Modific ri alepluripoten ei celulelor steminduse de mediul de cultur

Dezvoltarea se consider ca apare prin modific risecven iale discrete ce apar n celulele stem progenitoare. Aceste schimb ri sunt asociate cu o pierdere a poten ialului de linie n vederea unei cre teri a gradului de specificitate pn se ajunge la o celul diferen iata; dar de-a lungul anilor a devenit evident c aceste schimb ri n soarta celular sunt orchestrate de mecanisme epigenetice care duc la o inactivare a genelor asociate pluripoten ei i la o activare a genelor ce determin diferen ierea celulei. n 1957 Waddington sugera c , diferen ierea celular este un proces unidirec ional, dar nu dup mult timp, au ap rut dovezi ce contraziceau aceast ipotez i demonstrau

reversibilitatea procesului de diferen iere celular ; astfeln 1958 Gurdon a demonstrat c transferul de nuclei din celule epiteliale intestinale de la mormoloci albino i n ovocites lbatice nefecundaterezult n dezvoltarea de broa te albinoase adulte; aceea i tehnic , numit transfer nuclear de celule somatice , a fost folosit i pentru a ob ine oaia Dolly i multe alte specii.

Natura factorilor prezen i n ovulele nefecundate capabili s remodeleze peisajul epigenetic al unei celule complet diferen iate la cel caracteristic unei celule pluripotente r mne ns neelucidat . n afara ovocitelor, celulele germinale embrionare i celulele stem embrionare prezint i ele factori ce pot reprograma nucleii celulelor somatice astfel nct fuziunea acestor

celule cu celule somatice determin formarea de hibrizi tetraploizi n care apar procese de activare i inactivare a genelor de pe cromosomii somatici. Domeniul reprogram rii celulare a f cut un mare pas nainte n anul 2006, cnd Takahashi i Yamanaka au demonstrat c transferul retroviral al doar patru factori de transcrip ie (Oct4, Sox2, Klf4 si c-Myc) a determinat transformarea celulelor somatice murine n celule similare celulelor stem embrionare, celulele astfel ob inute au fost numite celule stem pluripotente induse. ncepnd de la aceast reu it

numeroase tipuri celulare cu un grad diferit de maturizare au fost reprogramate la stagiul de celule pluripotente printr-o combina ie similar de factori demonstrnd universalitatea acestui proces. n urm torii patru ani rolul i nevoia pentru diferi i factori de transcrip ie a fost tot mai mult elucidat i noi tehnici au fost elaborate pentru a genera celule stem pluripotente induse f r integrare vectori. Cu toate c este clar c factorii de reprogramare trebuie s modifice mecanismele epigenetice ce men in statusul diferen iat al celulelor, mai este o lung cale pn cnd s n elegem toate schimb rile epigenetice ce sunt necesare pentru o reprogramare celulara complet . De i o dediferen iere complet celul pluripotent necesit de la o celul somatic la o

introducerea unuia sau mai multori factori de transcrip ie,

exist dovezi a unor reprogram ri celulare ce pot fi realizate doar prin manipul ri ale micromediului de cultur . Faptul c micro-mediul de cultur poate afecta peisajul epigenetic al celulelor stem embrionare i al celulelor stem pluripotente induse a c tigat tot mai multa aten ie. Ob inerea de celule stem embrionare din masa celular intern necesit o form de reprogramare

epigenetic astfel nct genele care determin un avantaj de cre tere s fie stimulate iar genele neesen iale pentru cultura in vitro s fie inactivate. Studiile recente au demonstrat c anumite condi ii specifice de cultur pot s modifice reversibil celulele stem epiblastice sau celule

primitive ectodermale n celule asem n toare celulelor stem embrionare din masa celular intern f r interven ia factorilor specifici ce produc modific ri epigenetice sau modific ri de semnalizare celular .Hayashi a demonstrat c culturile de celulele stem embrionare de soarece sunt heterogene i c pot adopta ntr-o manier reversibil aspectul de cultur de celule epiblastice. De i conversia unor celule cu caracteristici asem n toare celulelor din masa celular intern n celule epiblastice abia eviden iaz o evolu ie celular de-a lungul unui traseu mo tenit genetic, conversia celulelor dintr-un stadiu epiblastic la unul similar celulelor din masa celular interna(IMC-like) reflect o dediferen iere c tre un stagiu de dezvoltare mai imatur. Aceast interconversiune este influen at de factori de mediu ca i men inerea de celule IMClikeStella pozitive f r fibrobla ti embrionari de soareciceea ce conduce la blocarea celulelor ntr-o stare de celule epiblastic-likeStella negative, blocare ce poate fi ndep rtat prin

reimplantarea celulelor n medii ce con in fibrobla ti embrionari. Consistent cu pierderea i

c tigul expresiei genei Stella acompaniat de schimb ri n acetilarea histonelordar nu i n metilarea ADN la nivelul locusuluiStella, ad ugarea de trichostatin A, un inhibitor al

deacetilazeihistonelor, converte te reversibil celulele la un stadiu Stella pozitiv IMC-like. Aceste experimente demonstreaz clar c manipularea micro-mediului de cultur duce la o involu ie c tre un stadiu mai primitiv. Celulele stem adulte au un poten ial de diferen iere mai restric ionat dect celulele stem embrionare i celulele stem pluripotente induse. n ultima decad o serie de studii reportat o nea teptat de mare poten a culturilor de celule stem postnatale. Ini ial se credea

c aceste celule nu s-au format prin procese de reprogramare celular deoarece nici un manipulator major nu a fost necesar pentru a ob ine celule cu poten diferit fa de popula ia

