ap i susbtane dizolvate, iar numrul / celul variaz ele

avnd rol n reglarea presiunii osmotice i n etapa premergtoare a formrii incluziunilor, de depozit a substanelor de rezerv. Bacteriile acvatice au vacuole cu gaze numite aerosomi cu rol n flotaei. 1.2.8. APARATUL FOTOSINTETIC Pigmenii fotosintetizani (clorofila a, carotenoizi, ficocianin pigment albastru, ficoeritrin pigment rou) ai cianobacteriilor sunt localizai la nivelul tilacoizilor structuri membranare particulate. Membranele intracelulare tilacoidale au forme variate tubulare, veziculare, lamelare, fiind acoperite cu corpusculi mici numii ficobilisomi care conin ficobiliproteine. Tilacoidele servesc ca centru al reaciilor biochimice n urma crora are loc conversia energiei luminoase n energie chimic i transportul electronilor. n cazul bacteriilor genului Chlorobium aparatul fotosintetic este format din vezicule delimitate de o membran monostrat, care nu au legtur cu membrana plasmatic. 1.2.9. STRUCTURI EXTRAPARIETALE Constituie o barier ce protejeaz celula fa de condiiile nefavorabile de mediu (prevenirea atarii virusurilor sau procesul de desicare). Este o structur accesorie cu o consisten viscoas, gelatinoas, care acoper complet celula i dau un aspect mucoid, fiind constituit din polizaharide; Capsula se ntlnete la bacteriile Gram pozitive i negative. Pe mediu solid bacteriile capsulate produc colonii netede (de tip S=smooth), iar cele necapsulate colonii rugoase (de tip R=rough). Capsula ndeplinete roluri multiple precum: -de protecie fa de uscciune; -confer virulen bacteriilor patogene, deoarece capsula este chemotactic negativ pentru fagocite; -depoziteaz unele substane nutritive; -confer caracterul de antigenitate; Glicocalixul este o structru extraparietal cu ajutorul creia se ancoreaz fie de alte celule, fie de diverse suporturi. Glicocalixul este format din filamente polizaharidice i glicoproteice care se leag de lipopolizaharidele membranei externe la bacteriile Gram negative i de mureina (peptidoglicanul) bacteriilor Gram pozitive. 1.2.10. APENDICI LOCOMOTORI Sunt reprezentai de flageli organite extracelulare care confer mobilitate celulelor purttoare. Flagelii sunt apendici de natur proteic (cea mai important este flgelina) cu diametru de 20 m i lungime de 4-70 m. Flagelul se formeaz din structurile de nveli ale celulei i are o structur complex fiind format din: -corpuscul bazal (ancoreaz flagelul la peretele celular prin intermediul unor structuri discoidale; -crligul (conecteaz filamentul la suprafaa celular); -filamentul extern (flagelul propriu zis); n funcie de numrul flagelilor bacteriile sunt clasificate astfel: -monotrihe (un singur flagel); -amfitrihe (cu doi flageli poziionai diametral opus); -lofotrihe (cu numeroi flageli grupai); -peritrihe (cu numeroi flagelidistribuii pe toat suprafaa celulei).

1.2.12. APENDICI NELOCOMOTORI Sunt reprezentai de pili i fimbrii. Pilii sunt structuri filamentoase drepte cu numr variat /celul (1-10) a cror sintez este codificat de gene situate pe plasmide (elemente genetice extracromosomale). Pilii sunt de natur proteic, fiind constituii din pilin i au rol n procesul de conjugare bacterian i receptori pentru fagii filamentoi. Fimbriile sunt structuri filamentoase drepte i rigide, constituite din proteine numite fimbriline, sunt codificate de gene cromosomale. Fimbriile se consider c au rol n mrirea suprafeei de absorbie a substanelor nutritive sau determin ataarea intercelular sau de substrat. Bacteriile patogene care prezint fimbrii manifest o virulen mai mare fa de cele fr fimbrii datorit atarii mai eficiente de celulele gazdei. 2. CARACTERE GENERALE ALE FUNGILOR Studiile realizate pe fungi au relevat o mare diversitate a acestor organisme, care se datoreaz formei, structurii i particularitilor biologice. Fungii formeaz cea mai mare grupare sistematic dintre organismele eucariote inferioare. Fungii sunt eucariote heterotrofe, incapabile de fotosintez, care i obin energia prin oxidarea compuilor organici. Ei se gsesc n special n sol unde particip la degradarea unor substraturi foarte variate. Fungii pot prezenta un mod de via saprofit sau parazit (paraziteaz plantele i animalele). Celulele fungilor au o organizare tipic eucariot, corpul vegetativ fiind alctuit din hife care formeaz miceliul numit tal. Miceliul variaz n complexitate i dimensiune: de la formele unicelulare (levuri), la cele pluricelulare (mucegaiurile) i pn la ciupercile macroscopice. Celulele prezint un perete celular gros, al crui principal component este chitina (poliglucid rezistent i flexibil, alctuit din resturi de N-acetilglucozamin). Celulele fungice au, de obicei, mai muli nuclei dar nu conin plastide. Organizarea hifelor este coenocitic: n interiorul structurii filamentoase ramificate, protejat de peretele celular rigid, se gsete o mas citoplasmatic multinucleat. Hifele pot fi neseptate, de exemplu la Phycomycetes sau pot avea septe la Ascomycetes i Basidiomycetes ce sunt strbtute de pori. 2.1. STRUCTRURA CELULAR A FUNGILOR Nucleul - a fost pus n eviden prima dat de ctre De Bary (1866). Nucleul fungilor este mic avnd dimensiuni cuprinse ntre 0,75 - 20 m. Forma nucleului este sferic sau oval. Nucleul este nconjurat de o membran dubl cu numeroi pori, caracteristic organismelor eucariote. n interior se afl nucleoplasma i unul sau mai muli nucleoli. Substana caracteristic nucleului este cromatina, alctuit din acidul dezoxiribonucleic, acidul ribonucliec i proteine. Numrul cromosomilor variaz n funcie de specie, fiind n general mic, de exemplu Penicillium notatum are cinci, Neurospora crassa are apte, iar Aspergillus nidulans are opt cromosomi. Reticulul endoplasmatic - din celulele fungice este constituit din dou membrane unitare separate printr-un lumen. RE poate avea form tubular sau lamelar i este mai evident n celulele tinere. Ribosomii sunt distribuii n mod neuniform n citoplasm sau sunt ataai de RE. Mitocondriile sunt asemntoare cu cele de la alte organisme, ndeplinind aceleai funcii. Complexul Golgi este i el prezent n celulele fungice. Vacuolele sunt prezente n numr mare n celulele mature, fiind prevzute cu o membran simpl. Citoplasma prezint la exterior o membran fin lipoproteic - plasmalema, urmat de hialoplasm (la periferia celulei), iar n interior este prezent granuloplasma. Continuitatea citoplasmei este asigurat de plasmodesme ntre celule i

anastomoze ntre hife. n componena citoplasmei intr: glucide (glicogen), proteine, lipide, acid ribonucleic, acizi organici, enzime, fosfai de fitosterine. Citoplasma celuleor fungice este hialin, omogen i refringent. Peretele celular este constituit din chitin, micoceluloz, caloz, hemiceluloz poliglucide complexe, acizi organici, etc. n funcie de absena sau prezena peretelui celular, celulele fungice pot fi gimnoplaste - fr perete celular (la grupe inferioare de fungi) i dermatoplaste - cu perete celular (grupele evoluate). 2.2. STRUCTURA MICELIULUI Aparatul vegetativ al fungilor este numit miceliu. Miceliul este divers constituit n funcie de gradul de evoluie al fungilor. La ciupercile superioare, miceliul este alctuit din hife septate transversal, care formeaz un miceliu pluricelular. Celulele pot fi uninucleate, binucleate sau plurinucleate. La foarte multe ciuperci hifele sunt incolore, dar odat cu diferenierea sporilor miceliul se coloreaz. La unele specii de fungi, miceliul care formeaz corpii sporiferi se coloreaz n rou, galben, albastru, ca urmare a faptului c celulele sintetizeaz o serie de pigmeni care coloreaz peretele. n funcie de dezvoltarea n interiorul sau la suprafaa diferitelor substraturi, miceliul poate fi intern sau extern. 3. NOIUNI DE VIRUSOLOGIE GENERAL Virusologia este tiina care studiaz virusurile i afeciunile provocate de aceste entiti. Apariia i dezvoltarea acestei tiine a nceput odat cu descoperirea n anul 1892 de ctre Ivanovski a faptului c boala mozaicului tutunului este provocat de un agent infecios. Civa ani mai trziu, experimentele realizate de Beijerinck cu extracte din frunze de tutun infectate cu virusul mozaicului tutunului, au adus dovada c acest agent infecios este filtrabil, rezistent n timp i poate prin inoculare la plante sntoase s provoace boala. n urmtoarele decenii au fost descoperite numeroase virusuri care paraziteaz oamenii, animalele, plantele i microorganismele (bacteriile i fungii). n 1911 Rous a evideniat virusul sarcomului aviar, n 1915 Twort a izolat virusuri specifice bacteriilor, iar n 1917 DHerelle a evideniat apariia plajelor de liz dovedind astfel posibilitatea infectrii i parazitrii bacteriilor de ctre virusuri. 3.1. CARACTERELE GENERALE ALE VIRUSURILOR Virusurile se deosebesc fundamental de organismele procariote sau eucariote, fiind ncadrate ntr-un regn aparte numit VIRA. Virusurile sunt entiti biologice infecioase cu organizare acelular. Particula viral complet se numete virion sau virus infecios matur i rezult n urma autoasamblrii componentelor sale sintetizate de celula gazd, pe baza informaiei genetice coninut de acidul nucleic viral. Particula viral lipsit de capsid se numete virus vegetativ cnd se afl liber n citoplasma celulei gazd n timpul replicrii sale sau provirus cnd este integrat n cromosomul gazdei. Virusurile nu au echipament enzimatic de biosintez i catabolism propriu, ci doar unele enzime cu rol n ptrunderea, replicarea i eliberarea din celula gazd. Virusurile sunt parazii absolui, constani i obligai deoarece nu cresc, nu se divid i nu se pot reproduce n afara unei celule gazd vie. Pe baza informaiei genetice coninut n acidul nucleic i cu ajutorul sistemelor biochimice ale celulei gazd sistemele enzimatice Lipmann ce asigur acumularea energiei, sistemelor de transport de electroni, ribozomilor i ARNt

virusurile i pot sintetiza componentele structurale. Deoarece nu conin acid muramic n structura nveliurilor externe virionii nu sunt sensibili la multe antibiotice. 3.2. PARTICULARITILE MORFOLOGICE I STRUCTURALE ALE VIRUSURILOR VERTEBRATELOR Morfologia i structura virusurilor a putut fi elucidat prin studiile de microscopie electronic, prin analize de difracie cu raze X, analize biochimice sau imunologice. Astfel, a fost relevat o diversitate mare a tipurilor morfologice i a dimensiunilor virusurilor. Dimensiunile virusurilor variaz n limite mari, fiind cuprinse ntre 10-400 nm diametru. Virionul este constituit din: genom viral (acid nucleic ADN sau ARN niciodat ambele); capsid; peplos.

Genomul viral este constituit fie dintr-o molecul de ADN, fie din ARN dispus helical, linear sau circular, monocatenar sau bicatenar (tabelul 1). Tabelul 1 Tipuri de acizi nucleici virali Virusul gripal Virusul poliomielitic Bacteriofagul Q HIV Virusul guturaiului Virusurile plantelor Bacteriofagul X174 Bacteriofagul SV 40

ARN monocatenar

ARN dublucatenar ADN monocatenar ADN dublucatenar

Informaia genetic deinut de genomul viral poate determina propria replicare i deturnarea metabolismului celulei gazd n scopul sintetizrii componentelor structurale virale. Capsida viral este constituit din uniti structurale de natur proteic numite capsomere. Capsomerele se asociaz i formeaz structuri cu simetrie helical sau icozaedric. Inveliul extern (peplos) se formeaz n momentul cnd virionul prsete celula gazd. Peplosul este constituit din: un strat dublu lipidic (ce conine sfingolipide i colesterol) provenit din membrana celular a gazdei; pe suprafa intern prezint o foi proteic (proteine de membran); pe suprafaa extern prezint spicule (spikes) proeminene de natur glicoproteic, care au extremitile ascuite, drepte sau n form de butoni. Cele mai cunoscute spicule sunt cele de la Orthomyxovirus numite hemaglutinine i neuraminidaze. Hemaglutininele au aspect de bastonae cu form de prism cu baza triunghiular fiind de natur glicoproteic i funcioneaz ca antigen ducnd la apariia de anticorpi. Neuraminidaza se prezint sub forma unor butoni, este tot de natur glicoproteic i are urmtoarele roluri: 1. distrugerea mucoproteinelor care protejeaz cile respiratorii permind fixarea virionilor de celule;

