Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Curs nr.5
Recombinarea genetică la bacterii
CONJUGAREA BACTERIANĂ
1
Cultivate izolat, pe mediul minimal, cele doua tulpini bacteriene nu cresc (nu
formeaza colonii). In experienta propriu-zisa de conjugare, cele doua tulpini bacteriene
(cate lo8 celule din fiecare), au fost puse in contact pentru un interval, in mediul lichid si
ulterior au fost insamantate pe mediul minimal solidificat. Dupa 24 de ore se
inregistreaza aparitia coloniilor prototrofe. In experienta de control, cultivarea tulpinilor
A si B, separate, pe mediul minimal, nu genereaza aparitia coloniilor.
Toate coloniile crescute pe mediul minimal, din punct de vedere genetic sunt
prototrofe: thr+, leu+, thi+, bio+, phe+, cis+, ca si cum cele doua tulpini auxotrofe au facut
schimb de material genetic.
2
Ipoteza reversiei la prototrofie prin transformare genetica, a fost eliminata prin
experienta cultivarii celor doua tulpini triplu auxotrofe, intr-un tub in forma literei U.
Cele doua brate ale tubului sunt separate printr-o membrana poroasa, permeabila pentru
moleculele mediului de crestere, dar care nu permite trecerea celulelor dintr-un brat in
celalalt al tubului. Atata timp cat celulele celor doua tulpini sunt fizic separate, reversia
la prototrofie nu se realizeaza. Singura explicatie pentru geneza mutantelor prototrofe, in
experienta evocata, ramanea posibilitatea unui contact celular direct, argumentata si de
imagini la microscopul electronic, care sugereaza acest fapt.
Conjugarea bacteriana este un proces foarte specific prin care ADN este transferat
de la bacteria donoare la cea receptoare printr-un complex de proteine si organite care
formeaza aparatul de conjugare. O conditie importanta pentru transferul conjugativ este
asocierea intima a suprafetelor celor doua celule.
Initierea procesului de conjugare este conditionata de prezenta pililor, structuri
care se evidentiaza dupa “marcajul” cu fagii care recunosc receptori piliari: la
extremitatea libera a pililor se gasesc receptori pentru fagii filamentosi, iar pe suprafata
3
pilului, pe toata lungimea sa se leaga fagii ARN “masculi”, (de exemplu, MS 2). Flagelii
sunt structuri mai lungi si ondulate, iar fimbriile nu au receptori pentru fagi.
Dupa amestecul populatiilor de celule conjugante, in proportii corespunzatoare,
intre celule se produc contactele (coliziunile) intamplatoare, urmate de formarea unor
cupluri specifice de perechi, care la inceput sunt instabile, adica se pot dispersa printr-o
agitatie usoara.
Cuplurile instabile se formeaza prin legarea extremitatii libere a pilului de o
suprafata receptoare a celulei F-. Faza de legare instabila este urmata uneori, dupa cateva
secunde, de faza de legare stabila. Cele doua celule sunt aduse in contact direct. Aceasta
faza corespunde formarii perechilor eficiente. Asocierea celor doua celule este mult mai
rezistenta la actiunea fortelor de dispersie. In aceasta etapa are loc transferul propriu-zis
al materialului genetic, probabil prin formarea unui canal de conjugare. Cuplurile de
transfer eficient, se formeaza la circa l5 minute, de la amestecul celulelor in proportii
echivalente.
4
Fig. 2. Imaginea electrono-optica a unui posibil canal de conjugare la bacteriile
Gram pozitive. Continutul canalului este asemanator nucleoplasmei .
5
asamblat din proteinele de transfer (mi = membrana interna ; me = membrana externa)
(dupa Dreiseikelmann, 1994).
Dupa formarea cuplurilor eficiente, transferul conjugativ al ADN are loc in trei
etape:
- mobilizarea ADN pentru transfer
- transferul propriu-zis
- formarea unei plasmide functionale (cu capacitate de replicare in celula receptoare).
Etapele conjugarii se succed numai daca in celula donoare se gaseste o plasmida
conjugativa si mobilizabila. Plasmidele conjugative poarta gene ce determina formarea
perechilor eficiente, iar cele mobilizabile pregatesc ADN pentru transfer. Plasmidele
autotransmisibile (de exemplu, plasmida F) sunt atat conjugative cat si mobilizabile.
O celula poate avea doua plasmide diferite: F si Col E1. Ultima este mobilizabila,
dar neconjugativa. Intr-un cuplu de conjugare, plasmida F poate suplini incapacitatea
conjugativa a plasmidei Col E1, astfel incat aceasta va fi transferata. Procesul in care o
plasmida neconjugativa este transferata intr-un proces mediat de o plasmida conjugativa,
se numeste donatie.
O plasmida conjugativa poate sa medieze transferul unei plasmide
nemobilizabile, sau chiar al genelor cromosomale. In cuplul de conjugare F+ x F- se
transfera, cu o frecventa mica, gene cromosomale sau plasmide neconjugative.