din care au fost izolate. Prin urmare, s-a elaborat teoria conform c reia aceste celule stem cu o poten mai crescut au fost selectate n cultur din celule progenitoarespecifice existente la

nivelul esutului, ns incapacitatea de a izola celule cu un grad att de crescut de poten direct din esutul somatic din care provin mpreun cu dovezile recente c reprogramarea poate fi ob inut prin factori bine defini i, a schimbat perspectiva, devenind din ce n ce mai clar faptul ca micro-mediul de cultur n care sunt men inute celulele stem postnatale, poate afecta soarta acestora i s determine dediferen ierea n unele cazuri pn la celule cu o poten similar celulelor stem embrionare. n 2004 Kanatsu-Shinohara a raportat pentru prima dat faptul c atunci cnd celulele

stem germinale din testicolul de oarece nou n scut sunt cultivate n prezen a factorului de cre tere neurotrofic derivat din celule gliale, factorului de cre tere fibroblastic 2, factorului de cre tere epidermal i LIF apar ocazional colonii cu morfologie caracteristic celulelor stem

embrionare la 4-7 s pt mni de la ini ierea culturii. Aceste colonii au putut fi men inute viabile folosind condi ii de cultur caracteristice celulelor stem embrionare multipotente i au fost numite celule stem germinale multipotente. Eficien a gener rii de celule stem germinale multipotente a fost semnificant m rit la utilizarea de oareci cu gena p53 inactivat ; aceasta a fost f cuta n urma observa iilor ob inute la reprogramarea celulelor adulte n celule stem pluripotente induse care este stimulat la folosirea de celule cu gena p53 inactivat i este

inhibat la activarea genei. Mai mult, celulele stem germinale multipotente i pierd poten ialul spermatogonial, la compararea celulelor stem germinale multipotente cu celule stem germinale acestea au suferit o tergere par ial a tiparului androgenic tipic. n anul 2008 Kanatsu-Shinohara demonstreaz c o singur celul derivat testicular poate genera att celule stem germinale ct i celule multipotente germinale, dovedind astfel c o celul angajat pe o singur linie celular poate s revin la un stadiu pluripotent, ns eficien a acestor dediferen ieri spontane era sc zut . n 2009 Ko demonstreaz c celulele stem

germinale unipotente din testicolul adult dup 3-4 s pt mni ntr-un micro-mediu de cultur specific dau na tere la colonii de celule ESC-like ce puteau fi inute n via n condi ii

caracteristice celulelor embrionare.n 2008 Conrad a descris ob inerea de celule cu propriet i asem n toare celulelor su e embrionare din celule derivate din testicolul uman. Celulele adulte din testicul au fost cultivate 4 zile n mediu knockout i GDNF, urmat de o preselec ie cu CD49f i o selec ie a matricii cu laminin ; dup 21-28 de zile celule stem germinale adulte apar n cultur . Ca i celulele stem embrionare, celulele stem germinale adulte umane (haGSC) exprim proteinele SSEA4, TRA1-60, TRA1-81, OCT4, NANOG i proteina SOX2 formnd corpi embrioizi i teratoame. Cu toate acestea studiile au ar tat c expresia genelor OCT4, NANOG i SOX2 a fost semnificant mai mic la haGSC dect n hESC datorit faptului c regiunile promotorii ale OCT4 i NANOG au fost doar par ial demetilate n haGSC. Deoarece demetilarea acestor promotori este un criteriu important al pluripoten ei celulare se poate trage concluzia c celulele haGSC au ob inut doar un stadiu de reprogramare par ial .Toate aceste studii sugereaz c celulele stem germinale din testiculele de oarece pot fi convertite n celule ESC-like f r introducerea de factori de reprogramare exogeni ci prin cultivarea celulelor n condi ii in vitro specifice, ns cu p strarea unor diferen e transcriptionale fa complet a markerilor epigenetici androgeni. De i se credea c dezvoltarea survine prin modific ri secven iale ireversibile ale celulelor stem rezultnd n pierderea poten ialului de linie i c tigarea de specificitate spre stadiul de celule mature complet diferen iate, devine din ce n ce mai clar c dediferen ierea se poate produce. Numeroase studii au demonstrat c dediferen ierea poate fi ob inut prin transfer de de celulele stem embrionare i f r inactivarea

nuclei de celule somatice sau factori de transcrip ie i n plus fa

de aceste metode exist tot

mai multe dovezi ale dediferen ierii celulare induse de modific ri ale micromediului de cultur n care sunt crescute celulele, ns mecanismele epigenetice implicate n aceste schimb ri necesit n continuare aten ie pentru a le putea n elege pe deplin.

Bibliografie: 1. Meissner A. Epigenetic modifications in pluripotentanddifferentiatedcells. Nat Biotechnol 2010; 28: 1079 1088. PubMed, Web of Science 2. Waddington CH. The strategy of thegenes. A discussion of someaspects of theoreticalbiology. London: Allen andUnwin, 1957 3. Gurdon JB, Elsdale TR, Fischberg M. Sexually mature individuals of Xenopuslaevisfromthetransplantation of single somatic nuclei. Nature 1958; 182: 64 65. 4. Yamanaka S, Blau HM. Nuclear reprogrammingto a pluripotent state bythreeapproaches. Nature 2010; 465: 704 712. PubMed, Web of Science 5. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.v29.4/issuetoc

Modific ri ale pluripoten ei celulelor stem induse de mediul de cultur

Universitatea de Medicin

i Farmacie Iuliu Ha ieganu Cluj Napoca

Havasi Andrei Dan

Facultatea de Medicina Generala An2 Seria 2 Grupa 11
10.06.2011