2. degradarea receptorilor celulari favorizeaz ptrunderea virionului n celul sau eliberarea virusului din celul i infectarea altor celule; 3. particip la procesul de asamblare a virionilor. Proteinele de membran sunt localizate n stratul dublu lipidic i formeaz un strat intern complet cu rol n meminerea integritii virionului 3.3. BACTERIOFAGII Bacteriofagii sunt virusuri care paraziteaz bacteriile i din punct de vedere al ciclului de via pot fi: litici (viruleni) T4 i/sau lizogeni (temperai) . Bacteriofagii au fie genom constituit dintr-o molecul de ADN dublucatenar sau monocatenar linear, fie genom ARN. Din punct de vedere al ciclului de via bacteriofagii pot fi litici i/ sau lizogeni (temperai). Din punct de vedere structural fagii au fost clasificai n trei tipuri: icosaedrici (X174), icosaedrici cu coad (T4) i filamentoi (29, M13). Bacteriofagii pot fi viruleni (litici) (T4) sau temperai (lizogeni) (80, ). Structura bacteriofagului T4 este urmtoarea: cap, coad, plac bazal, fibrele cozii. Bacteriofagii viruleni i "injecteaz" materialul genetic (genomul, cromosomul viral) n citoplasma celulei gazd, care este replicat independent de cromosomul bacterian, are loc transcrierea, se sintetizeaz proteinele virale i componentele structurale ale bacteriofagului, se asambleaz particulele virale i n final celulele bacteriene sunt lizate. Bacteriofagii temperai dup ce-i introduc genomul n celula gazd, acesta se integreaz n cromosomul bacterian devenind profag i se replic odat cu cromosomul celulei gazd, iar genele virale n marea lor majoritate nu se exprim. Integrarea se realizeaz la nivelul unor situsuri specifice (genomul fagului se integreaz ntre operonii gal i bio) sau la ntmplare n diferite regiuni ale cromosomului bacterian. Starea de lizogenie poate fi perpetuat de-a lungul mai multor generaii bacteriene, dar n anumite condiii genomul viral poate fi excizat din cromosomul celulei gazd i eliberat n citoplasm, evolund spre ciclul litic. Acesta este fenomenul induciei fagice (induciei litice). Integrarea genomului fagilor lizogeni n cromosomul bacterian se realizeaz cu ajutorul unei enzime numite integraz codificat de gena int. Excizia profagului care apare n cazul induciei fagice a unei tulpini lizogene este determinat de enzima excizionaza codificat de gena xis. Starea de lizogenie determin unele modificri la nivelul membranei externe a celulelor bacteriene, care duc la alterarea situsurilor de legare, astfel c bacteria este protejat de atacul altor bacteriofagi viruleni nrudii cu fagul temperat. Inducia litic se datoreaz faptului c proteinele virale represoare, care determin inhibarea exprimrii genelor virale sunt inactivate. Inducerea ciclului litic depinde de cantitatea relativ a proteinelor represoare Cro (care inhib sinteza represorului cI i permite transcrierea genelor virale implicate n multiplicarea i morfogeneza fagului, determinnd excizia profagului din cromosomul bacterian i deci evoluia litic) i cI (care inhib exprimarea majoritii genelor virale, determinnd starea de lizogenie). Inducia fagic poate fi declanat spontan sau poate fi stimulat de factori fizici (radiaii ionizante (X), neionizante (UV), temperatur) sau chimici (antibiotice - mitomicina C n cazul tulpinilor de Streptomyces productoare de streptomicin). 4. ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC LA PROCARIOTE I EUCARIOTE. CICLUL CELULAR LA EUCARIOTE Acizii nucleici sunt substane macromoleculare alctuite din nucleotide. Nucleotidele sunt formate dintr-o baz azotat, o pentoz i un radical fosfat. Bazele azotate sunt de dou tipuri: purinice (adenina i guanina) i pirimidinice (citozina,

timina i uracilul). Pentozele sunt reprezentate de dezoxiriboz n structura ADN i riboz n ARN. O baz azotat i o pentoz sunt legate prin legturi -N-glicozidice i formeaz o nucleozid. Nucleotidele sunt formate prin adugarea radicalului fosfat la nucleozid. n structura ADN intr dezoxiriboza, adenina, guanina, citozina, timina i radicalul fosfat. n structura ARN intr riboza, adenina, guanina, citozina, uracilul i radicalul fosfat. Nucleotidele sunt legate ntre ele prin legturi fosfodiesterice. Sistemele biologice cuprind dou tipuri fundamentale de organizare: acelular sau molecular, n aceast categorie ncadrndu-se virusurile i viroizii i celular care cuprinde dou categorii divergente de organizare, procariot i eucariot. Organizarea celular procariot cuprinde bacterii, actinomicete i cianobacterii, iar cea eucariot drojdii, fungi, plante i animale. Se consider c exist i o a treia categorie intermediar organizarea mezocariot la un singur grup de microorganisme Dinoflagelate (alge). Virusurile sunt entiti biologice cu organizare acelular. Un virus este alctuit dintr-un nveli proteic numit capsid i un miez de acid nucleic. Miezul de acid nucleic este constituit din ADN sau ARN, niciodat ambele (ADN la dezoxiribovirusuri i ARN la ribovirusuri). ADN poate fi dublu catenar, linear sau circular sau dublucatenar linear. Unele ribovirusuri animale au genomul segmentat ARN este alctuit din mai multe segmente de ARN minus, care genereaz catene de ARN plus, acestea funcionnd ca ARNm. De exemplu virusul gripal are genomul constituit din opt fragmente de ARN monocatenar. Acest virus se numete virus cu caten negativ pentru c ARN coninut n capsida viral nu are funcie de mesager. Viroizii sunt alctuii dintr-o molecul de ARN, neasociat cu proteine. De exemplu viroidul care determin infecii la cocotier. 4.1. ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC LA PROCARIOTE Bacteriile, inclusiv actinomicetele i cianobacteriile prezint organizare celular procariot, deci se autoreproduc i au morfogenez autonom. Genomul procariot este alctuit din dou categorii de determinani genetici: a) gene eseniale localizate n structura cromosomului; Cromosomul bacterian este alctuit dintr-o molecul de ADN dublucatenar circular nchis covalent. Acesta este situat n regiunea central a celulei bacteriene, este inclavat direct n citoplasm fiind prins prin mezosom de membrana plasmatic i formeaz nucleoidul (nucleosom, nucleoplasm) sau nucleul de tip procariot lipsit de membran nuclear. ADN bacterian nu este complexat cu proteine histonice, dar la unele grupe bacteriene ADN este asociat cu proteine bazice asemntoare histonelor. Se presupune c aceste proteine au rol n neutralizarea ncrcturii negative a gruprilor fosfat ale ADN, asigurndu-i stabilitatea. Din punct de vedere chimic nucleoidul este un complex ADN-ARN-proteine (80% ADN, 10% ARN ARNr i ARNm i 10%proteine ARN polimeraz). Elementele genetice accesorii au urmtoarele proprieti : a) conin informaie genetic neesenial pentru reproducerea organismului purttor, unele nu confer nici o proprietate detectabil; b) sunt capabile de replicare independent fa de cromosomul bacteriei purttoare. Cele mai importante elemente genetice accesorii la procariote sunt plasmidele. Plasmidele sunt reprezentate de molecule de ADN dublucatenar circular covalent nchis sau linear. Ele sunt delimitate spaial de cromosomul bacterian, se pot replica autonom fa de acesta. Moleculele de ADN plasmidial pot prezenta trei conformaii moleculare: circulare covalent nchise (CIC), circulare deschise (CD) i lineare (L). b) gene accesorii localizate n structura plasmidelor, a transpozonilor, secvenelor de inserie, bacteriofagilor.

4.2. ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC EUCARIOT Caracteristicile organizrii genetice eucariote sunt: a) existena membranei nucleare duble care nchide materialul genetic; Datorit localizrii materialului genetic pe mai muli cromosomi transcrierea i traducerea informaiei genetice se realizeaz separat, prima n nucleu, cea de-a doua n citoplasm la nivelul ribosomilor. Complexarea permanent a ADN cromosomal cu histone (proteine bazice ce conin resturi de arginin i lizin) face ca la eucariote substana nuclear cromatina s prezinte un aspect fibros la microscopul electronic. Complexarea cu proteine histonice a ADN cromosomal are drept consecin prezena unui ciclu celular cu dou faze distincte: replicativ i distributiv. 4.2.1. CICLUL CELULAR LA EUCARIOTE n celulele somatice, cromosomii sufer procese ciclice de spiralizare, despiralizare i sintez replicativ, procese care asigur transmiterea informaiei genetice de la o generaie la alta, n cadrul ciclului celular. Ciclul celular reprezint perioada dintre dou diviziuni mitotice succesive. Ciclul celular este divizat n dou etape: interfaza (I) i diviziunea celular - mitoza (M). Interfaza este perioada cea mai activ din punct de vedere metabolic - are loc sinteza ADN, a proteinelor histonice. Interfaza este subdivizat n trei faze: a) faza presintetic G1 - (G = gol sintetic) nu se sintetizeaz ADN, dar are loc acumularea compuilor necesari replicrii cromosomilor monocromatidici, dublrii centriolilor i formrii aparatului mitotic. Au loc sinteze de ARN, proteine enzimatice i neenzimatice. exist celule care nu se divid continuu, nefiind implicate permanent n cicluri proliferative repetate, dei ele rmn viabile i active metabolic ndeplinind funcii specifice tisulare pentru perioade lungi de timp. Ele pot reveni la ciclul celular proliferativ, sub aciunea unor factori extracelulari, aa cum se ntmpl n cazul vindecrii unei leziuni procesul cicatrizrii. Acest tip de celule se spune c se afl n faza G0. Decizia unei celule G0 de a reintra n ciclul celular sau a celulelor ciclice de-a iei din circuit se produce n ultima parte a fazei G1. b) faza S - (S = sintez) c) se dubleaz cantitatea de ADN, cromosomii devenind bicromatidici. La sfritul mitozei i n G1 cromosomii sunt monocromatidici. faza postsintetic G2 nu se sintetizeaz ADN, dar se asigur condiiile pentru formarea aparatului de diviziune a celulei i se acumuleaz substane cu rol energetic necesare pentru realizarea mitozei. Durata ciclului celular variaz la diferite tipuri de celule eucariote. Astfel drojdiile se pot divide la aproximativ 120 min. Cele mai multe celule vegetale i animale se divid la 10-12 ore. La mamifere, dac se atribuie 24 ore unui ciclu celular, atunci mitoza dureaz 1 or, faza G1 circa 10 ore, faza S pn la 9 ore, iar faza G2 aproximativ 4 ore. 5.1. TIPURILE DE NUTRIIE A MICROORGANISMELOR Microorganismele au fost grupate n dou categorii n funcie de sursa de carbon pe care o folosesc: b) repartizarea informaiei genetice pe mai muli cromosomi.

Autotrofe folosesc CO2 ca unic sau principal surs de carbon anorganic; Heterotrofe folosesc substane organice ca surs de carbon pentru biosinteze i producere de energie. n funcie de modul de obienere a energiei microorganismele au fost grupate n dou categorii (tabelul 5.1.): Fototrofe folosesc energia radiant luminoas (fig. 5.1, 5.2); Chemosintetizante obin energia din reacii chimice (fig. 5.3). Microorganismele chemoheterotrofe sunt dependente de compuii organici ca surs de carbon i energie i pot fi clasificate astfel: Saprotrofe obin compuii organici din mediul nconjurtor; Simbiotrofe preiau compuii organici de la alt organism cu care triesc permanent n contact direct; Biotrofe obin substanele organice din celulele vii ale gazdei simbiotice; Necrotrofe obin compuii organici din celulele moarte ale gazdei simbiotice. Microorganismele chemoheterotrofe pot fi clasificate n dou categorii n funcie de modul n care obin substanele necesare biosintezelor: Microorgansime osmotrofe preiau substanele dizolvate n mediu prin transfer prin membranele celulare; Microorganisme fagotrofe nglobeaz substanele pe care le diger nainte de a utiliza produii de digestie. n funcie de modul de nutriie i gradul de dependen de alte microorganisme, microorganismele chemoheterotrofe pot fi clasificate astfel: Saprofite obligate libere microorganisme heterotrofe libere, care nu au capacitatea de simbioz mutualist sau parazitar; Facultativ necrotrofe microorganisme cu potenial simbiotic, normal libere, cu nutriie saprotrof, care pot deveni parazite avnd nutriie necrotrof; Necrotrofe obligate include parazii specializai a cror existen liber se limiteaz la supravieuirea n esutul mort al gazdei infectate; Facultativ biotrofe microorganisme facultativ simbiotice, sunt biotrofe n stadiul simbiotic i saprotrofe n stadiul liber; Obligate biotrofe microorganisme simbiotice mutualiste sau parazitare, incapabile de existen liber (doar ca spori sau chiti). 5.2. METABOLISMUL Metabolismul reprezint totalitatea proceselor chimice care au loc n celulele orgnismelor vii (fig. 5.4). Metabolismul include: anabolismul care reprezint totalitatea reaciilor de sintez a constituenilor celulari (metabolii primari i secundari) ce necesit energie; catabolismul care reprezint totalitatea reaciilor de degradare ce asigur eliberarea elementelor compuilor moleculari sau macromoleculari ai unei celule i producerea de energie. Reaciile anabolice sunt necesare pentru creterea, reproducerea i repararea structurilor celulare. Reaciile catabolice furnizeaz organismului energia necesar proceselor vitale, inclusiv deplasarea, transportul i sinteza moleculelor complexe. n toate reaciile catabolice are loc transferul de electroni, care permite captarea energiei n legturile macroergice ale moleculelor de ATP sau alte molecule asemntoare. Transferul de electroni este n strns legtur cu procesele de oxidare i reducere (tabelul 5.2.).

