Translated from English to Romanian - www.onlinedoctranslator.

com

Derivarea in vivo a celulelor Vezi Comentariul aferent începând de la pagina 799.

endocrine pancreatice competente la

glucoză din măduva osoasă fără
dovezi de fuziune celulară
Andreea Ianus,1George G. Holz,2,3Neil D. Theise,1și Mehboob A. Hussain3,4
1 Departamentul de patologie,
2 Catedra de Fiziologie si Neurostiinte,
3Departamentul de Farmacologie și
4Departamentul de Medicină, New York University School of Medicine, New York, New York, SUA

Măduva osoasă găzduiește celule care au capacitatea de a se diferenția în celule ale țesuturilor
nehematopoietice cu fenotip neuronal, endotelial, epitelial și muscular. Aici demonstrăm că celulele derivate
din măduva osoasă populează insulele pancreatice Langerhans. Celulele de măduvă osoasă de la șoareci
masculi care exprimă, folosind un sistem CRE-LoxP, o proteină verde fluorescentă îmbunătățită (EGFP), dacă
gena insulinei este transcrisă în mod activ, au fost transplantate în șoareci femele primitori iradiați letal. La
patru până la șase săptămâni după transplant, șoarecii primitori au dezvăluit cromozomul Y și celule dublu
pozitive EGFP în insulele lor pancreatice. Nici celulele măduvei osoase, nici celulele nucleate din sângele
periferic circulant ale șoarecilor donatori sau primitori nu au avut EGFP detectabil. Celulele pozitive EGFP
purificate din insulițe exprimă insulina, transportorul de glucoză 2 (GLUT2) și factorii de transcripție găsiți în
mod obișnuit în celulele β pancreatice. În plus, aceste celule derivate din măduva osoasă prezintă in vitro
— ca și celulele β pancreatice — secreție de insulină dependentă de glucoză și intensificată de incretină.
Aceste rezultate indică faptul că măduva osoasă găzduiește celule care au capacitatea de a se diferenția în
celule β endocrine pancreatice competente funcțional și care reprezintă o sursă pentru tratamentul pe bază de
celule al diabetului zaharat. Rezultatele generate cu sistemul CRE-LoxP sugerează, de asemenea, că fuziunea
celulară in vivo este o explicație puțin probabilă pentru „transdiferențierea” celulelor derivate din măduva
osoasă în fenotipuri celulare diferențiate.
J. Clin. Investi.111:843–850 (2003). doi:10.1172/JCI200316502.

Introducere demonstrat în mai multe modele experimentale (1–7).

