FACULATEA DE ȘTIINȚE ALE NATURII ȘI ȘTIINȚE AGRICOLE

Specializarea: BIOLOGIE – anul III

Disciplina: GENOMICA
Responsabil disciplină: Ș.l.Dr. ANCA LEPĂDATU

LP nr.5
Tehnici de genetică bacteriană
ELECTROFOREZA ADN ÎN GEL DE AGAROZĂ

Principiul metodei
La un pH neutru sau alcalin, acizii nucleici au sarcină electrică negativă (-).
Dacă sunt plasaţi într-un câmp electric, moleculele de acizi nucleici vor migra la anod
(+).
Soluţii şi reactivi
Tampon TBE:
- Tris-HCl 0,09 M;
- acid boric 0,09 M;
- EDTA-Na2 1,25 mM;
- pH 8,35.
Agaroză 1% (în tampon TBE).
Bromură de etidium
Soluţie BFF (albastru de bromfenol 0,4%, ficoll 55% în tampon TBE).

Tehnica
Electroforeza în gel de agaroză (Aaij şi Borst, 1972; Boffey, 1983; Sambrook
şi colab., 1989; tehnica AG EL-75, Pharmacia, SUA) constituie o metodă eficientă
pentru separarea, purificarea şi identificarea moleculelor de ADN.
Gelul de agaroză 1% se prepară prin suspendarea unui gram de agaroză
(Sigma) în 100 mL tampon TBE şi dizolvarea prin încălzire la 100 0C. Soluţia răcită la
500C se toarnă între plăcile de de sticlă (10 x 15 cm) cu o pipetă Pasteur şi este
lăsată să se răcească la temperatura camerei. Plăcile sunt prevăzute de jur împrejur
cu baghete de plastic pentru a preveni pierderea gelurilor. După solidificarea şi
maturarea agarozei (aproximativ 5 ore la temperatura camerei), cu ajutorul unui
pieptăne se îndepărtează câţiva mm de la partea superioară a gelului în scopul
asigurării unei suprafeţe uniforme pentru proba care urmează a fi supusă
electroforezei. Plăcile de sticlă ce conţin gelul de agaroză se introduc în aparatul de
electroforeză, ale cărui cuve au fost umplute cu tampon TBE, şi sunt supuse unui
potenţial de premigrare (3 mA/tub) timp de 30 minute. Pe fiecare gel se aplică 20 L
probă (5 – 20 g ADN) pregătită în prealabil prin adăugarea de soluţie BPP (Brom
Phenol Phicol) ¼ din volumul probei (ficolul – alcool gras - creşte densitatea probei,
iar albastru de bromfenol este folosit ca marker de migrare). Electroforeza se
realizează la temperatura camerei (220C - 250C), la un potenţial constant de migrare
de 2 mA/tub, timp de două ore. Sensul de deplasare a moleculelor de ADN spre
anod se datorează grupărilor fosfat care dau încărcătura negativă moleculei de ADN.
După perioada de timp afectată migrării probelor de AND, gelul este scos
dintre plăcile de sticlă şi introdus într-o soluţie de bromură de etidium, pentru
colorarea benzilor de ADN, timp de 30 minute. ! Atenție: Bromura de etidiu este un
puternic agent mutagen, deci se lucrează cu protecție (mănuși, nișă). Utilizând un
transiluminator (lampă UV), gelurile sunt vizualizate, după care pot fi fotografiate în

1
lumină UV ( = 302 nm) cu un aparat de fotografiat prevăzut cu filtru roşu. Înainte de
fotografiere gelurile sunt spălate de două ori câte 8 ore în tampon TBE.