Oxidarea poate fi definit ca reacia n care se pierd sau se ndeprteaz electroni. Dei multe substane se combin cu oxigenul i transfer electroni acestuia, n cazul n care n mediu sunt prezente alte substane acceptoare de electroni oxigenul poate lipsi. Reducerea poate fi definit ca reacia n care se ctig electroni. Atunci cnd o substan pierde electroni sau este oxidat se elibereaz energie, dar trebuie s existe o alt substan care s primeasc electronii sau s se reduc n acelai timp. 6.1. CRETEREA I MULTIPLICAREA MICROORGANISMELOR Microorganismele cresc i se multiplic dac n mediu sunt suficiente substane nutritive pentru sinteza tuturor compuilor necesari formrii constituenilor celulari. Multiplicarea microorganismelor se realizeaz prin mecanisme diferite de diviziune: diviziune direct (fisiune binar); nmugurire; diviziune mitotic, formarea sporilor de propagare. Fisiunea binar celulele bacteriene se alungesc pn ating o anumit lungime, apoi n zona ecuatorial se formeaz un sept transversal care separ celula n dou celule fiice identice (fig. 6.1). Fragmentarea este caracteristic bacteriilor filamentoase (actinomicete) fiind implicat n formarea sporilor. nmugurirea este caracteristic levurilor, prin nmugurire se formeaz dou celule pornind de la o celul parental (fig. 6.2.). La nivelul celulei mam se formeaz printr-un proces de mitoz o protuberan (mugure), care crete treptat, apoi se desprinde de celula iniial i i continu dezvoltarea individual. Diviziunile mitotic sau meiotic sunt caracteristice microorganismelor eucariote i presupun formarea unui fus de diviziune mitotic, respectiv meiotic care separ cromosomii n celulele fiice. 6.2. CRETEREA EXPONENIAL A UNEI POPULAII MICROBIENE Modelarea matematic a creterii unei populaii bacteriene cultivate n mediu lichid n sistem nchis (de tip batch) a permis reprezentarea grafic ca logaritm din numrul de celule n funcie de timpul de incubare. Curba de cretere exponenial a bacteriilor este constituit din patru faze (fig. 6.3): faza de lag; faza de cretere exponenial; faza staionar; faza de declin. Faza de lag reprezint faza de laten n care nu se realizeaz diviziuni celulare i nici creterea biomasei, ci doar pregtirea microorganismelor pentru multiplicare. Faza exponenial reprezint faza de cretere logaritmic n care se realizeaz multiplicarea rapid a microorganismelor. Celulele din aceast faz sunt tinere, au citoplasma abundent i omogen, fr substane de rezerv, n care se realizeaz numeroase procese metabolice. Faza staionar celulele din aceast faz sunt mature, n citoplasma lor se acumuleaz substane de rezerv i incluziuni, iar activitatea metabolic scade. Numrul celulelor viabile rmne constant pentru c numrul celulelor care mor este compensat de cel al celulelor care rezult din diviziune. Faza de declin din cauza epuizrii substanelor din mediul de cultur i a acumulrii substanelor toxice rezultate n urma activitii celulare numrul de celule scade progresiv. Celulele conin cantiti mari de substane de rezerv, formeaz spori i se pot prodece fenomene de liz celular.

7. BIOPREPARATE CU CIUPERCI PRODUCATOARE DE MICORIZE 1. NOTIUNI GENERALE: Micorizele sunt rezultatele unei asociatii in cursul careia radicelele plantelor sunt colonizate de ciuperci microscopice specifice. Aceasta interrelatie implica: asocierea relativ constanta a celor doi parteneri; infectia plantei de catre ciuperci fara simptome patologice; invadarea exclusiva a cortexului radicular cu mentinerea sterilitatii meristemului apical si a cilindrului vascular; absenta leziunilor si mentinerea proprietatilor fiziologice normale ale celulelor radiculare; dezvoltarea superioara a plantelor purtatoare de micorize comparativ cu cele lipsite de acestea. Plantele si ciupercile se afla intr-o relatie simbiotica sau de parazitism reciproc fiziologic, echilibrat. 2. CLASIFICAREA MICORIZELOR: Dupa raportul dintre hifele ciupercilor si celulele corticale ale radacinii avem: ectomicorize (ectotrofe) ciupercile produc infectii hifale intercelulare; endomicorize (endotrofe) localizare intracelulara a hifelor; endo ecto sau ecto endomicorize include ambele tipuri de infectii; peritrofe Caracteristicile genetice ale plantelor determina nu numai natura grupului de ciuperci care infecteaza radacina ci si tipul de micorize stabilite. 3. ECTOMICORIZELE: Sunt asociatii simbiotice rezultate din interactiunea complexa a miceliilor ciupercii cu radacina plantei, in care fungii raman permanent localizati extra si intercelular. Sunt larg raspandite. Plantele gazda sunt in special copacii care cresc pe soluri brune sau podzolizate. Micorizele sunt mai rare la arborii izolati si situati in soluri cernoziomice. Micorizele au fost descrise la: Pinaceae (pin), Fagales (fag), Juglandales (nuc), Dipterocarpaceae (frasin), Mirtaceae (dafin), Tiliaceae (tei). Ciupercile de ectomicorize apartin claselor: Bazidiomycete evoluate (ciuperci cu plrie), Ascomycetes, Rhizomycetes. Speciile cele mai intalnite sunt: Amanita muscaria, Boletus taoides, Boletus edulis, Ruscula sp., Lactarius deliciosus etc. Fungii de ectomicorize se dezvolta optim la 15 300C si pH 4 6 (uneori chiar 3). Aceste ciuperci produc metabolii secundari: fitohormoni (auxine, citochinine, gibereline), vitamine, acizi grai polinesaturai, antibiotice, pa care i elibereaza direct in esuturile plantei. Particulariti anatomice ale ectomicorizelor: Ectomicorizele au unele aspecte structurale definitorii: mantaua fungic, reeaua Hartig, hifele externe. Teaca sau mantaua fungic formeaza un esut fungic gros pseudoparenchimatos care acopera radicelele plantei gazd, poate reprezenta pana la 40% din greutatea uscata a radacinei respective. Nu e o simpla reea de hife ci un sistem complicat, ramificat, ntreesut, dezvoltat din hifele care patrund ntre celulele epitelice si uneori chiar ntre celulele cortexului radicular. Rezultat al unei dezvoltari considerabile a hifelor ciupercilor producatoare de micorize, teaca asigura o mare suprafata de contact ntre cei doi parteneri ai asociaiei fr ca hifele sa patrunda in celulele vii active. Hifele externe

Teaca fungic are conexiuni cu solul din care se dezvolta o reea luxuriant de hife ramificate sau lanuri hifale numite rizomorfe. Frecvent acestea cresc spre suprafata solului pentru ca n condiii favorabile sa se diferenieze, formnd corpuri sporifere epigee sau hipogee a cror nutriie este asigurat de planta gazd. Din 1949 s-a demonstrat necesitatea absolut a conexiunii corpurilor sporifere cu esuturile vegetale. Apariia acestor corpuri este mpiedicat dac se secioneaz rizomorfele cu plci metalice introduse n pmnt. Acest fapt demonstreaz c majoritatea ciupercilor comestibile cu sau fr plrie (inclusiv hifele) prezente in apropierea copacilor sunt corpuri sporifere de ectomicorize i nu saprofii de materie organic n descompunere aa cum s-a prezentat initial. Reeaua Hartig este o caracteristic structural a ectomicorizelor. Dei asigur un contact strns cu celulele gazdei, hifele rmn mereu localizate ntre celulele cortexului fr s produc infecii intracelulare. Zonele de contact dintre fungi i planta gazd n ectomicorize: in zona extremitii radiculare fungii sunt in contact direct cu celulele senescente ale vrfului vegetativ meristematic; in zona anterioar reelei Hartig teaca fungic este in contact cu celulele epidermice vii; in zona reelei Hartig fungii ptrund ntre celulele epidermice i uneori ntre celulele corticale ca sisteme hifale vii; in zona reelei Hartig senescent celulele epidermice i cele corticale sunt ptrunse de hifele fungice. 4. ENDOMICORIZE. MICORIZELE VEZICULO ARBUSCULARE Acest tip de micorize este cel mai comun, fiind ntlnit la cele mai multe plante cultivate. Cele mai mult studiate sunt micorizele plantelor cu importan economic: gru, porumb, soia, tomate, mr, cpun, trestie de zahr, arbore de cafea, arbore de cauciuc, orhidee, piersic. Fungii care produc aceste micorize sunt larg rspndii n sol, mai ales in regiunea perivascular radicular. D.p.d.v. taxonomic sunt descrise 4 genuri din familia Endogomaceae: Glomus, Sclerocystis, Gigaspora, Acaulospora. Cele mai utilizate ciuperci productoare de micorize sunt cele din genul Glomus. Experimentele de inoculare a gazdelor cu suspensii sporale axenice au demonstrat c cei mai muli fungi au un spectru larg de gazde. Astfel Glomus formeaz micorize cu mai mult de 20 specii cultivate. Exist i excepii: fungii din micorizele de la ovz nu pot fi transmii la orez i invers; in schimb, cei izolai de la gru sau secar infecteaz att orezul ct i ovzul (orzul?). Fungii simbioni obligai paraziteaz cu o specificitate de gazd redus. Fenomenul s-ar explica prin larga distribuie n sol i printr-o proprietate fundamental a metabolismului radicular comun mai multor specii de plante. Formarea micorizelor veziculo-arbusculare Micorizele endotrofe de acest tip formeaza structuri sferice numite vezicule si structuri ramificate cu funcie de organ absorbtiv de tipul haustorilor numii arbusculi. In evoluia infeciei simbiotice au fost descrise 3 faze succesive: dezvoltarea excesiv n sol a miceliului extraradicular (cel puin la civa centimetri de suprafata rdcinii); apariia unui sistem hifal intercelular n cortex; infecia intracelular, formarea de hife ncolcite, vezicule i arbusculi n celulele vegetale. In cazul micorizelor veziculo-arbusculare, hifele miceliene ies din rdcina infectat pentru a forma o reea lax n rizosfer i n solul adiacent. Greutatea hifelor extraradiculare e 1-6% din greutatea rdcinei proaspete. Lungimea hifelor din sol e corelat cu lungimea rdcinei infectate, ex. trifoi 1,29m hife/cm de rdcin. Contactul dintre membrii asociaiei de tip micoriz endotrof este foarte asemntoare celui observat n infeciile fungice biotrofe ale plantelor. Pe masura ce hifele fungice infectante patrund in celula vie, peretele celular vegetal si

plasmalema par s se invagineze a.. hifele sunt acoperite cu un nveli derivat din aceste structuri de suprafa. Se pare c fungii inhib sau modific activitatea enzimelor gazdei implicate in producerea si maturarea peretelui celular. Zona de contact implica participarea plasmalemelor vii ale ambilor membrii ai asociaiei separat de un spaiu apoplastic ce const din: peretele hifal modificat i peretele celulei gazd. Apoplastul este esutul mort al plantei, care nu manifest activitate metabolic activ ci lent, ex. peretele vaselor lemnoase, ritidomul. Pe masur ce asociaia mbtrneste se comport ca i cum fungii ar deveni mai puin api s menin sau s genereze modificrile caracteristice ale peretelui celular celulei gazd. Plasmalema celulei gazd continu s elibereze vezicule ce conin polizaharide i s formeze polimeri fibroi, dar i recapt proprietatea de a-i organiza ntr-o structur. Fungii de micorize endotrofe atac planta gazd ca un parazit pentru c hifele se comport ca haustorii fungilor patogeni obligai. In general fungii productori de ectomicorize rmn localizai in straturile externe ale cortexului radicular. Cnd ncearc s ptrund n interiorul rdcinii ei sunt distrui de rspunsul defensiv al gazdei. Endospermul si meristemul apical sunt lipsii de infecie fungic. De aceea endospermul plantei reprezint o barier fungic. Cnd ciupercile depesc aceast barier, ciupercile productoare de micorize devin patogene. 5. MICORIZELE ECTO-ENDOTROFE Sunt prezente doar la speciile de arbori din Gimnosperme (ex. brad, pin, molid) care formeaz obinuit endomicorize. Se pare ca sunt limitate numai la primele stadii de vegetaie ale arborilor (pepiniere). Considerate iniial ca forme de tranziie, aceste micorize au particulariti anatomice ale ambelor tipuri majore de micorize. Rdcinile cu ecto-endomicorize sunt mai alungite, mai subiri, mai puin ramificate dicotomic dect cele purttoare de ectomicorize. Mantaua fungic nu e att de bine dezvoltat. Aceste micorize au concomitent reea Hartig n cortex i hifele ptrund intracelular. Speciile de plante lipsite de simbioni fungici naturali sunt nconjurate invariabil de un miceliu abundent apartinnd speciei Cenococcum graniforme recunoscut ca fiind capabil s intre n simbioz cu diferite plante. 6. MICORIZELE PERITROFE Se caracterizeaz prin hife plastice care nconjoar rdcina cu care au contact indirect, superficial, fr conexiune direct. Miceliile epirizice au o foarte mare zon de extindere, putnd atinge cca 4m/m3sol. Ele preiau nutrienii rezultai prin descompunerea resturilor radiculare i i utilizeaz ca surs de energie. 7. ROLUL MICORIZELOR IN BIOLOGIA PLANTELOR Prezena micorizelor confer plantelor avantaje numeroase i diferite, ntre care cele legate de nutriie, dezvoltare i protectie contra agenilor patogeni sunt cele mai des evideniate. Micorizele funcioneaza ca adevrate organe absorbtive radiculare. Deoarece reeaua Hartig formeaz o mare suprafa de contact cu celulele vegetale, absorbia nutrienilor e mult mai mare dect cea prin perii radiculari; n plus ramificaiile rdcinilor induse de fungi crete i mai mult suprafaa absorbant, crend situsuri adiionale de legare a hifelor. Radacinile infectate cu fungi de micorize sunt de 2-3 ori mai lungi decat cele neinfectate, de asemenea au mas mult mai mare si sunt mai ramificate. Formarea perilor radiculare e supresat, iar funcia lor e preluat de hifele fungice ce mresc raza de disponibilitate a nutrienilor din plante. Fungii de micorize au rol foarte activ n preluarea nutrienilor, ei secret metabolii care cresc solubilitatea ionilor minerali legai n sol i care de asemenea cresc mobilitatea acestora. Ionii anorganici sunt preluai eficient i translocai direct n rdcin, prevenindu-se pierderea lor prin levigare. Hifele fungice larg rspndite n sol traverseaz regiunile deficitare n nutrieni sau cu nutrieni inaccesibili din apropierea rdcinilor, pentru a se ramifica i explora zone noi, la distan inaccesibil plantei ca atare. Cu timpul, n jurul