Diabetul zaharat apare atunci când există o masă funcțională
inadecvată a celulelor β pancreatice. În diabetul de tip 1,
distrugerea mediată imun a celulelor β lasă o masă celulară β
semnificativ redusă. În diabetul de tip 2, există o cerere
crescută de insulină secretată în fața unei mase celulare β
aproape normale, dar insuficiente și nu crescute. Odată cu
creșterea rapidă a prevalenței diabetului la nivel mondial, s-a
dezvoltat un interes considerabil în găsirea unor mecanisme
de creștere a masei celulelor β prin stimularea regenerării
endogene a insulelor (1-7) sau prin transplantarea insulițelor
donatoare (8) sau a celulelor asemănătoare insulelor
diferențiate in vitro ( 9, 10). În acest scop, regenerarea
celulelor endocrine pancreatice a fost
Primit pentru publicare la 25 iulie 2002 și acceptat în formă revizuită la
11 februarie 2003.
Adresa corespondenta catre:Mehboob A. Hussain,
Departamentele de Medicină și Farmacologie, Școala
de Medicină a Universității din New York,
550 First Avenue, MSB 424, New York,
New York 10016, SUA.
Telefon: (212) 263-0942; Fax: (212) 263-7133; E-
mail: hussam02@popmail.med.nyu.edu .
Conflict de interese:Autorii au declarat că nu există conflict
de interese.
Abrevieri nestandard utilizate:transportor de glucoză 2
(GLUT2); proteină verde fluorescentă îmbunătățită (EGFP).
Celulele stem multipotente au fost descrise în insulele
pancreatice (11, 12) și în compartimentele nonendocrine
ale pancreasului (9, 13), iar aceste celule au capacitatea de
a se diferenția în structuri asemănătoare insulelor
pancreatice in vitro. În plus, celulele care nu se află în
pancreas, cum ar fi celulele ovale hepatice (14, 15) și
celulele stem embrionare, au fost diferențiate în celule
producătoare de hormoni endocrini pancreatici in vitro
(16) și in vivo (17). Acesta din urmă poate corecta fenotipul
diabetului la șoareci (17).
După transplantul de măduvă osoasă sau celule stem
hematopoietice îmbogățite, epiteliu pulmonar scheletic,
intestin și piele (18), mioblaste (19, 20), mioblaste cardiace
(21, 22), endoteliu (23, 24), epiteliu hepatic și biliar (14, 25,
26) sau celule neuroectodermale (27, 28) de origine
donator pot fi găsite la animalele primitoare. Acest
fenomen de grefare a celulelor derivate din măduva
osoasă în mai multe țesuturi se găsește și la oameni (29,
30). Astfel, măduva osoasă adultă adăpostește celule care
au capacitate de diferențiere pluripotentă. Recent, au fost
descrise celule stem mezenchimale pluripotente din
măduva osoasă adultă care au capacitatea de a se
diferenția în celule de linie mezenchimală, endoteliu (31,
32) și țesut endoderm (33) in vitro și in vivo (34). Cu toate
acestea, majoritatea studiilor asupra osului

