FACULATEA DE ȘTIINȚE ALE NATURII ȘI ȘTIINȚE AGRICOLE

Specializarea: BIOLOGIE – anul III

Disciplina: GENOMICA
Responsabil disciplină: Ș.l.Dr. ANCA LEPĂDATU

Curs nr.6
Recombinarea genetică la bacterii
TRANSFORMAREA GENETICĂ

Transformarea genetică este o modalitate de transfer al informației

genetice de la bacterie donoare la una receptoare, prin intermediul unui fragment
de ADN (o fracțiune a ADN total al celulei donoare), eliberat prin mecanisme
fizice (plasmoliză), prin extracție chimică sau pe cale enzimatică.
Procesul transformării genetice s-a descris la Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus sp., Bacillus subtilis, Neisseria sp., Rhizobium sp., Salmonella sp.,
Yersinia sp., Azotobacter sp. etc. și s-a demonstrat că are loc atât intraspecific,
cât și interspecfic, și chiar între genuri diferite de bacterii.
Transformarea propriu-zisă este un eveniment rar și este rezultatul
integrării fragmentului de ADN exogen în genomul celulei receptoare prin
procesul recombinării și a exprimării fenotipice a noilor determinanți genetici pe
care îi conține.
Fenomenul transformării genetice a fost descoperit de Griffith (1928). El
studia variabilitatea caracterelor de cultură la pneumococ (Streptococcus
pneumoniae), o bacterie care se prezintă sub forma unui diplococ, capsulat sau
necapsulat. Pe baza compoziției chimice și a specificității serologice a
polizaharidelor capsulare, există circa 80 de tipuri distincte. De exemplu,
polizaharidele capsulare de tip II sunt polimeri de acid galacturonic, galactoză,
N-acetil-glucozamină și fucoză, iar cele de tip III sunt polimeri de glucoză și acid
glucuronic. Sinteza acestor polizaharide este codificată de gene diferite. Celulele
capsulate de pneumococ sunt virulente, iar cele necapsulate sunt nevirulente
(după inocularea într-un organism sensibil nu produc simptome de îmbolnăvire).
Celulele capsulate cresc pe suprafata unui mediu solidificat, sub forma unor
colonii netede (S, Smooth), iar cele necapsulate, produc colonii rugoase (R,
Rough). Prin cultivarea tulpinilor capsulate și virulente (de tip S) în prezența
serului imun specific, se obțin variante necapsulare, avirulente, care cresc sub
forma coloniilor R. Mutantele S - R apar cu o frecvență mult superioară
mutantelor R - S. Modificarea tipului de colonie se face totdeauna în cadrul
aceluiași tip biochimic de polizaharid, fără modificarea tipului serologic.
Griffith a observat că, uneori, după inocularea intraperitoneală la șoarece
a unei cantități mari de suspensie celulară a unei tulpini R, animalele mor. Din
sânge se izolează celule care, pe mediul solidificat, cresc sub forma coloniilor S,
adică sunt celule capsulate. El a dedus că, de cele mai multe ori, celulele care
formează colonii de tip R păstreaza o cantitate mică de material polizaharidic,
care se acumulează pe suprafața unor celule, inițial necapsulate. Vor rezulta