ciupercilor productoare de micorize, apar noi zone cu deficit de nutrieni, dar ramificarea i creterea continu a hifelor i conexiunile lor cu solul permit exploatarea extensiv a acestuia. Procesul e mult mai avantajos energetic pe unitatea de suprafa absorbant dect creterea i ramificarea rdcinii: exploatare intensiv: fosfat anorganic insolubil, fosfat puin solubil exploatare extensiv Pi e puin mobil n sol, nu se menine n soluia solului. In solurile fertile Pi e mentinut n soluia solului datorit humusului (cu ct solul are mai mult humus cu att Pi solubil e mai mult). Micorizele menin Pi n soluia solului mai ales pe soluri srace n humus. In cursul simbiozei fungii produc multe substane care menin echilibrul simbiotic cu celulele radiculare i care de asemenea influeneaz semnificativ procesul de absorbie. Ciupercile productoare de micorize sintetizeaz auxin, fitohormon care stimuleaz dezvoltarea sistemului radicular i citochinin, fitohormon care mpiedic maturarea i suberizarea esutului radicular, favoriznd prelungirea perioadei fiziologic active. Modificarea echilibrului hormonal determin i modificri ale dezvoltrii plantelor de cultur. S-au descris la tutun, cpun i porumb maturri mai rapide dect la plantele lipsite de micorize. Unii autori susin existenta chiar a unui fenomen de dependen a gazdei de micorize, n sensul acumulrii superioare de biomas (intensificarea fotosintezei i a cantitii de carbon fixat care trece spre fungi). 8. ROLUL PROTECTOR AL MICORIZELOR Ciupercile productoare de micorize formeaz o barier fizic, ce mpiedic accesul fitopatogenilor din sol. Mantaua fungic acoper prile mai fragile ale radicelelor fr s lase nici o brea, mpiedicnd astfel un contact direct al rdcinilor tinere cu solul. Muli fungi de micorize produc acizi volatili cu efect fungistatic i antimicotic care limiteaz dezvoltarea microorganismelor, meninnd un echilibru ntre fungii simbiotici i cei patogeni din sol. Dac o parte din rdcini au fost distruse de prezena micorizelor active, dezvoltarea de fungi n regiunea neinfectata poate compensa semnificativ aceste distrugeri. Ciupercile productoare de micorize au un efect de protecie mpotriva agenilor patogeni inclusiv a celor din filosfer datorit inducerii rezistenei sistemice dobndite (SAR). 9. ALTE FUNCII ALE MICORIZELOR Fungii de micorize sunt responsabili uneori de degradarea i absorbia nutrienilor din litier (stratul de frunze acumulat pe sol). Miceliul extramatriceal al fungilor din micorizele veziculo-arbusculare are un rol important n legarea granulelor de nisip i n stabilizarea dunelor. Asemntor se comport i hifele externe ale ciupercilor productoare de ectomicorize. Avnd n vedere toate aceste efecte benefice, ciupercile productoare de micorize sunt folosite sub forma unor biopreparate inoculante n agricultur i silvicultur. Inocularea artificial cu fungi productori de micorize e indicat n cazul mpduririi regiunilor anterior lipsite de ap, regiunilor situate la mare altitudine sau a zonelor cu clim nefavorabil, a solurilor neprielnice i nutriional adverse (ex. soluri nisipoase sau podzolizate, srturate). De asemenea n cazul introducerii unor specii n noi habitate e nevoie de inoculare cu ciuperci productoare de micorize. Biopreparatele inoculante se obin prin prelevarea i mcinarea rdcinilor arborilor cu micorize bine dezvoltate. Se obin pn la 75g spori/kg rdcin uscat. Stabilitatea preparatului e de aproape 4 luni. Utilizarea fungilor de micorize veziculo-arbusculare e mai limitat. Biopreparatul se obine prin cultivarea ciupercilor de endomicorize pe rdcinile unor plante cu dezvoltare vegetativ mare. Ex. Glomus e cultivat pe rdcini de salat i se obine produsul comercial VAM inoculant. Rezultate spectaculoase s-au obinut pe soluri slab fertile: brun-rocate, podzolizate, srturate. n cazul solurilor cu fertilitate natural ridicat (cernoziomuri) efectele nu sunt la fel de semnificative.

Crearea artificial de micorize endotrofe s-a dovedit util n cazul colonizrii plantelor pe habitate marginale (sterilul de la mine metalifere sau crbune, halele de cenui ale termocentralelor etc.). Producerea artificial a micorizelor cu fungi foarte eficieni reprezint o alternativ la chimizarea solului prin creterea eficienei de preluare a nutrienilor i scderea nevoii de administrare a ngrmintelor, putndu-se asigura dezvoltarea unor plante care n unele condiii create tolereaz creterea pe soluri cu fertilitate sczut sau pe diferite sisteme perturbate. 8. MICROBIOTA APELOR Microbiota izvoarelor este foarte redus fiind format din microorganisme provenite din acvifere sau din straturile subterane n timpul trecerii spre suprafa. Microbiota izvoarelor cuprinde bacterii Gram negative (Pseudomonas) i forme prostecate (Caulobacter). Izvoarele pot fi de dou tipuri: -minerale (Gallionella ferruginosa, Leptothrix ochracea); -termale (Sulfolobus acidocaldarius 570C, Leptothrix thermalis 900C). Microbiota rurilor este foarte diferit n funcie de viteza de curgere, debit, adncime i compoziie chimic. Rurile conin comuniti bacteriene ce se diversific pe msura ndeprtrii de izvoare: Achromobacter, Acinetobacter, Caulobacter, Flavobacterium, Hyphomicrobium, Moraxella, Pseudomonas, Gallionella. n apele poluate predomin bacteriile Escherichia coli, Proteus sp., Pseudomonas fluorescens, Clostridium sp., etc. n praiele curate i repezi este prezent Sapromyces. n rurile bogate n substane organice asimilabile sunt prezeni Fungi Imperfecti i Ascomycetes. Microbiota lacurilor cu ap dulce include toate categoriile de microoganisme: eubacterii, actinomicete, cianobacterii, microfungi, microalge i protozoare. Dintre genurile cel mai frecvent ntlnite pot fi menionate: Achromobacter, Acinetobacter, Bacillus, Brevibacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Nocardia, Pseudomonas, Sarcina, Spirillum, Streptomyces, Vibrio. Microbiota lacurilor cu ap srat este reprezentat de bacterii halotolerante, n special halofile, care conin vacuole cu gaze ce le permit modificarea poziiei pe verticala coloanei de ap i pigmeni carotenoizi cu rol protector fa de intensitatea prea mare a luminii solare, care le coloreaz coloniile n rou sau oranj strlucitor. Dintre genurile cel mai frecvent ntlnite sunt: Halobacterium halobium, Halococcus sp., Chromobacterium sp. Microbiota apelor subterane (acviferelor) - este important de cunoscut tipul i numrul microorganismelor prezente n apele freatice pentru a putea stabili caracterul lor potabil. Cu ajutorul tehnicilor uzuale de numrare direct i cultivare in vitro a microorganismelor i a celor moderne utilizarea marcherilor moleculari (ATP, fosfolipide, acid muramic) au fost evideniate microorganisme (bacterii, microfungi i protozoare) nu doar n zonele superficiale ci i n sedimentele acvifere nisipoase i n apa freatic. Bacteriile cel mai frecvent evideniate au fost bacterii anaerobe facultativ i obligate, heterotrofe, sulfat reductoare, denitrificatoare, ferobacterii, metanogeni din genurile: Achromobacter, Flavobacterium, Micrococcus, Nocardia, etc. Microbiota marin este alcatuit din 3 categorii de microorganisme: autohtone (permanente); alohtone (temporare sau contaminante); ubicvitare (comune solului si mediului marin) Cele mai multe bacterii marine sunt Gram negative, mobile, aerobe, facultativ anaerobe, iar cele din adncul sedimentelor obligat anaerobe. Bacteriile care triesc la suprafa sunt cromogene, sintetizeaz pigmeni (galbeni, portocalii, bruni, verzi, roii negri), care le protejeaz fa de efectul nociv al radiaiilor luminii. Bacteriile marine au diverse roluri fiind

amonificatori, nitrit i nitrat bacterii, denitrificatori, sulfoxidante i sulfat reductoare, ferobacterii, proteolitice, fermentative, chitinolitice, celulozolitice. Caracteristici generale a. Bacteriile marine: speciile ntlnite aparin genurilor: Vibrio, Streptomyces, Spirillum, Micrococcus, Sarcina, Nocardia, Pseudomonas, Bacillus, Corynebacterium etc.; numrul bacteriilor este maxim n regiunile litorale i scade progresiv n zonele pelagice (apele de larg); un numr mare de bacterii se ntlnete n primii centimetri ai sedimentelor i scade n profunzimea sedimentelor. b. Cianobacteriile marine: sunt rspndite ubicvitar; n regiunile de rm sunt ataate de plante, ml, nisip, roci (Nodularia, Rivularia, Plectonema, Oscillatoria etc.); unele specii formeaz bacterioplanctonul fiind reprezentate de genurile: Pelagothrix, Nostoc etc.; multe specii sunt halotolerante; unele tulpini (Anabaena, Nodularia etc.) sunt responsabile de nfloririle din zonele eutrofizate. c. Fungii marini: levurile frecvent ntlnite sunt: Cryptococcus, Saccharomyces, Candida, Rhodotorula, Torulopsis etc.; n general se cunosc 149 specii de Ascomycetes, 91 specii de Pyrenomycetes, 51 specii de Loculoascomycetes, 56 specii de Deuteromycetes i 4 specii de Basidiomycetes. d. Microfite: se mparte n fitoplancton i microfitobentos (bental) n funcie de domeniul n care triesc; fitoplanctonul este prezent n concentraie maxim n stratul superior al zonei eufotice; majoritatea microfitelor sunt fotoautotrofe, dar unele cresc i heterotrof; alturi de bacteriile fototrofe ndeplinesc funcia de productori primari n cadrul ecosistemelor acvatice; compoziia microflorei M.Negre (litoralul romnesc): Bacillariophyta, Pyrophyta, Chlorophyta, Chrysophyta, Cyanophyta, Euglenophyta, Xanthophyta; caracteristic este dominana diatomeelor; nflorirea apelor provocat de algele planctonice (cunoscut sub numele de ap roie) este un fenomen frecvent ntlnit la litoralul romnesc n zonele de mic adncime; cel mai adesea fenomenul este cauzat de dezvoltarea masiv a diferitelor specii de diatomee (Sceletonema costatum, Cyclotella caspis, Leptocylindrus danicus Thalassionema nitzschioides, Nitzschisdelicatissima, N. seriata), peridinee (Exuviaella cordata, Goniaulax polyedra), cyanoficee (Microcystis aeruginosa), coccolithophoride (Pontosphaera huxleyi); densitile algelor n timpul nfloririlor pot atinge valori de peste 100 milioane celule/litru, determinnd mortaliti masive ale faunei bentale; cordonul litoral de ape nflorite reprezint o barier n calea petilor ce se apropie de mal. e. Zooplancton: diversitate redus 142 specii n M. Neagr: Cystoflagellata, Hydromedusae, Tintinnoidea, Scyphomedusae, Ctenophora, Rotatoria, Cladocera, Copepoda, Isopoda, Chaetognatha, Appendicularia; se remarc prezena unor forme dulcicole n sezonul marilor viituri ale Dunrii (specii de rotifere, copepode, cladocere); zooplanctonul are o dezvoltare sezonier, maximile de abunden primvara vara. f. Microorganisme bentale: au o particularitate fundamental i anume activitatea metabolic lent; factorii determinani sunt: disponibilitatea redus de nutrieni, presiunea hidrostatic mare i temperatura sczut.

Zonele de dezvoltare a microbiotei marine a. Interfaa ap/aer: este un habitat foarte aerat, intens luminat, cu o concentrare masiv de nutrieni i supus unor fluctuaii de temperatur diurne i sezoniere; organismele sunt n continu micare datorit aciunii curenilor i valurilor; se dezvolt eubacterii, cianobacterii, alge, microfungi i protozoare alctuind neustonul (gr. neuo= a aluneca); bacteriile aflate n numr mare (cteva milioane/cm2) sunt reprezentate de bacterii heterotrofe: Nevskia (specific acestui habitat), Leptothrix, Caulobacter, Alcaligenes, Brevibacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Sarcina etc.; cianobacteriile sunt reprezentate de: Anabaena, Aphanizomenon etc., iar fungii de diferite specii de levuri i de Chladosporium; b. Zona de larg pn la 200 m adncime: cuprinde organisme microscopice care noat sau plutesc n ptura superficial a apelor de larg; formeaz planctonul (gr. planktos = care cltorete); planctonul are densitatea maxim n zona aerob, n care fitoplanctonul realizeaz producia primar de materie organic; fitoplanctonul ocup coloana de ap situat la adncimea de 20 50 cm, ce corespunde condiiilor optime de fotosintez; cianobacteriile prefer regiuni cu intensitate mai mic a luminii, datorit complexului lor de fotopigmeni i anumitor factori de mediu (temperatur, nutrieni etc.). c. Zona bental: sedimentul bentonic reprezint un mediu favorabil pentru dezvoltarea microorganismelor; aerob la suprafa i prograsiv anaerob n adncime permite dezvoltarea productorilor secundari, care folosesc compuii organici depui; organismele care se dezvolt n aceast zon formeaz bentosul (gr. benthos = adncul mrii). d. Zona litoral: se gsesc comuniti de microorganisme care triesc pe suprafaa nisipurilor marine submerse, sub forma unor mici colonii; aceste comuniti sunt alctuite din eubacterii, cianobacterii, alge i protozoare, formnd comunitatile epipsamice (gr. psammos = nisip). e. Pe suprafaa organismelor animale: organismele animale acvatice (crustacee, peti, mamifere, viermi, copepode) sunt acoperite de un strat de microorganisme care colonizeaz suprafaa corpului lor; bacteriile formeaz comuniti cu densiti cuprinse ntre 1000 10.000 celule/cm2; aceste organisme formeaz comunitile epizoice; comunitile epizoice pot cuprinde i microorganisme patogene. f. Pe suprafaa plantelor acvatice: reprezint o comunitate de suprafa alctuit din microorganisme asociate cu rdcinile plantelor acvatice; include microoganisme fotoautotrofe, heterotrofe, saprofite i parazite; aceast comunitate de microorganisme poart numele de epifiton (gr. epi = pe, fiton = plant); aproape toate plantele acvatice au un epifiton, cu excepia prilor tinere care sunt sterile, datorit pH-ului = 5 i eliberrii de substane antibiotice; regiunile btrne ale plantelor au pH 8 i sunt populate de bacterii, ce pot fi utilizate ca hran de ctre protozoare i rotifere; numrul bacteriilor saprofite dezvoltate pe algele saprofite variaz ntre 104 109/cm2;