Jurnalul de investigații clinice | martie 2003 | Volumul 111 | Numărul 6 843

 Celulele diferențiate derivate din măduvă sunt limitate Celulele medulare au fost verificate pentru viabilitatea cu metoda
la caracteristicile morfologice și la profilarea expresiei albastrului tripan și filtrate (Nitex 03-50/31; Sefar America, Kansas
genelor și proteinelor acestor celule. Cu exceptia City, Missouri, SUA) așa cum s-a descris anterior
de grefa cardiacă și hepatică (21, 33), există puțin (18). Destinatarii li s-au iradiat soareci femele cu informatii
despre capacitatea functionala a marcilor osoase. (1.050–1.100 cGy de la un iradiator Gammacell 40 pentru
celule derivate din rânduri care se grefează în țesuturile
extramedulare. Mai mult, paradigma celulelor măduvei
osoase „transdiferențiate” în mai multe linii celulare a fost
contestată de observația că, in vitro, celulele pluripotente
fuzionează cu celule diferențiate și adaptează astfel un
fenotip „diferențiat” (35, 36).
În studiul de față am folosit sistemul CRE-LoxP (37), care
permite identificarea, purificarea și caracterizarea funcțională
a celulelor care exprimă insulină din insulele pancreatice care
au fost derivate in vivo din măduva osoasă transplantată.
Aceste celule exprimă insulina, transportorul de glucoză 2
(GLUT2) și factorii de transcripție găsiți în mod obișnuit în
celulele β pancreatice și nu au markerul de celule stem oct-4.
Aceste celule derivate din măduva osoasă secretă insulină ca
răspuns la un stimul de glucoză sau la analogul hormonului
incretinic exendin-4. În plus, rezultatele sugerează, de
asemenea, că fuziunea celulară (35, 36) este in vivo o
explicație puțin probabilă pentru „transdiferențierea” celulelor
derivate din măduva osoasă care adaptează fenotipul celulei β
pancreatice.
Metode
Model murin de transplant de măduvă osoasă și design
experimental. Animalele au fost menținute în condiții
aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare
a animalelor de la New York University School of Medicine.
Șoarecii transgenici care exprimă recombinaza fagică CRE
(CRE) sub controlul promotorului de insulină II de șobolan
(INS2-CRE) (38) au fost obținuți de la Laboratorul Jackson
(Bar Harbor, Maine, SUA; fundal C57BL/6). Șoarecii care
exprimă proteina fluorescentă verde îmbunătățită (EGFP)
la locusul ROSA26 (39) precedați de trei codoni de oprire a
translației floxați (ROSA-stoplox-EGFP; fundal C57BL/6) (40)
au fost obținuți de la G. Eberl și D. Littman (Nou Școala de
Medicină a Universității York). Codonii stop sunt
îndepărtați prin activitatea CRE care recunoaște secvența
LoxP și îndepărtează porțiunea cromozomială flancată de
situsurile LoxP (adică secvențele de oprire a translației),
rezultând astfel o expresie permanentă a EGFP (37).
Pentru a genera șoareci INS2*EGFP, șoarecii heterozigoți
INS2-CRE au fost încrucișați cu șoareci hemizigoți ROSA-
stoplox-EGFP, iar descendenții au fost genotipați în
momentul înțărcării. La șoarecii INS2*EGFP, celulele care
activează promotorul de insulină exprimă CRE și devin
identificabile prin expresia lor de EGFP. Genotiparea a fost
efectuată cu următorii primeri conform protocoalelor
standard: EGFP (pentru-
secție, 5′-GCGAGGGCGATGCCACCTACGGCA-3′;invers, 5
′-GGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGG-3′;450 bp), CRE
(înainte, 5′-TAAAGATATCTCACGTACTGACGG-3′;invers, 5
′-TCTCTGACCAGAGTCATCCTTAGC-3′;250 bp).
Măduva osoasă de la șoareci donatori masculi a fost
spălată în condiții sterile cu HBSS din cavitățile medulare
ale tibiei și femurului folosind un ac de calibrul 25.
844 Jurnalul de investigații clinice | martie 2003 | Volumul 111 | Numărul 6
animale mici; Atomic Energy of Canada, Kanata, Ontario,
Canada) și a primit aproximativ 106celule nefracţionate
derivate din măduva osoasă prin injectare în vena cozii.
Șoarecii primitori au fost ținuți în cuști sterile cu mâncare
sterilă și apă timp de 2 săptămâni după iradiere și eutanasiați
la 4-6 săptămâni după transplantul de măduvă osoasă pentru
recoltarea țesuturilor. Deoarece toate animalele au avut
același fundal C57BL/6, nu a fost așteptat (și nici observat)
niciun răspuns aloimun sau grefă contra gazdă. Am verificat
grefarea prin determinarea fracției de celule nucleate din
sângele periferic cu un cromozom Y (două numărări de 100 de
celule nucleate per animal).
Procedurile experimentale de transplant de măduvă osoasă
