Apoptoza n embrionul uman preimplantaional R Levy et J.-F.

Guerin Au fost efectuate puine studii n ceea ce privete apoptoza la stadiile precoce de dezvoltare a embrionului uman. nc din 1989, Hardy i alii au observant semne de condensare i de fragmentare a cromatinei n blastomere. Mai recent , Jurisicova .a. 1996, au analizat prin tehnica TUNEL, a crui obiectiv este fragmentarea ADN-ului, embrionii stopai n dezvoltare i fragmentai, observndu-se o marc pozitiv n 35% din cazuri. Corpii apoptotici formai nu snt fagoicitai de blastomerii intaci , ns acetia se gsesc n spaiul intercellular, la contactul cu zona pelucid. Unii autori au naintat ipoteza precum c fragmentarea embrionilor este o consecin a activrii fenomenului de apoptoz n unele blastomere. Aceste observaii au fost confirmate prin studiile lui (Levy et al, 1998), care au folosit mai muli marker ai apotozei: unul
tardiv- tehnica TUNEL altul precoce :Annexine V, executate la microscopie confocal. Embrionii folosii n cercetare proveneau de la cuplurile, care au dat acordul, din diverse, motive: fragmentare evident (gradul III-IV), blocaj n sistem prelungit de cultivare. Printre embrionii care prezentau un grad nalt de fragmentare, au fost pui n eviden pn la 60% de blastomere multinucleate, n cei cu 2-4 celule i pn la 89% pentru cei ce aveau mai mult de 6 celule. Nucleile blastomerelor multinucleate aveau talia egal cu cele observate n celulele mononucleate. Fragmentarea materialului nuclear n forma unor pachete mici a fost observat n 35% din embrionii cu 2-4 celule i 41% n cei cu 6 celule i mai mult. Majoritatea embrionilor fragmentai sau oprii n dezvoltare, au demonstrat o condensare a cromatinei sau fragmentarea materialului nuclear, care evoc fenomenul apotozei: cromatin dispus n agregate pe suprafaa intern a membranei nucleare, nucleu fragmentat sub forma unei grmezi de cromatin. Anexin V se fixeaz pe restul de fosfatidil serin, localizndu-se pe suprafaa intern a membrane plasmatice a unei celule sntoase, ulterior este externalizat n prima faz a apoptozei, astfel nct celula este recunoscut i fagocitat de macrofagi.

Factori de supravieuire i de apotoz. Apotoza i proliferarea celular constituie o rezultant a echilibrului dintre facotorii de supravieuire i factorii de moarte celular programat. Atunci cnd exist un dezechilibru a celor din urm (Bad, Bax, Tnf, sistemul Fas/Fas ligand), celula evolueaz nspre apoptoz, activnd sistemul caspazelor, dar dac predomin factori ca Bcl 2,
celula va supravieui. Studiile recente au relevant prezena prezena comun a transcripilor genelor supresori i inductori ai apotozei, n stadiile ovocitului imatur, cu o cretere a nivelului de inductori (bax et hrk), ncepnd cu stadiul de morul. Deci, nc de la stadiul de fecundare, ovocitul posed echipamentul molecular de a evolua sau nu spre apotoz. S-a stabilit o cretere a activitii transcripionale a caspazei-3 n embrionii multifragmentai n comparaie cu cei sntoi. Exist o corelaie ntre gradul de fragmentare embrionar i apoptoz: activarea efectorilor apoptozei, n scopul eliminrii blastomerelor- sau a embrionilor n totalitate- anormali pe plan genetic, pe cnd intervenia apoptozei n unele blastomere rmne nc necunoscut, iar gradul de fragmentare rmne dependent traducerea morfologic a apotozei. Hardy . A. (2000), au demonstrat prezena nucleilor apototici doar la stadiul de morul compactizat (7% din celule), deducnd c chiar nici aceast rat slab a apoptozei nu poate explica la embrionii nii nivelurile ridicate de blocaj embrionar obaservate n cadrul fiv-urilor umane. Rolul factorilor intrinseci i extrinseci, nu au fost elucidai pn la capt. Autorii citai anterior pun factorii ambientali pe plan second, , mai important fiind generarea embrinilor pornind de la gamei sntoi. n scopul consolidrii acestei opinii, Sjblom et al (2000), au studiat apotoza blastocistelor la oareci n 3 condiii experimentale, permind studiul influenei a 2 factori: tratamentul de superovulaie i condiiile de cultur in vitro, demonstrndu-se respectiv o implicare de 5 ori mai mult asupra apotozei, n comparaie cu al II-lea factor, care nu aprezentat