dintre bacterii predomin cele care au structuri de adeziune: Leucothrix; dintre cianobacterii predomin Oscillatoria i Lynghya. g. Pe suprafaa rocilor: se dezvolt alge brune (dominante), alge verzi, cianobacterii, eubacterii i diatomee; aceste comuniti se numesc epiliton; rocile de pe malul stncos sunt populate de cianobacterii (Calothrix, Gloeocapsa etc.) i uneori de licheni (Verrucaria). 9. MICROBIOTA DIN SOL Microbiota din sol este reprezentat de bacterii (eubacterii, actinomicete, cianobacterii), fungi microscopici, alge i protozoare. Bacteriile reprezint grupul cel mai numeros i mai activ din sol, predominante fiind bacteriile Gram negative. Bacteriile Gram pozitive sunt i ele prezente fiind mai numeroase dect n mediile acvatice. Rolul bacteriilor din sol: Sunt implicate n circuitele geobiochimice (carbonului, azotului, fosforului, sulfului, fierului); Particip la procesele de mineralizare asigurnd fertilitatea solului i nutriia plantelor Particip la solubilizarea compuilor organici i anorganici, insolubili i inaccesibili plantelor; Sunt organisme care fixeaz azotul molecular atmosferic, necesar pentru nutriia plantelor; Particip la agregarea particulelor de sol prin polizaharidele extracelulare; Particip la formarea i degradarea humusului; Exemple: Acinetobacter, Agrobacterium, Achromobacter, Alcaligenes, Arthobacter; Bacillus, Brevibacterium; Cellulomonas, Chromobacterium, Clostridium, Corynebacterium; Flavobacterium; Micrococcus, Mycobacterium; Pseudomonas; Sarcina, Staphylococcus, Streptococcus; Xanthomonas. Actinomicetele sunt un grup de bacterii tranzitoriu sau constant filamentoase, care formeaz o reea micelial ramificat. Rolul actinomicetelor n sol: Particip la mineralizarea unor compui (chitina) mai rezisteni la aciunea bacteriilor i fungilor; Formarea humusului prin producerea unor compui aromatici, structurarea solului prin agregarea particulelor de sol; Fixarea azotului molecular (reprezentanii genului Frankia); Formarea simbiozlor de tipul actinorizelor; Sintetizeaz diferite antibiotice, care pot regla densitatea bacteriilor sau fungilor n anumite habitate sau ndeprta unii patogeni streptomicin, cloramfenicol, tetracicline, kanamicin, micostatin; Actinomicetele termofile sunt predominante n n paiele ncinse, n grmezile de compost i n unele gunoaie de grajd. Exemple:

Actinomyces, Actinoplanes; Mycobacterium, Mycococcus, Micromonospora; Nocardia; Streptomyces, Streptosporangium; Thermoactinomyces Nocardia cellulans, N. vaccinii pot degrada celuloza; Streptomyces violaceus, S. cellulosae pot degrada celuloza; Nocardia paraffinae poate degrada chitina i parafin; N. opaca i N. rubra - pot degrada fenoli Cianobacteriile sunt bacterii fototrofe care formeaz cruste pe suprafaa solurilor umede fr vegetaie sau se dezvolt pe stratul superior iluminat al solului. Rolul cianobacteriilor: Se pot dezvolta pe suprafaa solurilor aride datori capacitii de a realiza fotosinteza i de a utiliza compui anorganici simpli; Fixeaz azot molecular Anabaena, Calothrix, Nostoc, Plectonema, Schizothrix; Legarea particulelor de sol i stabilizarea structurii acestuia Exemple: Anabaena, Aulosira; Calothrixm; Microcoleus; Nodularia, Nostoc; Oscillatoria; Phormidium, Plectonema; Schizothrix, Scytonema; Tolypothrix. Fungii sunt microorganisme care triesc liber sau n asociaie cu rdcinile plantelor, reprezentnd o parte semnificativ din biomasa microbian din sol, dei sunt mai puin numeroi dect bacteriile. Levurile sunt reprezentate de urmtoarele genuri: Candida, Cryptococcus; Debaromyces; Hansenula; Kluyveromyces; Lipomyces; Pichia; Rhodotorula; Saccharomyces, Schizoblastosporium; Torula, Torulopsis, Trichospora; Zygosaccharomyces Mucegaiurile din sol aparin la peste 600 specii dintre care: 200 din clasa Phycomycetes ordinul Mucorales (Absidia, Cunninghamella, Mucor, Rhizopus); - ordinul Peronosporales (Phytium); 32 Ascomycetes - Chaetomium i Morchella; 385 Fungi Imperfecti Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Gliocladium, Penicillium, Phoma, Trichothecium, Verticillium. Rolul fungilor din sol

Pot degrada substane organice simple (hexoze, pentoze, acizi organici, aminoacizi, peptide) complexe (proteine, celuloz, lignin); Particip la formarea structurii solului prin efectul de imobilizare mecanic i agregare a particulelor de sol, asigurnd stabilitatea acestora; Particip la formarea humusului prin sinteza de substane aromatice asemntoare ligninelor care sunt introduse n rezerva din sol i prin conversii transformate n substane humice; Produc substane antibiotice; Formeaz asociaii de tip simbiotic cu rdcinile plantelor, numite micorize; Unele specii acioneaz ca prdtori, participnd la meninerea echilibrului biologic din sol. 10. BIOSURFACTANI Cercetrile din domeniul biosurfactanilor au nceput s se intensifice n ultimii ani datorit potenialului mare de utilizare a acestora n diferite ramuri ale economiei cum ar fi: agricultura, industriile alimentar, farmaceutic, petrochimic, a ieiului i hrtiei. Dezvoltarea acestei direcii de cercetare este foarte important n principal datorit preocuprii actuale pentru protecia mediului nconjurator. Cel mai mare avantaj al surfactanilor microbieni fa de cei chimici este faptul c sunt biodegradabili i nu sunt toxici pentru mediul natural. Biosurfactanii au devenit un produs biotehnologic important cu aplicaii n industrie i medicin. Motivul popularitii lor ca produi microbieni foarte valoroi const n activitatea lor specific, toxicitatea sczut, relativ uor de obinut i domeniile variate de aplicabilitate. Pot fi utilizai ca emulsifiani, de-emulsifiani, ageni de nmuiere, ageni de dispersare, ageni de spumare, ingredieni alimentari activi i detergeni n diferite sectoare industriale cum ar fi: petrol i petrochimie, chimie organic, alimentar i a buturilor, cosmetic i farmaceutic, minier i metalurgic, agrochimie i fertilizani, protecia i managementul mediului, etc. Numeroase specii de bacterii, levuri i fungi filamentoi produc macromolecule care au proprieti tensioactive, surface-active. Biosurfactanii produi de aceste microorganisme au un potenial comercial mare, putnd fi utilizai n numeroase aplicaii alimentare i nonalimentare, precum: bioremediere, recuperarea iteiului, formularea erbicidelor i pesticidelor, produse cosmetice (ex. detergeni i cosmetice), formularea lubrifianilor i inhibitori ai creterii microorgansimelor. Soforolipidele, substane de natur glicolipidic sintetizate de mai multe specii de Candida sau alte specii de levuri nrudite, conin diglucide legate de acizi grai hidroxilai prin legturi glicozidice. Soforolipidele sunt un grup de biosurfactani cu aplicaii poteniale i produse noi (Solaiman, 2004). 10.1. UTILIZAREA MICROORGANISMELOR N RECUPERAREA IEIULUI Un domeniu cu considerabile poteniale aplicaii ale biosurfactanilor este recuperarea ieiului microbial enhanced oil recovery (MEOR). Microorganismele din rezervoare sunt stimulate s produc polimeri i surfactani care ajut prin scderea tensiunii superficiale la interfaa dintre iei i roc. Pentru a produce biosurfactani in situ, microorganismelor din rezervoare li se furnizeaz substraturi ieftine, precum melasa sau substane anorganice, pentru stimularea creterii i producerea biosurfactanilor. Pentru a putea fi utile n recuperarea ieiului in situ, bacteriile trebuie s fie capabile s creasc n condiiile extreme din rezervoarele de iei: temperatura ridicat, presiune, salinitate i un nivel sczut de oxigen. Au fost izolate cteva bacterii aerobe i anaerobe termofile tolerante la presiune i salinitate moderat, care sunt capabile s mobilizeze iei nerafinat n experimente de laborator. Clark i colab. au estimat ca 27% din rezervoarele de iei din USA sunt influenate de creterea

microorganismelor i pot fi folosite n recuperarea ieiului. Eficacitatea acestei tehnici a fost raportat n studii n cmp care sau realizat n USA, Cehia, Slovacia, Romnia, Ungaria, Polonia i Olanda. 10.2. DEGRADAREA HIDROCARBURILOR N SOL Degradarea depinde de prezena n sol a speciilor de microorganisme care degradeaz hidrocarburi, de compoziia hidrocarburilor, disponibilitatea oxigenului, apa, temperatura, pH-ul i substanele anorganice. Natura fizic a hidrocarburilor poate de asemenea influena biodegradarea. Adugarea surfactanilor sintetici sau biosurfactanilor duce la creterea mobilitii i solubilitii hidrocarburilor, fapt foarte important pentru o degradare microbian eficace. Utilizarea biosurfactanilor n degradarea hidrocarburilor a dat rezultate diferite. Lindley i Heydeman au utilizat tulpina fungic Cladosporium resiuae care crescut pe un amestec de alcani a produs acizi grai extracelular i fosfolipide, n principal acid dodecanoic i fosfatidilcolina. Suplimentarea mediului de cultur cu fosfatidilcolina a mbuntit degradarea alcanilor cu 30%. Foght i colab. au raportat c emulsifiantul Emulsan stimuleaz mineralizarea compuilor aromatici de o cultur pur bacterian, dar inhib procesul de degradare cnd este utilizat o cultur mixt de bacterii. Oberbremer i Muller-Harting au utilizat populaii mixte de microorganisme din sol pentru testarea degradrii hidrocarburilor coninute de iei. n prima faz a degradarii hidrocarburilor a fost folosit naftalenul; n timpul celei de-a doua faze au fost degradate alte componente ale ieiului, dup producerea biosurfactanilor de anumite microorganisme care au sczut tensiunea interfacial. O metod de ndeprtare a contaminanilor cu hidrocarburi din sol este adugarea biosurfactanilor n solul contaminat pentru a crete astfel mobilitatea acestora. Hidrocarburile astfel emulsionate pot fi apoi recuperate cu o sond i apoi biodegradate. A fost studiat splarea solului in situ cu doi surfactani sintetici Adsee 799 i Hyonic NP-90. ndeprtarea hidrocarburilor din sol prin adugarea surfactanilor la apa de splare a avut un oarecare succes. Mai multe tulpini de bacterii anaerobe produc biosurfactani care reduc tensiunea superficial de la 27 la 50 mN/m ceea ce permite solubilizarea hidrocarburilor. Biosurfactanii au fost utilizai i pentru recuperarea substanelor xenobiotice. Astfel, Berg i colab. au utilizat surfactani produi de o tulpin de Pseudomonas aeruginosa UG2, care au crescut solubilitatea hexaclorobifenilului adugat unei probe de lam permind recuperarea acestuia n proporie de 30% n faza apoas. Comparativ cu utilizarea unui surfactant chimic - ligninsulfonat de sodiu, acest procent a fost de 3 ori mai mare (9,3%). Adugarea simultan a surfactantului biologic i a celui chimic a avut un efect sinergic, solubilizarea hexaclorobifenilului fiind de 41,5%. Un alt exemplu este tulpina Pseudomonas ceparia AC1100 care produce un emulsifiant ce formeaz o suspensie stabil cu 2,4,5,-T i de asemenea prezint o activitate de emulsifiere fa de clorofenoli, putnd fi folosit n degradarea bacterian a compuilor organoclorurai. 10.3. DEGRADAREA HIDROCARBURILOR N MEDIUL ACVATIC Atunci cnd este deversat petrol n mediul acvatic hidrocarburile uoare se volatilizeaz, iar hidrocarburile polare se dizolv n ap. Totui din cauza solubilitii sczute a petrolului < 1ppm, majoritatea componentelor acestuia rmn la suprafaa apei. ndeprtarea acestora se poate face prin procese de fotooxidare, evaporare i degradare microbian. Deoarece microorganismele care degradeaz hidrocarburile sunt prezente n apa de mare, biodegradarea poate fi una dintre cele mai eficiente metode de ndepartare a poluanilor. Surfactanii amplific procesul de degradare prin disperarea i emulsionarea hidrocarburilor. Microorganisme care sunt capabile s degradeaze compui CxHy au fost izolate din mediul acvatic. Aceste microorganisme care manifest activitate de emulsionare ca i microorganismele din sol produc surfactani care pot fi utili n mediul acvatic. Chakrabarty a raportat c un emulsifiant produs de tulpina Pseudomonas aeruginosa SB30 este capabil s disperseze petrolul n picturi foarte fine, putnd fi util n curarea tancurilor cu petrol. Astfel, un compartiment al unui tanc