1
astfel celule capsulate, virulente, ce determină moartea animalelor de
experiență.
Pentru a-și verifica ipoteza, Griffith a inoculat un număr mic de celule vii
dintr-o tulpina R a tipului serologic II, avirulente, în amestec cu o cantitate mare
de celule ale tulpinii S de tip serologic III, omorâte prin căldură. Inoculate
separat, nici una din cele două tulpini bacteriene nu produce moartea animalelor.
Amestecul celular produce infecția mortală la șoarece, iar din sânge se izolează
pneumococi vii de tip III. Aparent, această experiență a confirmat ipoteza de
lucru a autorului: apariția pneumococilor capsulați și virulenți ar fi rezultatul
transferului polizaharidului de pe suprafața celulelor capsulate omorâte, pe
suprafața celulelor vii ale tulpinii R.
Experiențele lui Griffith au fost reluate de Avery și colab. (1944). Ei au
demonstrat că, la baza procesului de transformare genetică, stă transferul unor
determinanți genetici, prin intermediul unui fragment de ADN, care conferă
celulei receptoare capacitatea de a codfica polizaharidele capsulare. Sinteza
materialului capsular determină apariția corelativă a celorlalte particularități: tipul
coloniei (S sau R), virulentă. În același mod pot fi transferați și alți determinanți
genetici: cei care determină rezistența la un antibiotic, sau care codifică sinteza
unei enzime cu rol în metabolismul celular.
În experiențele lui Griffith, deoarece mutanta R II de pneumococ trece
într-o mutantă S III, este evident că un fragment de ADN al mutantei S III a fost
transferat și s-a exprimat în celulele mutantei R II, permițând sinteza materialului
capsular de tip serologic III și chiar activarea sintezei materialului de tip II.
Cercetările diferitelor variante serologice patogene de pneumococ au
evidențiat că virulența este o expresie cantitativă a gradului de patogenitate. În
timp ce patogenitatea este o caracteristică de specie, gradul de virulență a
bacteriilor patogene poate să varieze de la avirulent până la hipervirulent,
trecând prin trepte intermediare.
Procesul de transformare genetică a fost studiat pentru reprezentanții mai
multor genuri. Pentru ca transformarea să aibă loc, sunt necesare câteva
condiții:
- ADN transformant trebuie să aibă gr. mol. între 1-20 kDa;
- fragmentul de ADN trebuie să fie dublu catenar. ADN monocatenar nu este
incorporat în celulă, sau incorporarea este ineficientă;
- numărul celulelor transformate crește odată cu concentrația ADN în mediu,
până la nivelul de saturare (1-20 g ADN/ml cultură bacteriană competentă,
ceea ce corespunde la 100-200 fragmente de molecule de ADN/celulă);
- trebuie să existe un grad de omologie genetică între ADN transformant și o
anumită secvență a cromosomului celulei receptoare. Astfel se explică frecvența
superioară a recombinărilor genetice pentru transformările intraspecifice și
scăderea frecvenței lor, pe măsură ce se accentueaza diferențele de structură
genetică ;
- acceptarea ADN și transformarea sunt condiționate de o anumită stare
fiziologică a celulei receptoare, denumită “stare de competență”, cu o durată
variabilă.