Fenomenul se numeste conductie si defineste procesul de mobilizare pasiva a oricarui
replicon, inclusiv a cromosomului celulei F+, prin intermediul Tn l000. Conductia este
rezultatul recombinarii genetice intre cei doi repliconi, mediat de Tn l000. Treapta
intermediara a procesului de transpozitie, este o structura cointegrata, in care cele doua
copii ale transpozonului au rolul unor punti intre cei doi repliconi. Transferul ADN
cromosomal este initiat in stadiul de cointegrare a celor doi repliconi.
La nivel molecular, conjugarea si transferul ADN sunt procese complexe, reglate
de gene si proteine multiple. Genele implicate in procesul conjugarii sunt organizate intr-
un singur operon – operonul tra – organizat in circa 35 cadre de citire (ORF).
Dupa retractarea pilului si formarea canalului de conjugare, are loc mobilizarea
plasmidei F. Mobilizarea incepe in momentul in care o proteina cu functie nucleazica –
proteina Tra – codificata de plasmida, realizeaza incizia unei catene, la o secventa unica
de baze, denumita originea de transfer (ori T) si ramane legata covalent de capatul 5’P al
catenei incizate. Proteina Tra are si functie de helicaza si despiralizeaza plasmida F in
timpul transferului conjugativ. Energia necesara pentru separarea catenelor este furnizata
de hidroliza ATP.
Mecanismul transferului conjugativ este ipotetic. In acord cu unul dintre
mecanismele de transfer, incizia monocatenara declanseaza replicarea plasmidei dupa
modelul cercului simplu si ramura lineara ce rezulta din replicare este transferata.
Proteina Tra, legata la capatul 5’P are, probabil, rolul de protectie a ADN linear
monocatenar, de actiunea nucleolitica si este transferata concomitent cu ADN, in celula
receptoare. Aceiasi proteina ar avea si rol de ligaza, reunind capetele catenei lineare in
celula receptoare.
Una dintre proteinele codificate de operonul tra, care insoteste ADN in timpul
transferului, este SSB. Ea tapeteaza ADN transferat, protejandu-l de actiunea
endonucleazelor.
6
In cursul transferului, sinteza ADN se desfasoara atat in celula donoare cat si in
celula receptoare. In celula donoare, sinteza conjugativa inlocuieste catena ce se
transfera, iar in celula receptoare, sinteza conjugativa converteste ADN monocatenar
transferat, la forma dublu catenara.
Un alt model al transferului considera ca proteina Tra ramane in celula donor si
ADN trece in celula receptoare sub forma monocatenara circulara, care nu necesita
protectie fata de actiunea endonucleazelor.
In cuplul de conjugare F+- F-, genele transferate codifica factori accesorii :
rezistenta la antibiotice, UV, metale grele sau degradarea unor compusi xenobiotici.
7
transferul conjugativ sa fie instrumentul esential de lucru, pentru cartarea genetica a
cromosomului.
Din celula donoare se transfera ADN monocatenar. Concomitent cu transferul
are loc replicarea cromosomului celulei donoare, dupa modelul cercului simplu. Catena
ramasa in celula donoare are rol de matrita pentru sinteza unei noi catene. Rezulta astfel,
o copie dublu catenara a ADN transferat. Nu se cunoaste originea energiei de transfer,
care deplaseaza catena ADN din celula donoare in cea receptoare.
In cuplul Hfr x F- se transfera un mic fragment al plasmidei F, gene cromosomale
si in mod exceptional se transfera o copie completa a factorului F.
De cele mai multe ori, conjugarea se intrerupe datorita factorilor de mediu, la
intervale variabile de timp. Din aceasta cauza, in conjugare se transfera, de obicei, numai
gene cromosomale. Nu se transfera factorul F, deoarece este localizat la capatul opus al
ori T, astfel ca celula receptoare ramane F-. Factorul F se transfera numai daca durata
procesului de conjugare este de 90-l20 minute, mult mai mare decat durata unei generatii
celulare. Faptul este explicabil prin aceea ca, procesul conjugarii stopeaza cresterea si
diviziunea celulelor cuplului.
Fragmentul de material genetic transferat are dimensiuni diferite, in raport cu
durata procesului de conjugare. Celula receptoare a cuplului, dupa conjugare, este un
merozigot (un zigot partial si temporar diploid). Daca nu este degradat de enzimele de
restrictie, fragmentul de ADN primit, se poate integra in cromosom, printr-un proces de
recombinare genetica. Daca ADN exogen poarta gene noi, dupa recombinare se exprima
in celula receptoare, care astfel dobandeste caractere noi.
In general, conjugarea se realizeaza intre celulele aceleiasi specii, dar are loc si
interspecific si chiar intergeneric, dar cu o frecventa mai mica. De exemplu, E. coli
formeaza cupluri de conjugare cu celule ale propriei specii, dar si cu Salmonella sp.,
Proteus mirabilis etc.
8
Conjugarea la Streptomyces