petrolier ce coninea balast de ap uleioas a fost suplimentat cu uree, K2HPO4 i aerat timp de 4 zile. S-a constat c tancul nu mai prezenta stratul fin de reziduuri care au fost ndeprtate, datorit aciunii surfactanilor care au fost produi de bacterii n urma suplimetrii cu substane nutritive i oxigen. Surfactanii au fost studiai pentru utilizarea n reducerea viscozitii titeiului, pentru a facilita recuperearea i transportul lui. Emulsan, un lipopolizaharid produs de Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 a fost propus pentru utilizarea n industria petrolier pentru: curarea petrolului i nmolului din barje i tancuri, reducerea viscozitii ieiului, recuperea ieiului i stabilizarea emulsiei ap-petrol n combustibili. Solubilizarea specific a unor compui CxHy n timpul creterii organismelor procariote a fost observat de Reddy i colab. Solubilizarea compuilor CxHy a fost puternic inhibat de EDTA care a fost depait de ionii de Ca2+ n exces, ceea ce a dus la concluzia c solubilizarea specific a compuilor CxHy este un mecanism important n nelegerea modului de degradare a acestora. 10.4. DEGRADAREA PESTICIDELOR Datorit proprietilor biodegradative a biosurfactanilor acetia pot fi utilizai n aplicaii de bioremediere pentru protecia mediului, n special pentru ndeprtarea pesticidelor. Studiind literatura de specialitate se poate remarca faptul c aplicarea biosurfactanilor n domeniul degradrii pesticidelor este nc la nceput comparativ cu domeniul degrdrii hidrocarburilor. n India cteva laboratoare au iniiat studii n acest sens, remarcndu-se lucrrile cercettorilor: Banarjee i colab. pe 2,4,5-acid tricloroacetic, Patel i Gopinath pe Fenthion, Anu Appaiah i Karanth pe HCH, care au fost susinute la diferite simpozioane. Hexaclorociclohexanul HCH este un pesticid nca foarte mult utilizat n numeroase ri. Dintre cei opt izomeri cunoscui ai HCH, forma constituie mai mult de 70% din produsul tehnic, care nu are efect insecticid i se presupune c este carcinogenic. n India utilizarea HCH, care este un amestec izomeric, continu datorit preului mai sczut cu de 10 pn 12 ori fa de Lindan care conine HCH pur. Trebuie subliniat faptul c poluarea mediului cu HCH amenin toate formele de via. Solubilitatea mic a acestuia este unul dintre factorii limitativi n degradarea microbian a HCH. Prezena celor 6 ioni de clor n molecula HCH este un alt factor care face ca acesta s fie persistent n biosfer. Dei exist cteva cercetri n legtur cu biodegradarea izomerilor specifici ai HCH n animale, plante, sol i sisteme microbiene, datele referitoare la metabolizarea HCH de ctre microorganisme este limitat. Mai mult, mecanismul exact al translocrii HCH-lui la locul descompunerii i degradrii HCH n bacterii nu este foarte bine neles. n cursul experimentelor realizate de cercettori din India care au avut ca scop degradarea bacterian a HCH au fost izolate mai multe tulpini bacteriene capabile s degradeze HCH. Una dintre tulpini care este eficace n degradarea HCH a fost identificat ca aparinnd genului Pseudomonas Ptm+. Aceste tulpini produc biosurfactani extracelular n mediu mineral ce conine HCH. Biosurfactanii obtinui emulsioneaz organoclorura HCH solid ntr-o msur mai mare dect alte substane organoclorurate ca DDT i ciclodienele, sugernd astfel specificitatea surfactanilor n dispersarea HCH. De asemenea, a fost demonstrat faptul c cea mai mare cantitate de emulsifiani se sintetizeaz nainte de nceperea degradrii HCH de ctre tulpina de Pseudomonas crescut n mediu lichid. Rolul biosurfactanilor n degradarea HCH a fost descoperit utiliznd biosurfactani parial purificai. Biosurfactanii extracelulari sunt substane macromoleculare de natur lipoglicoproteic. Componenta glucidic a fost identificat prin diferite metode analitice ca fiind ramnoza. Aceast component este stabil i este necesar activitaii surfactantului. Cercetri minuioase au relevat faptul c fracia proteic reprezint enzime din metabolismul HCH. n prezena biosurfactanilor HCH este convertit prin aciunea isomerazei i declorinazei la tetraclorohexan i apoi la clorofenol. Producia biosurfactanilor pe Fenthion un insecticid lichid a strnit de asemenea interesul cercettorilor. Bacillus subtilis secret biosurfactani att n timpul fermentaiei n mediu lichid ct i pe mediu solid. Surfactanii microbieni produi de aceste dou tulpini prezint proprieti de ageni de curare pentru ndeprtarea pesticidelor din containerele utilizate, tancurile de amestecare i de pstrare. S-au fcut testri pentru standardizarea parametrilor produciei biosurfactanilor n ambele sisteme de fermentaie lichid i solid. Un alt

sudiu a relevat faptul c biosurfactanii produi de tulpina Pseudomonas Ptm+ au permis mrirea gradului de dispersare a HCH n ap de 250 de ori. Adugarea fie a microorgansimelor fie a biosurfactanilor produi de acestea pe fructe, legume i semine a ndeprtat reziduurile de HCH foarte bine. Studii de laborator au artat c biosurfactanii sunt foarte eficieni n curarea containerelor n care reziduurile de HCH sunt aderate de perete. Au fost realizate studii pentru producerea la scar industrial a biosurfactanilor produi de tulpina Pseudomonas Ptm+ i se preconizeaz bioformularea acestora pentru utilizarea n ndeprtarea HCH din soluri contaminate. 10.5. IMPORTANA BIOSURFACTANILOR PENTRU ARHITECTURA CELULAR Recent a fost raportat importana biosurfactanilor pentru arhitectura celular bacterian. Aceasta include rolul surfactinului n formarea sporilor la Bacillus subtilis, rolul ramnolipidului n formarea biofilmelor la Pseudomonas aeruginosa i rolul streptofactinului n formarea miceliilor aeriene la Streptomyces tendae. Din punct de vedere structural biosurfactanii sunt molecule amfifile, conin pri polare i nonpolare distincte care le confer capacitatea de a se acumula la suprafa i la interfa. Biosurfactanii sunt produi de bacterii din diferite genuri. Genele care codific pentru biosinteza biosurfactanilor sunt diferite i ca rezultat structura molecular asociat fiecarei clase de surfactani este foarte variat, ceea ce confer acestora proprieti fizico-chimice diferite. Gruprile nonpolare coada sunt n general asemntoare la biosurfactani, ceea ce i difereniaz sunt gruprile polare capul, de aceea biosurfactanii sunt clasificai n funcie de capul polar n urmtoarele clase: glicolipide, fosfolipide, sruri ale acizilor grai i surfactani polimerici. 10.6. UTILIZAREA BIOSURFACTANILOR N AGRICULTUR Extractul lipidic obinut ca bioprodus n timpul producerii drojdiei uscate, este un lichid de culoare brun cu miros caracteristic i activitate interfacial ridicat. Acest produs are aplicaii multiple n agrochimie, flotaia mineralelor, producerea i prelucrarea bitumului. Produsul poate fi utilizat ca agent de emulsionare i dispersare n timpul formulrii erbicidelor, pesticidelor i prepararea reglatorilor de cretere ai plantelor. Includerea fosfolipidelor n formulare faciliteaz penetrarea substanelor active n esuturile plantelor, fcnd posibil aplicarea la o concentraie foarte sczut a substanelor. Acizii grai constitueni ai extractului biolipidic au activiti antifitovirale i antifungice i pot fi aplicate n combaterea bolilor plantelor. De asemenea, aceti acizi grai cresc tolerana la stres a plantelor, ducnd la creterea produciei n ciuda secetei. 10.7 PRODUCEREA MICROBIAN A BIOSURFACTANILOR Numeroase microorganisme produc substane tensioactive, biosurfactani, care variaz n ceea ce privesc proprietile chimice i dimensiunea moleculei. n general surfactanii cu mas molecular mic sunt de natur glicopilidic, iar cei cu mas molecular mare sunt fie heteropoliglucide polianionice care conin o parte hidrofob legat prin legturi covalente sau complexe constituite din poliglucide i proteine. Producia de biosurfactani depinde foarte mult de mediul de cretere al microorganismelor. Marea diversitate a biosurfactanilor face din ei un grup interesant de substane cu aplicaii n multe domenii cum ar fi agricultura, sntatea, industria alimentar, conbaterea polurii mediului (de ex. n degradarea hidrocarburilor prezente n sol). Biosurfactanii sunt compui amfifili produi la suprafaa celulelor microbiene sau secretai n mediu fiind formai dintr-o parte hidrofil i una hidrofob, care reduc tensiunea superficial i interfacial dintre dou molecule diferite la suprafa i respectiv interfa. Deoarece biosurfactanii i bioemulsifianii manifest proprieti de

emulsionare, bioemulsifianii sunt adesea categorisii ca biosurfactani, dei acetia pot s nu scad tensiunea superficial. Un biosurfactant poate avea una dintre urmtoarele structuri: acid micolic, glicoplipide, complex lipopolizaharidic, lipoproteine sau lipopeptide, fosfolipide sau suprafaa celular n sine. O atenie considerabil s-a acordat producerii moleculelor active de origine biologic datorit utilizrii poteniale n prelucrarea alimentelor, farmacologie i industria petrolului. Dei tipul i cantitatea de surfactani microbieni produs depinde n primul rnd de organismul productor, factori precum sursa de carbon, azot, microelementele, temperatura, gradul de aerare afecteaz de asemenea producia organismului. Poluanii hidrofobi prezeni n hidrocarburile din petrol, sol i mediu acvatic necesit o solubilizare nainte de a fi degradate de microorganisme. Mineralizarea este guvernat de desorbia hidrocarburilor din petrol. Surfactanii pot mri suprafaa materialelor hidrofobe, cum ar fi pesticidele din sol i mediul acvatic, astfel crescndu-le solubilitatea n ap. Astfel, prezena surfactanilor poate crete gradul de degradare de ctre microorganime al poluanilor. 10.8. MICROORGANISME PRODUCTOARE DE BIOSURFACTANI Microorganismele utilizeaz o varietate mare de compui organici ca surs de carbon i energie pentru creterea lor. Atunci cnd sursa de carbon este un substrat insolubil de ex. o hidrocarbur (CxHy), microorganismele faciliteaz difuzia acestui compus n celul prin producerea biosurfactanilor. Unele bacterii i levuri secret surfactani ionici care emulsioneaz substratul hidrocarbura n mediul de cultur. Cteva exemple de biosurfactani din aceast categorie sunt ramnolipidele care sunt produse de diferite specii de Pseudomonas sau soforolipidele care sunt produse de mai multe de specii de Torulopsis. Alte microorganisme sunt capabile s-i modifice structura peretelui celular, care se traduce prin sintetizarea lipopolizaharidelor sau surfactanilor anionici n peretele celular. Ca exemple de microorganisme din aceast categorie pot fi enumerate: Candida lipolytica i C. tropicalis care produc lipopolizaharide legate de peretele celular atunci cnd sunt crescute pe n-alcani; Rhodococcus erytropolis i multe specii ale genului Mycobacterium; Arthrobacter sp. care sintetizeaz corinomicolat trehaloza anionic. Exist lipopolizaharide cum este Emulsanul sintetizat de Acinetobacter sp., lipoproteine sau lipopeptide cum sunt Surfactinul i Subtilinul produse de Bacillus subtilis. Ali biosurfactani sunt: Micolatul i Corinomicolatul produse de Rhodococcus sp., Corynebacteria sp., Mycobacteria sp., Nocardia sp. i ornitinlipide care sunt produse de Pseudomonas rubescens, Gluconobacter cerinus i Thiobacillus ferroxidans. 10.9. CLASIFICAREA I NATURA CHIMIC A BIOSURFACTANILOR Surfactanii microbieni sunt molecule comlexe cu structur foarte variat care includ peptide, acizi grai, fosfolipide, glicolipide, antibiotice, lipopeptide, etc. Microorganismele produc de asemenea surfactani care pot fi combinaii de mai multe substane, acetia fiind numii surfactani microbieni polimerici (PMS). Muli dintre biosurfactani au fost purificai i a fost elucidat structura chimic. Biosurfactanii cu mas molecular mare sunt n general heteropolizaharide polianionice ce conin att polizaharide ct i proteine, iar biosurfactanii cu mas molecular mic sunt n general glicolipide. Cantitatea de biosurfactani produs de microorganisme variaz n funcie de condiiile de mediu. Celulele microbiene intacte care au o suprafa puternic hidrofob pot fi ele nsele biosurfactani. n unele cazuri, surfactanii pot avea un rol imporant n creterea microorganismelor pe substraturi insolubile precum hidrocarburile i sulful. Surfactanii extracelulari au rol n aderena, emulsifierea, dispersia, floculaia, agregarea celulelor i n fenomenul de desorbie. n continuare vor fi descrise pe scurt tipurile de biosurfactani n funcie de natura lor chimic:

1. Glicolipidele - sunt cele mai obinuite tipuri de biosurfactani. Constituenii mono-, di-, tri- i tetraglucidi includ glucoza, manoza, galactoza, acidul glucuronic, ramnoza i sulfatul de galactoz. Componenta lipidic este constituit din acizi grai asemntori fosfolipidelor. Glicolipidele pot fi clasificate astfel: a) Trehalozolipide - creterea n form de serpentin observat la diferite specii ale genului Mycobacterium se datoreaz prezenei esterilor de trehaloz situai pe suprafaa celular. Factorii de legatur de la diferite specii de Mycobacteria, Corynebacteria, Nocardia i Brevibacteria difer n dimensiunea i strucutra esterilor acidului micolic. b) Soforolipidele - sunt produse de diferite tulpini de levuri din genul Torulopsis. Unitatea glucidic este diglucidul soforoz, care este constituit din dou uniti -1,2-glucoz. Gruprile hidroxi sunt n general acetilate. Soforolipedele reduc tensiunea superficial dintre dou molecule diferite la suprafa, dei sunt ageni de emulsionare. Soforolipidele produse de Torulopsis au proprieti de stimulare, inhibare i nu au efect asupra creterii levurilor pe substraturi insolubile n ap. c) Ramnolipidele unele tulpini de Pseudomonas sp. produc cantiti mari de glicolipide constituite din dou molecule de ramnoza i dou molecule de acid hidroxidecanoic. Una din gruprile OH ale unuia dintre acizi este implicat n legatura glicozidic cu captul reductor al ramnozei, iar alt grupare OH a celui de-al doilea acid este implicat n formarea esterului. Deoarece unul dintre acizii carboxilici este liber ramnolipidele au caracter acid pH=4. Ramnolipidele scad tensiunea superficial, emulsific hidrocarburile i stimuleaz cretrea celulelor de Pseudomonas pe mediu ce conine n-hexadecan. Sinteza ramnopilidelor este influenat n mare msura de limitarea sursei de azot. Ramnolipidele purificate scad tensiunea superficial fa de n-hexadecan n ap cu 1 mN/m i au o concentraie micelar critic (cmc) de 10 pn la 30 mg/l n funcie de pH i salinitate. 2. Acizii grai sunt produi din alcani de ctre microorganisme pe cale oxidativ. Pe lng lanul de acizi, microorganismele produc un complex de acizi grai care conin grupri OH i ramificri alchil. Unii dintre aceti acizi sunt de exemplu, acizii corinomucolici, care sunt surfactani. 3. Fosfolipidele sunt o component important a membranelor microbiene. Cnd anumite bacterii care degradeaz hidrocarburi sau levuri sunt crescute pe substrat de alcani, nivelul fosfolipidelor crete foarte mult. Fosfolipidele secretate de o tulpin de Acinetobacter cultivat pe substrat cu hexadecan prezint proprieti de poteniali surfactani. Fosfolipidele produse de Thiobacillus thiooxidans sunt responsabile de solubilizarea sulfului necesar creterii. 4. Antibiotice a) Gramicidin S multe bacterii produc un antibiotic decapeptid, gramicidin S. Un preparat obinut din spori de la Brevibacterium brevis conine o cantitate foarte mare de gramicidin S puternic legat de suprafaa extern a sporilor. Mutantele crora le lipsete gramicidinul S germineaz rapid i nu au o suprafa lipofilic. Activitatea antibacterian a gramicidin S se datoreaz activitii de suprafa mari. b) Polimixinele acest grup de antibiotice produs de Brevibacterium polymyxa i ali bacili nrudii. Polimixin B este un decapeptid n care aminoacidul din poziia 3 pn la cel din poziia 10 formeaz o octapeptid ciclic. Un lan ramificat de acizi grai este legat la acidul terminal 2,4-diaminobutiric. Polimixinele sunt capabile s solubilizeze (degradeze) anumite enzime din membrana celular.