2
 Produsele genice necesare transformarii sunt clasificate în două grupe:
a) proteinele genelor timpurii, cu rolul de a determina starea de competență;
b) proteinele târzii necesare pentru legarea, prelucrarea ADN și asamblarea
mecanismelor de translocație a ADN.
Competența definește o stare particulară de permeabilitate crescută a
structurilor suprafeței celulare, care permite legarea și înglobarea unui fragment
de ADN exogen, într-o formă rezistentă la acțiunea DN-azei.
Starea de competență limitează foarte mult frecvența procesului de
transformare, pentru că, deși ADN este adeseori disponibil (din celulele lizate
într-o cultură), transformarea este condiționată de starea fiziologică a celulelor
acceptoare.
Starea de competență poate fi naturală (fiziologică) sau artificială
(indusă). Competența naturala, la unele bacterii, este permanentă, iar la altele
este temporară.
La bacteriile Gram pozitive (B. subtilis, Str. pneumoniae), competența
naturală este temporara și este indusă de sinteza unor factori difuzibili, denumțti
factori de competență, a căror concentrație este proporțională cu densitatea
celulară (’’quorum sensing’’).
Quorum sensing este definită ca fenomenul de reglare a expresiei genice
dependent de densitatea celulară. Bacteriile își coordonează reglarea expresiei
genice, producând molecule-semnal difuzibile: aminoacizi, AMPc, oligopeptide,
dipeptide ciclice, derivați ai acizilor grași etc. Acestea se acumulează
extracelular și interacționează specific cu o moleculă receptoare, pentru a induce
modificări fiziologice, nelegate de metabolismul propriu. Moleculele semnal induc
un răspuns după ce au atins o concentrație limită.
Competența este o stare fiziologica temporară și reversibilă, se instalează
la sfârșitul fazei de creștere exponențială și este asociată cu scăderea ratei
sintezei ADN și cu sinteza unor proteine specifice localizate în membrana
citoplasmatică, care determină o stare fiziologică particulară a structurilor
suprafeței celulare.
În faza de competență, numai l0% din celulele unei populații devin
competente pentru transformare, probabil ca o consecință a unei reglări
individuale la nivel celular.
Alteori, starea de competență depinde de stări particulare ale învelișului
celular, consecință a sintezei unor proteine de membrană cu rol de receptori
pentru ADN, și a unor autolizine. S-a descris la Str. pneumoniae, B. subtilis, H.
influenzae, A. vinelandii, Neisseria sp., Pseudomonas sp., Rhizobium sp.,
Xanthomonas sp.
Bacteriile Gram negative nu sintetizează factori de competență, starea
fiind reglată prin mecanisme metabolice interne și este indusă în condiții de
deficit nutrițional, asociate cu încetinirea sau limitarea creșterii. Toate celulele
unei culturi devin competente și starea este menținută în medii care limitează
creșterea.
La Neisseria sp. și la alți gonococi, starea de competență este constitutivă
și permanentă, nefiind dependentă de stadiul culturii și nici de sinteza factorilor
de competență.

3
Competența artificială este indusă de:
- concentrațiile relativ mari de CaCl2 sau cloruri de Mg, Ba, Rb, Sr și
amestecurile lor;
- tratamentul celulelor cu agenți chelatori (EDTA);
- tratamentul cu enzime (muramidaze sau peptidaze), ce duc la formarea
sferoplaștilor sau protoplaștilor;
- fuziunea protoplaștilor cu lisosomi purtători de ADN;
- expunerea celulelor la șocuri electrice (electroporare);
- bombardarea celuleor cu particule mici ce transportă ADN în citoplasmă
(transformarea biolistică).
Celulele de B. subtilis devin competente în faza staționară, în prezența
ionilor de Mg2+ și Ca2+. De obicei, se folosesc combinații ionice de CaCl2 (30
mM) și MgCl2 (26 mM).
O metodă eficientă de inducere a stării de competență este electroporarea, ce
constă în permeabilizarea învelișurilor celulare și ușurarea înglobării ADN
exogen, sub acțiunea stimulilor electrici.

Mecanismul molecular al transformării genetice

Mecanismul molecular al transformării genetice a fost descris la B.
subtilis, Streptococcus sp., Haemophilus sp. Transformarea genetică este
produsă numai de moleculele de ADN dublu catenare, lineare, în timp ce ADN
monocatenar, ARN, hibrizii ADN-ARN sau ADN circular închis, nu sunt legate pe
suprafața celulelor competente.
Procesul transformării poate fi împărțit în trei etape:
- legarea moleculei de ADN pe suprafața celulei și fragmentarea ei;
- înglobarea (transportul ADN prin învelișurile celulei);
- stabilizarea ADN transformant, fie ca replicon autonom, fie prin recombinare
cu un replicon rezident.
Mecanismul transformării este asemănător la bacteriile Gram pozitive și la
cele Gram negative, dar există diferențe ale etapelor de legare și înglobare,
datorate diferențelor structurale majore ale peretelui celular.
Într-o prima etapă, fragmentul de ADN exogen este adsorbit reversibil,
consecință a unei interacțiuni laxe. Peretele celulelor Gram pozitive are o sarcină
netă pozitivă, iar ADN are o sarcină electrică negativă. Din această cauză,
adsorbția ADN este rapidă. Faza adsorbției reversibile durează 4-5 secunde.
Molecula de ADN poate fi îndepărtată prin spălare rapidă.
Faza de legare “strânsă” sau de adsorbție ireversibilă, corespunde
ancorării ferme a moleculei de ADN, la câteva situsuri din cele circa 50 ale
celulei receptoare.
La B. subtilis, în legarea ADN exogen este implicată o proteină complexă
de 75 kD, asociată membranei, sintetizată sub acțiunea factorului de
competență. Proteina de legare este formată din două polipeptide echivalente ca
mărime, una dintre ele având activitate endonucleazică. Deoarece are rol decisiv
în transportul ADN exogen în celulă, a fost denumită translocaza.