nici un fel de consecine. Jurisicova .a. (1998), au observat, din contra, o rat dubl a blastocistelor cu apotoz, obinute in vitro. n orice caz, dac exist cazuri suboptimale de cultur, este logic ca acest fapt s antreneze o cretere a poptozei. Plecnd de la aceste considerente este imperativ ca pentru efectuarea PGD-ului sau pentru FISH, s fie prelevat prin biopsie doar acei blastomeri, care nu prezint semne de apoptoz, ceea ce este greu detectabil fr mijloace specifice, pentru ca rezultatele obinute s nu fie eronate. ncepnd cu stadiul de blastocist , fenomenul apoptozei pare a fi ,, fiziologic, fiind mereu prezent, chiar i n blastocistele sntoas, de aceea PGD-ul la acest stadiu theoretic este mai riscant, chiar i n cazul biopsiei celulelor din trofectoderm, care prezint un nivel apoptotic mai sczut n comparaie cu cele prelevate din butonul embrionar.

Rfrences Enders AC, Hendrickx AG, Binkerd PE : Abnormal development of blastocysts and blastomeres in the rhesus monkey. Biol. Reprod. 26, 353, 1982. Handyside AH and Hunter S : Cell division and death in the mouse blastocyst before implantation Rouxs Arch. Dev. Biol. 195, 519, 1986. Hardy K : Cell death in the mammalian blastocyst. Mol. Hum. Reprod . 3, 919, 1997. Hardy K, and Handyside AH : Metabolism and cell allocation during parthenogenetic preimplantation mouse development. Mol.Reprod.Dev. 43, 313, 1996. Hardy K, Handyside AH, Winston RML : The human blastocyst : cell number, death and allocation during late preimplantation development. In Vitro Development. 107, 597, 1989. Hardy K, Spanos S, ,WinstonR, Strak J : From cell death to embryo arrest : Mathematical models of human preimplantation embryo development. Fertil. Steril, vol.4, n 3S, 2000 : ASRM 2000. Hardy K, Warner A, Winston RML, Becker DL : Expession of intercellular junctions during preimplantation development of the human embryo. Mol.Hum.Reprod. 2, 621, 1996. Jurisicova A, Rogers I, Fasciani A, Casper RF, Varmuza S : Effects of maternal age and conditions of fertilization on programmed cell death during murine pre-implantation embryo development. Mol. Hum. Reprod. 4, 139, 1998. Jurisicova A, Varmuza S, Casper RF : Programmed cell death and human embryo fragmentation. Mol. Hum. Reprod. 2, 93, 1996. Levy R, Benchaib M, Cordonier H, Souchier C, Gurin J.F : Annexin V labelling and terminal transferase-mediated DNA end labelling (TUNEL) assay in human arrested embryos. Mol. Hum. Reprod. 4, n8, 775-783, 1998. Sjblom C, Hyllner S.J, Wikland M, Silversand C : Superovulation increases the incidence of cell death in murine blastocysts. Fertil. Steril., vol 4, nS17, 2000 : ASRM 2000.
1 Laboratoire de Biologie de la Reproduction et du Dveloppement, Hpital Edouard-Herriot, Place dArsonval, 69347 Lyon Cedex 03 2 Laboratoire de Biologie de la Reproduction, Hpital Nord, CHU St Priez en Jarez 42055 Saint Etienne Cedex 2