FACULATEA DE ȘTIINȚE ALE NATURII ȘI ȘTIINȚE AGRICOLE

Specializarea: BIOLOGIE – anul III

Disciplina: GENOMICA
Responsabil disciplină: Ș.l.Dr. ANCA LEPĂDATU

LP nr.2
Tehnici de genetică bacteriană
IZOLAREA, PURIFICAREA ŞI EVIDENŢIEREA ADN GENOMIC LA BACTERII
PRINTR-UN PROTOCOL DERIVAT DIN TEHNICA JOHNSON (1991).

Notă
Toate protocoalele de izolare, purificare şi manipulare a materialului genetic sunt prezentate în
varianta de tip minimetodă: se lucrează în tuburi tip Eppendorf (Eppi) cu capacitate de 1.5 ml, iar
o
centrifugările se fac în microcentrifugi, de regulă cu sistem de răcire (+4 C).

Indiferent de protocolul aplicat, tulpinile bacteriene se cultivă în mediu de cultură lichid Luria-
o
Bertani (sau în alt mediu adecvat pentru tulpina respectivă), la 37 C (sau la temperatura optimă
pentru tulpina respectivă) timp de 36h, până la atingerea fazei staţionare de creştere. La majoritatea
speciilor bacteriene este preferabil să se procedeze la o cultivare agitată, orbitală sau magnetică.

Izolarea şi purificarea ADN genomic

1. Obţinerea sedimentului celular. Din cultura bacteriană se pun 1.5 ml într-un tub tip Eppendorf şi
se centrifughează 10 min la 8000 rpm (celulele vor sedimenta); pentru obţinerea unei cantităţi
suficiente de ADN se recomandă ca sedimentul celular să aibă un volum echivalent cu 25-30 μl.

2. Distrugerea peretelui celular. Se aruncă supernatantul, iar celulele din sediment se resuspendă în
500 μl soluţia I (TEG + lizozim); resuspendarea celulelor se face cu ajutorul vârfului pipetei
o o
automate, apoi tuburile se vortexează; celulele resuspendate în soluţia I se lasă 15 min la 20 - 30 C.
Notă
Este important ca soluţia I să aibă un pH de minimum 8.0, pentru că lizozimul nu are activitate la
pH<8. Lizozimul este un complex enzimatic extras din albuş de ou şi are rolul de a sparge peretele
celular, atât la marea majoritate a bacteriilor Gram-negative, cât şi la unele specii de Gram-
pozitive. Există însă şi bacterii al căror perete celular este insensibil la acţiunea lizozimului (de ex.
bacteriile din genul Staphylococcus).
Lizozimul sparge doar peretele celular, nu şi membrana celulară, şi ca urmare, liza celulară nu este
completă. Glucoza din soluţia I are rol de stabilizator osmotic, astfel încât protoplaştii/sferoplaştii
să nu se spargă imediat.

3. Liza celulară totală. Se adaugă 25 μl soluţie SDS 20%, astfel încât concentraţia finală să fie 1%.
SDS (sodiumdodecilsulfat) este un detergent, având ca atare capacitatea de a liza membrana celulară.
Liza celulară completă se verifică astfel: până la adăugarea SDS, suspensia bacteriană are un aspect
lăptos, opac; după liza celulară, soluţia se clarifică şi este foarte vâscoasă.
o
4. Deproteinizare enzimatică. Lizatul celular se tratează 1h la 37 C cu pronază E în concentraţie
finală de 50 μg/ml (se adaugă 1.5 μl din soluţie stoc de pronază E ce are concentraţia de 20 mg/ml);
Pronaza E este o protează nespecifică ce digeră proteinele din lizatul celular.

5. Precipitarea proteinelor cu soluţie salină. Se adaugă 20 μl soluţie KCl 2.5 M (precipită

o
proteine). Precipitatul este sedimentat prin centrifugare 20 min la 12000 rpm 4 C (sedimentul =

1
proteine precipitate, resturi de perete celular, de membrane celulare), iar supernatantul se transferă
în alt tub Eppi.

6. Deproteinizare cu solvenţi organici. Peste supernatant se adaugă un volum egal de amestec

cloroform:alcool izoamilic (24:1, v/v); cele 2 lichide (lizatul celular, ca soluţie apoasă, şi solventul
organic) se amestecă la temperatura camerei timp de 5-10 min, prin inversarea viguroasă a tubului.
Pentru separarea rapidă a celor 2 lichide, tuburile se centrifughează 7 min la 7000 rpm. Faza apoasă
(superioară) se transferă în alt Eppi cu o pipetă automată, fără a intra în interfaţă.