4
 Ambele faze ale legării sunt nespecifice, deoarece celulele de B. subtilis
pot să lege fragmente de ADN de proveniență străină (de exemplu, ADN de
mamifer).
Transportul ADN prin învelișul celular (înglobarea) este puțin înțeles.
Pătrunderea ADN exogen în celula receptoare se face sub forma monocatenară.
Studiile experimentale cu molecule marcate radioactiv au evidențiat o
înjumătățire a radioactivității în interiorul celulei, ceea ce sugerează că
transportul ADN se face sub forma monocatenară. În timpul transportului, catena
complementară este degradată complet. Înglobarea implica incizia unei catene a
ADN exogen, la sau lângă situsurile de legare la membrană, în prezența ionilor
bivalenți (Mg2+, Ca2+) și este catalizată de nucleaza din complexul de 75 kDal.
Urmează incizii succesive monocatenare, astfel încât una dintre catenele de
ADN exogen este degradată complet.

Fig. 1. Modelul molecular al transformarii genice la bacteriile Gram

pozitive.
Canalul transmembranar este (probabil) format de proteinele de competență. În
timpul trecerii prin membrana citoplasmatică, o catenă a ADN dublu catenar
exogen este degradată de o endonuclează asociată membranei
(după Dreiseikelmann, 1994).

Înglobarea ADN monocatenar în celula receptoare pare a fi rezultatul

acțiunii endonucleazei. Transportul se face, probabil, printr-un canal membranar,
format prin modificarea conformației spațiale a nucleazei. La B. subtilis,
înglobarea ADN necesită forța proton-motrice și nu hidroliza ATP.
ADN monocatenar este protejat de acțiunea nucleazelor în timpul
transportului, prin formarea unui complex cu o proteină specifică de legare,
sintetizată în intervalul de competență.
La bacteriile Gram negative (Haemophilus sp., Neisseria gonorrhoeae),
ADN exogen este legat și transportat în transformasomi (vezicule membranare
de transport) cu diametrul de 20 nm, alcătuiți în special din componentele
membranei externe. În transformasom, ADN este protejat de acțiunea DN-azei
exogene și de endonucleazele celulare de restricție.
La ieșirea din vezicula de transport, o catenă a ADN exogen este
degradată complet.