c) Surfactinul (subtilisinul) unul dintre cei mai activi biosurfactani produi de Bacillus subtilis este un lipopetid ciclic numit surfactin. Cantitatea de surfactin produs de B. subtilis poate fi mbuntit pn la 0,8 g/l prin ndeprtarea continu a surfactinului prin fracionarea spumei i adugarea unor sruri cu fier sau magneziu la mediul de cultur. d) Antibioticul TA Myxococcus xanthus produce antibioticul TA care inhib sinteza peptidoglicanului prin interferarea cu polimerizarea pentapeptidelor lipodizaharidice. Acest antibiotic este folosit n aplicaii chemoterapeutice. 5. Surfactanii microbieni polimerici muli dintre acetia sunt heteroglucide polimerice ce conin proteine. a) Emulsanul Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 (ATTC 31012) a fost izolat n timpul investigrii unui factor care limita degradarea petrolului n apa marin. Aceast bacterie emulsifia eficient hidrocarburile n ap i a fost folosit mai trziu cu succes pentru curarea compartimentelor cargourilor unui tanc petrolier. Acest fenomen s-a datorat producerii extracelulare a unui factor emulsifiant cu greutate molecular mare, emulsanul. b) Complexul poliglucid proteic o mutant a tulpinii A. calcoaceticus BD413, secret cantiti mari de poliglucide mpreun cu proteine. Activitatea de emulsifiere necesit ambele substane att poliglucidele ct i proteinele. c) Alti emulsifiani produi de Acinetobacter producerea de emulsifiani extracelulari este larg rspndit printre speciile genului Acinetobacter. n urma unui screening 8 din 16 tulpini de A. calcoaceticus produceau cantiti mari de emulsifiani dup cretrea pe mediu cu etanol. Aceast fraciune extracelular a fost foarte activ n deemulsifierea unei emulsii format din cherosen i ap stabilizat cu o mixtur de Tween 60 i Span 60. d) Complexe poliglucide-lipide produse de levuri un emulsifiant, liposan, parial purificat ce conine 95% glucide i 5% proteine este produs de specia Endomycopsis lypolitica YM pe mediu cu CxHy. Torulopsis petrophilum produce diferite tipuri de surfactani n funcie de mediul de cultur. Pe substraturi insolubile aceast levur produce glicolipide care sunt incapabile s stabilizeze emulsii, dar dac este folosit glucoza ca substrat levura sintetizeaz un potenial emulsifiant. e) Proteine emulsifiante bacteria Pseudomonas aeruginosa produce proteine emulsifiante. Aceast protein PA este produs pe substraturi ce conin n-alcani cu catena mare, 1-hexadecan i alcool acetic, dar nu i substraturi precum glucoza, glicerolul sau acidul palmitic. Proteina are masa molecular de 14.000 Da i conine muli aminoacizi serin i treonin. f) Surfactani produi de Pseudomonas PG-1 Pseudomonas PG-1 este o bacterie care produce surfactani foarte eficieni, ea utilizeaz diferite hidrocarburi inclusiv alcani, alchene i benzen-alchil sub forma gazoas i lichid. g) Biofloculani produi de Cyanobacterium phormidium J-1 modificrile strii hidrofobe a suprafeelor celulare ale cianobateriei Cyanobacterium phormidium au fost corelate cu producerea unui agent emulsifiant numit emulcian. Emulcianul parial purificat are o greutate molecular mai mare de 10.000 Da i conine glucide, proteine i esteri ai acizilor grai. Adugarea emulcianului la celulele hidrofobe modific aceast stare fcndu-le hidrofile i permite detaarea de picturile de hexadecan sau bilele de fenil sefaroz.

6. Surfactani particulai a) Vezicule extracelulare produse de Acinetobacter sp. H01-N Acinetobacter sp. cnd crete pe mediu cu hexadecan acumuleaz vezicule extracelulare cu diametru de 20 pn la 50 mm diametru cu o densitate de 1,158 g/cm3. Aceste vezicule par a avea rol n utilizarea alcanilor de ctre Acinetobacter sp. H01-N. b) Celule microbiene cu suprafaa celular hidrofob foarte mare majoritatea microorganismelor care pot degrada hidrocarburi, multe dintre cele care nu degradeaz hidrocarburile, unele specii ale genului Cyanobacteria i multe microorganisme patogene au o puternic afinitate pentru interfeele hidrocarburi-ap i aer-ap. n aceste cazuri celulele microbiene sunt ele nsele surfactani. 10.10 FACTORII CARE AFECTEAZ PRODUCEREA BIOSURFACTANILOR Dei biosurfactanii au structuri diferite, aa cum a fost evideniat n paragraful anterior, exist cteva caracteristici asemntoare n ceea ce privete sinteza lor. De exemplu, producia biosurfactanilor poate fi indus de glucide sau alte substraturi insolubile. Acest efect descris de diferii cercettori se refer la muli compui tensioactivi. Un alt fenomen este represia catabolic a sintezei biosurfactanilor de ctre glucoz sau ali metabolii primari. De exemplu, n cazul speciei Arthrobacter paraffineus nu a putut fi izolat nici un biosurfactant din mediu atunci cnd a fost utilizat glucoza ca surs de carbon n locul hexadecanului. n mod similar tulpina Pseudomonas aeruginosa S7B1 a sintetizat o protein activator pentru oxidarea n-alcanilor atunci cnd a fost cultivat pe substrat cu hidrocarburi, dar nu a sintetizat nimic pe mediu cu glucoz, glicerol sau acid palmitic. Torulopsis petrophilum nu a produs nici un glicolipid atunci cnd a fost crescut pe un mediu care coninea doar o surs de carbon solubil. Atunci cnd a fost utilizat glicerolul ca substrat producerea ramnolipidului de ctre P. aeruginosa a fost redus prin adugarea glucozei, acetatului, succinatului sau citratului n mediu. Tipul, calitatea i cantitatea producerii biosurfactanilor sunt influenate de natura sursei de carbon, de concentraia ionilor de azot, fosfor, magneziu, fier i mangan din mediu, de condiiile de cultur, cum sunt pH-ul, temperatura, agitarea i rata diluiei n cultura continua. Producerea biosurfactanilor de ctre tulpinile de Pseudomonas MEOR171 i MEOR171 nu este afectat de temperatur, pH, Ca, Mg fiind mbuntit de salinitatea crescut. Sursa de azot poate fi o cheie important n reglarea sintezei biosurfactanilor. Tulpina Arthrobacter paraffineus ATTC 19558 prefer amoniul n locul nitratului ca sursa de azot anorganic pentru producerea de biosurfactani. De asemena, utilizarea ureei poate mri producia de biosurfactani. O modificare a ratei de cretere a anumitor microorganisme este adesea suficient pentru mrirea produciei biosurfactanilor. n unele cazuri adugarea cationilor multivaleni la mediul de cultur poate avea un efect benefic n producerea biosurfactanilor. n afar de substanele enumerate anterior implicate n reglarea producerii biosurfactanilor, i ali compui cum ar fi etanbutolul, penicilina, cloramfenicolul i EDTA influeneaz sinteza biosurfactanilor. Reglarea producerii biosurfactanilor prin aceti compui se face fie prin efectul lor de solubilizare a substraturilor nepolare glucidice fie prin mrirea produciei pe substraturi solubile (polare). n unele cazuri sinteza biosurfactanilor este reglat de pH i temperatur. De exemplu n producerea ramnolipidului de Pseudomonas sp., n formarea celobiozolipidului de ctre Ustilago maydis i n formarea soforolipidului de ctre Torulopsis bombicola, pHul joac un rol important, iar n cazul tulpinilor Arthrobacter paraffineus ATTC 19558, Rhodococcus crythropolis i Pseudomonas sp. DSM 2874 temperatura este important. n toate aceste cazuri totui producia biosurfactanilor a fost dependent de temperatur.

11. TEHNICI MOLECULARE PENTRU IDENTIFICAREA RAPID A MICROORGANISMELOR DIN ECOSISTEME ACVATICE I TERESTRE POLUATE 11.1. PRINCIPII GENERALE DE IZOLARE I CARACTERIZARE A ACIZILOR NUCLEICI Acizii nucleici sunt substane macromoleculare alctuite din nucleotide. Nucleotidele sunt formate dintr-o baz azotat, o pentoz i un radical fosfat. Bazele azotate sunt de dou tipuri: purinice adenina i guanina, respectiv pirimidinice timina, citozina i uracilul. n structura ADN intr dezoxiriboza, adenina, guanina, timina, citozina i radicalul fosfat. n structura ARN intr riboza, adenina, guanina, uracilul, citozina i radicalul fosfat. O baz azotat i o pentoz sunt legate prin legturi -N-glicozidice formnd o nucleozid. Adugarea radicalului fosfat la nucleozid duce la formarea unei nucleotide. Nucleotidele sunt legate ntre ele prin legturi fosfodiesterice. ADN este materialul genetic al majoritii organismelor cu excepia viroizilor i a ribovirusurilor. n vederea izolrii i purificrii acizilor nucleici trebuie parcurse mai multe etape: 1. Alegerea materialului biologic de la care se izoleaz acizii nucleici. Virusuri se folosesc suspensii ce conin particule virale (obinute n urma lizei celulare a bacteriilor sensibile); Bacterii se folosesc suspensii bacteriene obinute dintr-o cultur proaspt de 18h; Drojdii se folosesc suspensii de drojdii obinute dintr-o cultur proaspt de 18 h; Fungi filamentoi se folosete miceliu obinut n mediu lichid de 24-48 h; Organisme animale se aleg organe, esuturi moi, culturi de celule; Plante se alege esut foliar tnr, calus, embrioni. 2. Distrugerea peretelui celular. Virusuri distrugerea proteinelor capsidale se realizeaz cu fenol. ADN-ul i ARN-ul celulei gazd sunt degradate prin tratament enzimatic cu DN-az i RN-az; Bacterii prin nghe-dezghe se fragmenteaz peretele celular i se obin protoplati, care fiind sensibili la presiunea osmotic se lizeaz; - tratament enzimatic cu lizozim, lizostafin; pentru bacterii Gram-pozitive concentraia de lizozim trebuie s fie mai mare (15-30 mg/ml) dect la bacteriile Gram-negative (5-15 mg/ml). Lizozimul este un complex enzimatic extras din albu de ou activ la pH alcalin (minim pH=8). Lizozimul degradeaz legturile -1,4dintre acidul N-acetilmuramic i N-acetilglucozamina componente ale peptidoglicanului. La bacteriile Grampozitive din genul Staphylococcus se utilizeaz lizostafin un complex enzimatic sintetizat de anumite tulpini de stafilococi, lizozimul fiind ineficient; -utilizarea antibioticelor din gama -lactamilor (penicilin, tetraciclin), care au rol n inhibarea formrii peretelui celular; -ultrasonicarea ultrasunetele provoac ruperea pereilor celulari. Ele sunt generate prin trecerea unui curent alternativ printr-un cristal de cuar; Drojdii i fungi filamentoi -mojarare cu nisip de cuar sau bile de sticl urmat de vortexare; -tratament enzimatic cu suc de melc (complex enzimatic extras din sucul gastric al Helix pomatia), care conine chitinaz, celulaz, proteaz, amilaz, etc; -ultrasonicarea; Plante