7. Precipitarea acizilor nucleici. Tubul Eppi se umple până la semnul de 1.5 ml cu alcool
o
isopropilic aflat la temperatura camerei (20 C), se inversează tubul de câteva ori şi se ţine 10 min la
o
temperatura camerei; precipitatul este sedimentat prin centrifugare 10-15 min la 15000 rpm. 4 C. Se
aruncă supernatantul prin inversarea tubului, iar ultimele picături se aspiră cu o pipetă automată (cu
cât deproteinizarea este mai înaltă, cu atât sedimentul ADN este mai incolor şi transparent).
o
Sedimentul se usucă 15 min pe baie de apă (sau termostat) la 37 C. Sedimentul ADN se resuspendă
în 20-40 μl tampon TE pH 8.0.

8. Indepărtarea moleculelor de ARN din extract. La extractul ADN se adaugă soluţie stoc de
RNază A (soluţia stoc are concentraţia de 10 mg/ml) pentru a ajunge la o concentraţie finală de 100-
o
200 μg/ml. Tuburile se ţin 1h pe baie de apă la 37 C.
Se repetă etapele 6 şi 7.
o
Facultativ : sedimentul ADN se spală cu etanol 70% rece (-20 C) sau cu amestec de etanol 70% -
o
acetat de amoniu 7.5 M rece (-20 C), ce se toarnă încet pe pereţii tubului pentru a nu disloca
o
sedimentul; se inversează tubul de câteva ori; se centrifughează 10-15 min la 15000 rpm 4 C şi se
aruncă etanolul.

9. Dizolvarea sedimentului ADN: sedimentul ADN se usucă 20-30 min pe baie de apă (sau
o
termostat) la 37 C (tuburile Eppi se pun pe baia de apă cu capacele desfăcute, iar baia de apă se lasă
descoperită); sedimentul se resuspendă în 20-40 μl tampon TE pH 8.0 (funcţie de concentraţia
o
asteptată şi de necesităţi). Tuburile se ţin aproximativ 10 h la frigider 4 C (pentru dizolvarea
o
completă a ADN), apoi se stochează la –20 C.

Medii şi soluţii
• Mediul de cultură Luria-Bertani: bacto-triptonă 1%, extract drojdie 0.5%, NaCl 1% pH 7.5
• Soluţia I = TEG + lizozim = Tris 25 mM, EDTA 10 mM, glucoză 50 mM pH 8.2-8.7
lizozimul se adaugă în concentraţie variabilă, funcţie de structura peretelui bacterian al tulpinii
analizate (în general, pentru tulpinile de E.coli este suficientă concentraţia de 2-5 mg/ml)
lizozimul se adaugă numai înainte de folosire şi doar în volumul de TEG ce va fi utilizat în ziua
respectivă (este recomandabil să nu se stocheze ca soluţie nici măcar la congelator).
• SDS 20%, g/v, în a.d.
• KCl 2.5 M, în a.d.
• soluţie stoc de pronază E: 20 mg/ml în a.d. sterilă. Se prepară 100-200 μl soluţie într-un
Eppi mic (de capacitate 0.5 ml) steril, se porţionează în porţii de câte 10-20 μl în tuburi Eppi
o
mici sterile şi se stochează la –20 C. In funcţie de numărul de tulpini luate în lucru se scot din
congelator una sau mai multe porţii care, odată dezgheţate, se folosesc imediat. Prin
recongelare, enzimele îşi pierd activitatea.
• soluţie stoc de proteinază K: 20 mg/ml în a.d. sterilă. Se prepară, se porţionează similar şi se
stochează la fel ca soluţia de pronază E.
• soluţie stoc de RNază A: 10 mg/ml în a.d. sterilă.
De obicei, se prepară un volum mic (0.5-1 ml) de soluţie stoc de RNazăA, astfel: într-un Eppi de 1.5
ml steril se pune 0.5-1 ml a.d.s. şi se adaugă o cantitate de RNazăA pentru a obtine o concentraţie de
2
10 mg/ml. Se agită pentru dizolvare. La marea majoritate a preparatelor de RNazăA comercializate
nu este necesară fierberea soluţiei. După dizolvare, soluţia se porţionează (în porţii de 10-50 μl) în
o
tuburi Eppi mici (de 0.5 ml). Porţiile se pun în congelator (la –20 C). Când este necesar, se scoate din
congelator o porţie, se decongelează rapid şi se foloseşte. Deşi RNazaA este o enzimă extrem de
stabilă, totuşi îşi pierde semnificativ din activitate după 3 congelări (ca atare, o poie se poate repune o
singură dată înapoi în congelator).
• amestec cloroform:alcool isoamilic 24:1 v/v - se prepară extemporaneu
• isopropanol
o
• etanol 70% rece (-20 C)
• tampon TE: Tris 10 mM , EDTA 1 mM (pH 8)