5
 ADN înglobat de celulele competente, poate fi izolat sub forma
fragmentelor monocatenare de circa l0 kb.
Moleculele suprahelicale și chiar unele relaxate nu sunt transportate în
citoplasmă. Structura spiralizată a plasmidelor sau absența capetelor libere
impiedică translocația ADN din transformasom în citoplasmă. Astfel se explică
eficiența scăzută a transformării cu ADN plasmidial.
Stabilizarea ADN monocatenar transformant este consecința unui proces
de integrare prin recombinare. ADN monocatenar este protejat de acțiunea
nucleazelor de o proteină specifică sintetizată în faza de competență, proteina
SSB (Single Strand Binding).
Integrarea ADN monocatenar exogen în cromosomul celulei receptoare,
este catalizată de enzime și este dependentă de proteina Rec A* (produsul genei
rec A), printr-un proces de recombinare. Rezultatul final al recombinării este o
moleculă hibridă (heteroduplex). Fragmentul de ADN monocatenar exogen se
aliniază, pe baza complementărității bazelor, cu o regiune omologă a
cromosomului. Se formează un complex ADN exogen-ADN receptor.
Recombinarea propriu-zisă are loc prin deplasarea fizică și înlocuirea uneia
dintre catenele ADN receptor. Deplasarea catenei este însoțită concomitent de
degradarea ei și a altor molecule de ADN exogen transformant. Dacă ADN
exogen nu are omologie cu ADN cromosomal, ADN exogen este degradat
complet.
Activitatea enzimatică unică a proteinei Rec A constă în împerecherea
moleculelor omologe de ADN, atât monocatenare, cât și dublu catenare și
favorizarea schimbului reciproc al catenelor de ADN între moleculele omologe.
Schimbul genetic implică, suplimentar, activitatea altor enzime: ADN-helicaze,
DN-aze, ATP-aze, topoizomeraze, ADN-polimeraza și ADN-ligaza.
Proteina Rec A este o ATP-ază, dependentă de ADN. In vitro, proteina Rec A
favorizează formarea perechilor omologe între moleculele de ADN adecvate.
Dacă nu sunt constrângeri topologice care să împiedice formarea
heteroduplexului, va rezulta o legare plectonemică a moleculelor (catenele sunt
legate într-un ADN dublu catenar). Dacă sunt constrângeri topologice (cele 2
catene pot fi circulare) se vor forma perechi paranemice (se formează perechi de
baze, dar catenele nu sunt topologic iîmperecheate).
Pentru toate reacțiile omologe de împerechere, catalizate de Rec A, este
necesar ADN monocatenar. Pentru complexele paranemice, ADN mc este
esențial. Necesitatea ADN mc în procesele de împerechere dependente de
proteina Rec A, explică necesitatea acțiunii helicazelor și nucleazelor în
recombinarea genetică. Helicazele produc ADN mc prin despiralizarea ADN dc.
Nucleazele produc ADN mc prin degradarea unei catene a ADN dc.
Reacția de schimb între ADN cromosomal și ADN exogen este
condiționată de proteina Rec A. Acțiunea proteinei Rec A constă în alinierea
celor două molecule de ADN, pe baza complementarității nucleotidelor, într-o
reacție dependentă de ATP. Alinierea este urmată imediat de formarea “buclei
D”, în care ADN monocatenar invadează ADN dublu catenar rezident.

6
Recombinarea parcurge următoarele trei etape:
l. Polimerizarea proteinei Rec A pe molecula de ADN monocatenar. In vitro,
proteina Rec A și ADN monocatenar formează un filament nucleoproteic
evidențiat la microscopul electronic.
2. Sinapsa. În prezența ATP, nucleoproteina formează un complex cu ADN
cromosomal. Interacțiunea inițială nu se produce între secvențele de bazele
omologe. Cele două molecule de ADN se deplasează una față de alta, astfel
încât secvențele omologe vin în contact direct și se aliniază pe baza omologiei
nucleotidelor.
3. Schimbul postsinaptic. Catenele omologe, aliniate dar neîmperecheate, se
leagă instabil. Proteina Rec A deplasează o catenă a moleculei dublu catenare și
catalizează integrarea catenei exogene, cu consum de energie, furnizată prin
hidroliza ATP. Proteina Rec A are acțiune de helicază și produce despiralizarea
ADN dublu catenar. Integrarea ADN este polarizată în direcția 5’ ---- 3’.

Fig. 2. Etapele procesului de recombinare a secvențelor omologe,

dependentă de proteina Rec A.

La Str. pneumoniae, rolul proteinei Rec A pare a fi indeplinit de SSB.