-nghe-dezghe i mojarare cu nisip de cuar; -tratament enzimatic cu celulaz 3. Liza celular se realizeaz cu scopul de-a distruge membrana plasmatic i de-a elibera coninutul celular. Liza se realizeaz cu detergeni (membrana plasmatic fiind de natur fosfolipidic) de tipul SDS (dodecil sulfat de sodiu), CTAB (cetiltrimetil amoniu brom), sarcozil, deoxicolat de sodiu. n urma lizei celulare se elibereaz i endonucleaze, care degradeaz materialul genetic. Astfel, pentru protejarea ADN de aciunea endonucleazelor se adaug n tamponul de liz EDTA (etilendiaminotetraacetat) - agent chelator ce fixeaz ionii de Mg2+, care sunt cofactori ai DN-azelor i fr de care nu pot funciona. pH-ul tamponului de liz trebuie s fie alcalin. Liza celular este total atunci cnd soluia se clarific i devine vscoas (pn atunci suspensia are un aspect lptos). 4. Deproteinizarea se realizeaz fie cu solveni organici fenol, amestec de cloroform: alcool izoamilic (24:1 v/v) sau amestec fenol: cloroform: alcool izoamilic (25:24:1 v/v), fie prin tratament enzimatic (pronaz E, proteinaz K), fie cu soluii saline concentrate (KCl 2,5M). Se obine o emulsie, care dup centrifugare se separ astfel: faza apoas (supernatantul) conine soluia de ADN, stratul proteic (pelicul proteic), faza organic, iar la baza tubului de centrifug nisip de cuar, resturi celulare. 5. Precipitarea ADN -alcool etilic absolut rece (-20C), urmat de incubare peste noapte la congelator; -alcool izopropilic, urmat de incubare 10-20 minute la temperatura camerei (20C); 6. 7. Recuperarea ADN se realizeaz prin centrifugare 5-10 minute la 15.000 rpm i reluare ntr-un volum minim de tampon TE. Purificarea ADN pentru a putea fi folosit n experimentele ulterioare (transformare genetic, clivare cu enzime de restricie, PCR, RFLP) ADN trebuie s fie pur, necontaminat cu proteine i ARN. Pentru aceasta se repet deproteinizarea (pelicula proteic va fi mai subire), apoi se trateaz cu RN-az pentru a degrada ARN-ul contaminant. 11.2. DETERMINAREA CONCENTRAIEI I PURITII ACIZILOR NUCLEICI 11.2.1. DETERMINAREA PURITII I DOZAREA ACIZILIOR NUCLEICI PRIN METODE SPECTROFOTOMETRICE Concentraia de ADN sau ARN se poate determina pe baza absobiei radiaiilor UV la = 260 nm. Astfel, s-a determinat c la o valoare a absorbanei de 1 la 260 nm concentraia unei probe de ADN dublu catenar este de 50 g/ml i a unei probe de ARN este de 40 g/ml. Verificarea spectrofotometric a puritii ADN se face prin citirea absorbanei la lungimi de und specifice pentru ADN i pentru contaminanii posibili (polizaharide, EDTA, etanol = 230 nm; fenol = 270 nm; proteine =280) fa de tampon TE. Pentru evaluarea puritii ADN trebuie s se in cont de urmtoarele criterii: O valoare a raportului A260/A280 ntre 1,8 i 2 indic o puritate mare a soluiei de ADN; dac raportul este mai mare de 2 atunci proba este contaminat cu ARN, iar dac raportul este mai mic de 1,8 atunci proba este contaminat cu proteine; O valoare a raportului A260/A230 mai mic de 2 indic o contaminare cu polizaharide; Raportul A260/A270 indic gradul de contaminare cu fenol.

11.3. VERIFICAREA ELECTROFORETIC A ADN Electroforeza reprezint o metod fizico-chimic analitic i preparativ, care se bazeaz pe fenomenul migrrii unor particule ncrcate electric ntr-un mediu solid sub aciunea unui cmp electric extern. Migrarea moleculelor de acizi nucleici n gel de agaroz n cmp electric este o tehnic folosit n biologia molecular pentru separarea i identificarea acestora. Principiul general al electroforezei acizilor nucleici const n faptul c la pH neutru sau alcalin acizi nucleici au sarcin global negativ i ntr-un cmp electric vor migra spre electrodul pozitiv (anod). Moleculele migreaz n gel cu viteze diferite, n funcie de dimensiunea lor. Moleculele de dimensiuni mici vor migra cel mai repede, iar moleculele de dimensiuni mari vor migra mai ncet. Moleculele de ADN plasmidial pot avea diferite conformaii moleculare: circulare nchise covalent (CIC), suprancolcite circulare deschis (CD) i lineare. Moleculele cu astfel de conformaii migreaz diferit n gelul de electroforez: cel mai rapid migreaz forma CIC, apoi forma L i ultima forma CD. Intensitatea curentului electric aplicat gelului trebuie s fie de 5 V/cm. O tensiune mai mare determin distorsionarea benzilor de ADN, acestea aprnd curbate. Grosimea gelului trebuie s fie de 3-4,5 mm. Concentraia de agaroz poate varia ntre 0,3-2% n funcie de dimensiunea moleculelor de ADN ce urmeaz a fi separate. Pentru gelul de verificare a unor extracte de ADN cromosomal se folosete o concentraie de 0,7-0,9%. Colorarea moleculelor de ADN se realizeaz cu bromur de etidiu, care este un agent intercalant de tip fluorocrom (se intercaleaz ntre bazele azotate ale acizilor nucleici). Bromura de etidiu se prepar ca soluie stoc n ap cu concentraia de 10 mg/ml i se utilizeaz la o concentraie de 0,5-1g/ml. Bromura de etidiu se adugat fie direct la agaroz cnd se prepar gelul fie gelul poate fi colorat dup electroforez. Benzile de ADN pot fi vizualizate dup migrare la transiluminator UV (=250-310 nm). Avantajele electroforezei n gel de agaroz: este o metod rapid i simpl; prin aceast metod pot fi separate i identificate fragmente de ADN cu dimensiuni variabile; ADN poate fi localizat n gelul de agaroz prin colorare cu bromur de etidiu. Mobilitatea electroforetic a ADN n gelul de agaroz depinde de: mrimea moleculelor de ADN; concentraia agarozei; conformaia molecular a ADN; curentul aplicat. 11.4. TEHNOLOGIA PCR (POLIMERASE CHAIN REACTION) REACIA DE POLIMERIZARE N LAN Reacia de polimerizare n lan a unui fragment de ADN a fost elaborat n 1983 de Kary Mullis. n scurt timp tehnologia PCR a devenit una dintre cele mai importante i mai puternice metode n biologia molecular. Acumularea cunotinelor despre modul de funcionare al ADN polimerazelor termostabile, pe de o parte i dezvoltarea automatizrii aparaturii (termocicler), pe de alt parte, au permis utilizarea tehnologiei PCR pentru cercetare i diagnostic (Sreenivasaprasad i Mills, 1998). Reacia PCR este o metod cu foarte multe aplicaii n biologia molecular. Aceast reacie enzimatic permite amplificarea in vitro a unui anumit fragment de ADN dintr-o prob de ADN complex putnd genera cantiti de ordinul microgramelor din fragmentul int. De la apariia metodei n 1985, specificitatea, sensibilitatea i viteza acestei tehnologii au generat dezvoltarea mai multor metode cu aplicativitate n diverse arii de cercetare n domeniul biologiei pentru toate clasele de organisme. Dintre aplicaiile tehnologiei PCR pot fi amintite cele din domeniile micologiei, care includ genetica fungilor i sistematica, ecologiei i microbiologiei solului, fitopatologiei, micologiei medicale, biotehnologiei fungilor, etc. (Edel, 1998).

11.4.1. PRINCIPIUL REACIEI PCR Reacia PCR este o metod de amplificare exponenial enzimatic in vitro a unui fragment de ADN, fiind constituit din cicluri succesive de replicare a ADN, utiliznd doi primeri oligonucleotidici care flancheaz regiunea int i care hibridizeaz cu cele dou catene ale matriei de ADN, care conin regiunea ce va fi amplificat. Amplificarea se bazeaz pe utilizarea unei enzime, ADN polimeraza termostabil numit Taq polimeraza izolat de la Thermus aquaticus. Dup ce toate componentele necesare desfurrii reaciei PCR au fost amestecate, termociclerul parcurge o succesiune de etape care necesit diferite temperaturi de lucru: denaturarea ADN, legarea primerilor i amplificarea ADN. Prima etap presupune incubarea amestecului de reacie la o temperatur mare (90-95oC) care permite denaturarea matriei de ADN dublucatenar. Urmtoarea etap const n rcirea amestecului de reacie la o temperatur n jurul valorii de 55oC () pentru hibridizarea primerilor oligonucleotidici la capetele 3 ale celor dou catene monocatenare ale matriei de ADN. A treia etap necesit creterea temperaturii la 72oC pentru iniierea sintezei noilor catene de ADN. Aceast secven de trei etape corespunde unui ciclu al reaiei PCR. Timpul necesar desfurrii fiecrei etape este de regul de 1-2 minute. n ciclul al doilea, catena de ADN nou sintetizat este separat de catena matri prin denaturare i fiecare caten servete din nou ca matri n urmtoarele etape legarea primerilor i amplificare. De obicei se realizeaz 30-40 de cicluri. Teoretic dup parcurgerea a n cicluri n reacia PCR se vor forma 2n molecule de ADN int. Diferena fa de replicarea in vivo const n faptul c n reacia PCR etapa de desfacere a dublului helix de ADN matri i ataarea primerilor nu sunt realizate enzimatic ci cu ajutorul temperaturii, singura enzim utilizat fiind o polimeraz termostabil dependent de ADN cu funcie de replicaz. 11.4.2. COMPONENTELE I PARAMETRII REACIEI PCR ADN matri, primerii oligonucleotidici, ADN polimeraza i deoxiribonucleotidele trifosfat (dNTP) sunt amestecate ntr-un tampon ce conine ioni de Mg2+ (MgCl2). Volumul de reacie este de regul cuprins ntre 25-100 l. Condiiile standard pentru concentraiile diferitelor componente sunt redate n tabelul 4 i permit amplificarea majoritii secvenelor int, dar pot fi optimizate pentru fiecare reacie PCR nou. De exemplu, concentraia de MgCl2 necesar funcionrii Taq polimerazei este 1,5 mM. n cazul n care nu se obin rezultate bune dup reacia PCR aceast concentraie poate fi optimizat: o concentraie mai mare de clorur de magneziu poate crete cantitatea produilor de amplificare, dar totodat scade specificitatea. O concentraie mai mic de clorur de magneziu crete specificitatea, dar scade cantitatea produilor de amplificare. n mod similar temperatura i timpul necesare pentru fiecare etap a reaciei, n special n etapa de legare a primerilor, ar trebui optimizate pentru fiecare secven int i pentru fiecare pereche de primeri. Temperatura pentru legarea primerilor este n general optimizat prin tatonri empirice, creterea fcndu-se pn se vor obine rezultate bune n ceea ce privete cantitatea produilor de amplificare i specificitatea de reacie a enzimei. 11.6. TEHNICA ARDRA Identificarea unor organisme prin amplificarea unor secvene specifice de ADN prin tehnica PCR a nceput s devin tot mai frecvent utilizat datorit simplitii i a reproductibilitii metodei. Prin tehnica ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) analiza profilurilor electroforetice a unor secvene de ADN ribosomal amplificate i urmat de un tratament cu enzime de restricie, pot fi difereniate levurile la nivel de specie. Astfel, analiza profilului electroforetic a unor secvene intergenice spaiatoare dintre genele ce codific pentru ARNr 18S i ARNr 28S a permis diferenierea unor specii ale

genului Saccharomyces. In urma clivrii acestor secvene de ADNr cu enzima de restricie Hae III s-au obinut rezultate semnificative care au permis diferenierea ntre speciile S.cerevisiae i S.bayanus (Guillamon colab., 1998). Metodologia de lucru pentru identificarea i caracterizarea tulpinilor de drojdii prin tehnica ARDRA cuprinde urmtoarele etape: 1. izolarea ADN (tehnica descris anterior) 2. determinarea concentraiei i puritii prin msurarea absorbanei la 260 nm i 280 nm 3. amplificarea ADNr cu un termocycler 12. METOD DE IDENTIFICARE RAPID A MICROORGANISMELOR - TEHNICA FISH Tehnica FISH fluorescence in situ hybridization permite identificarea microorganismelor din orice tip de probe din mediu (probe de ap sau sol). Tehnica presupune trei etape: fixarea celulelor (astfel sunt conservate moleculele de ADN sau ARN); permeabilizarea pentru a facilita accesul sondelor oligo- sau polinucleotidice la situsul int; hibridizarea ARN ribozomal cu sondele nucleotidice. Sondele pot fi marcate direct cu fluorocromi sau colorantul este introdus n urmtoarea etap de detecie a microorganismelor. Probele pot fi apoi analizate prin tehnici de microscopie cu epifluorescen, laser scanning (CLSM Confocal Laser Scaning Microscopy) sau flow cytometry. Tehnica FISH clasic se bazeaz numai pe utilizarea ARNr (n general 16S) ca int pentru sondele nucleotidice, deoarece acesta este prezent n toate celulele ntr-un numr relativ mare de copii. Deoarece ARNr este utilizat ca marker filogenetic exist numeroase baze de date legate de secvenierea acestuia necesare pentru design-ul sondelor. Pe parcursul celor douzeci de ani de cnd a fost pus la punct aceast tehnic a devenit o unealt preioas pentru microbiologi. Motivele popularitii acestei tehnici sunt evidente: FISH permite detecia i identificarea celulelor microorganismelor fr a fi necesar cultivarea lor, fapt foarte important deoarece doar 0,3% dintre bacteriile din sol i mai puin de 0,1% dintre bacteriile marine pot fi cultivate n laborator in vitro (Amann i colab., 1995); Posibilitatea detectrii celulelor in situ permite ptrunderea n interiorul structurii comunitilor microbiene i poate ajuta la identificarea lor rapid i sigur. Tehnica FISH clasic poate prezenta unele limite cum ar fi de exemplu o intensitate foarte mic a semnalului cauzat de permeabilitatea sczut a membranelor celulare sau de numrul mic de ribosomi din celul. Permeabilitatea sczut a peretelui celular mpiedic accesul sondelor n celule i ajungerea lor la situsurile int. n cazul n care semnalul emis de substanele fluorocrome cu care sunt marcate sondele de nucleotide, n urma excitrii de ctre fasciculul laserului sau radiaiei ultraviolet, are o intensitate foarte mic acestea nu pot fi detectate. Introducerea unor pretratamente enzimatice sau cu diferite substane chimice poate mri permeabilitatea pereilor celulari. Trebuie avut grij ns ca aceste tratamente s nu distrug celulele ducnd la liza lor i deci la pierderea lor. Numrul mic de ribosomi din celulele care cresc greu sau n celulele metabolic inactive din probe prelevate din mediu (ap, sol) este una din cauzele importante a semnalului slab detectat n tehnica FISH clasic n care inta este ARN ribosomal.