Catena înlocuită este secționată. Nucleazele secționează capetele libere ale
ADN exogen și endogen, iar ligaza repară inciziile. Se formează un

7
heteroduplex, în care unele baze sunt împerecheate greșit. Rezultatul
recombinării, adică menținerea sau eliminarea ADN exogen în genomul celulelor
progene, depinde de repararea împerecherilor greșite.
Unii markeri transformă celulele cu o eficiență foarte înaltă. Împerecherile
de baze greșite ori sunt corectate eficient și aduse la nivelul secvenței de baze a
ADN exogen, ori corectarea este nesemnificativă. Pentru markerii care au
eficiența transformantă scăzută, mecanismele de reparare a bazelor
împerecheate greșit sunt foarte active. Sunt îndepărtate bazele ADN exogen și
celula păstrează fenotipul conferit de ADN propriu. Dovada pentru validitatea
acestei concluzii a fost adusă de izolarea mutantelor defective pentru repararea
bazelor împerecheate greșit. La aceste mutante, toți markerii de transformare au
eficiența foarte înaltă.
Fenomenul recombinării este rar, având loc în circa 1% din totalul
evenimentelor de înglobare a ADN exogen. De cele mai multe ori, ADN exogen
nu se poate recombina datorită fenomenului de restricție, un adevarat mecanism
de imunitate moleculară, prin care ADN străin este recunoscut și eliminat.
Există două tipuri de ADN, care după înglobarea în celula competentă, nu
necesită integrarea: ADN plasmidial și fagic. Neavând omologie a bazelor față
de ADN cromosomal, nu se integrează, ci rămân ca repliconi în stare fizic
autonomă.
Studiile de transformare s-au făcut cu ADN cromosomal, pentru markerii
de prototrofie, și cu ADN plasmidial pentru markerii de rezistență la antibiotice.
Se înregistrează apariția coloniilor prototrofe și respectiv a celor rezistente la
antibiotice, pe mediile adecvate. Transformarea cu ADN fagic se înregistrează
sub forma plajelor de liză pe o pânză de celule sensibile și nu depinde de
prezența secvențelor de baze omologe. Este o transformare independentă de
capacitatea celulei de a face recombinare omologă.
Transformarea cu ADN plasmidial sau fagic are loc cu o frecvență foarte
mică și necesită cooperarea unui mare număr de copii moleculare, echivalent la
circa l0 000 echivalenți ai genomului fagic și l000-l0 000 molecule de ADN
plasmidial, pentru un eveniment de transformare.
Dimensiunea medie a ADN integrat în celulele de B. subtilis s-a estimat la
8-l0 kb. Fiecare celulă poate integra l0 molecule de 8-l0 kb fiecare, ceea ce
corepunde la circa l00 de gene de dimensiuni medii.
Transformarea genetică, descoperită în laborator, este un fenomen care
se desfașoară cu mare probabilitate și în condiții naturale, în mediile în care se
realizează populații bacteriene foarte dense și unde au loc procese de liză
celulară, prin care se eliberează fragmente de ADN: liza fiziologică, liza fagică
sau sub acțiunea substanțelor antibiotice. Fragmentele de ADN sunt preluate de
alte celule prin mecanismul transformării, asigurând o variabilitate genetică cu o
frecvență semnificativă.
Funcțiile înglobării ADN:
- variația proprietăților antigenice (de exemplu, ale pilinei) este o strategie
pentru invazia bacteriilor patogene;
- protecția celulelor față de fagi;

8
- înglobarea ADN ca o cale de dobândire a nutrienților. Produsele rezultate din
degradarea ADN heterolog rămân disponibile metabolismului celular și sunt
folosite ca precursori ai sintezei ADN, sau ca sursă de C, N și P;
- repararea ADN: ADN exogen homolog ar putea fi folosit pentru repararea prin
recombinare a leziunilor ADN cromosomal al receptorului, induse de stresul
genotoxic. Ipoteza presupune, implicit, că celulele competente
supraviețuiesc mai bine decât cele necompetente.