sunt rezumate în Figura 1. Într-un set de experimente,
animalele donatoare au fost șoareci masculi INS2*EGFP, iar
primitorii au fost șoareci femele de tip sălbatic (experimentul
1). Într-un al doilea set de experimente, animalele donatoare
au fost șoareci masculi INS2-CRE, iar primitorii au fost șoareci
femele ROSA-EGFP (experimentul 2). Experimentul 2 a testat
expresia EGFP în celulele primitoare secundar oricărei fuziuni
celulare cu celule donatoare care exprimă CRE (vezi Discuție).
Izolarea celulelor insulare. Insulele au fost izolate
folosind metoda colagenazei așa cum s-a descris
anterior (41). Pe scurt, pancreasului a fost injectat cu 1
ml de colagenază P (2 mg/ml; Roche Diagnostics Corp.,
Indianapolis, Indiana, SUA) și DNaseI (0,5 mg/ml;
Roche Diagnostics Corp.) și incubat la 37°C într-un total
de 10 ml soluție de digestie sub agitare constantă și
agitare intermitentă. Ulterior, insulele au fost spălate
de mai multe ori în HBSS cu BSA (5 mg/ml) și selectate
manual sub un microscop de disecție. Insulele au fost
dispersate în celule individuale prin suspensie în
tripsină EDTA (GIBCO BRL; Life Technologies Inc.,
Grand Island, New York, SUA) și triturare printr-o
pipetă Pasteur siliconată. Celulele au fost apoi cultivate
în RPMI 1640 (GIBCO BRL; Life Technologies Inc.), 5,5
mM glucoză, 10% FCS într-un incubator umidificat (95%
aer, 5% CO).2) la 37°C.
Celulele EGFP-pozitive au fost izolate din celulele EGFP-
negative prin FACS (Becton Dickinson and Co., Franklin
Lakes, New Jersey, SUA) sau culegerea manuală la
microscop fluorescent pentru cultură ulterioară, RT-PCR
(vezi mai jos) sau imunocolorare și PEŞTE. Datele FACS
sunt date în Figura 4 și au fost generate pe software-ul
WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, serverul central FACS al
Institutului Scripps, La Jolla, California, SUA). Unități de Xși
yaxele sunt arbitrare, dar păstrate aceleași pentru toate
experimentele. Părțile a, e și i din figura 4 au axe liniare și
arată împrăștierea înainte și laterală a celulelor. Părțile b–
d, f–h și j–l auXșiyaxele la scară logaritmică și arată
intensitatea fluorescenței verzi înXaxa (semnal EGFP) și
intensitatea fluorescenței ficoeritrinei (roșu) înyaxa
(semnal ficoeritrina).
 (Rainbow*FISH; Cambio Ltd.,
Cambridge, Marea Britanie)
conform recomandarii
producatorului. O digestie cu
proteinaza K (10µg/ml la 37°C, 5
minute) (Sigma-Aldrich, St. Louis,
Missouri, SUA) a fost adăugat la
începutul protocolului FISH. Nucleii
au fost colorați cu 4′,6-diamidină-2′-
diclorhidrat de fenilindol (DAPI)
folosind mediu de montare
fluorescent care conține DAPI la 1,5
µg/ml (Vector Laboratories Inc.).
Imaginile au fost efectuate pe un
microscop fluorescent Zeiss Axioskop 2
(Carl Zeiss MicroImaging Inc., Thornwood,
New York, SUA) echipat cu o cameră
figura 1 digitală cu dispozitiv cu încărcare răcită
Protocol de transplant de măduvă osoasă de șoarece. Experimentul 1: Măduva osoasă de la (Hamamatsu Photonics KK, Hamamatsu
șoareci masculi INS2*EGFP a fost injectată în șoareci femele de tip sălbatic iradiați. City, Japonia) și software Improvision Open
Experimentul 2: Măduva osoasă de la șoareci masculi INS2-CRE a fost injectată în șoareci
Lab ( Improvision Inc., Lexington,
femele iradiați ROSA-stoplox-EGFP.
Massachusetts, SUA) care permite
pseudocolorarea. Imaginile au fost
capturate cu ajutorul
Imunohistochimie și PEȘTI. Țesuturile au fost fixate în filtre adecvate de absorbție și emisie a luminii
paraformaldehidă 4% timp de 2 ore la temperatura furnizate de producătorul microscopului.
camerei și ulterior în zaharoză 30% peste noapte la 4°C Transcriere inversă și PCR. Un subset de celule insulare
înainte de a fi încorporate în compusul Tissue-Tek OCT sortate prin fluorescență au fost luate în cultură timp de 24 de
(Sakura Finetek USA Inc., Torrance, California, SUA) pentru ore și apoi culese manual de două ori pentru fluorescență
secţionare (5– 7µm). Au fost analizate un total de 200 de EGFP pozitivă. O sută dintre aceste celule au fost utilizate
secțiuni pancreatice. Celulele insulare izolate au fost fixate pentru analiza RT-PCR. ARN-ul total din celule a fost purificat
pe lame de microscop cu paraformaldehidă 4% timp de 4 utilizând RNeasy cu o etapă de digestie cu DNază fără RNază
minute la temperatura camerei. Secțiunile de țesut și (QIAGEN Inc., Valencia, California, SUA). Transcripția inversă a
celulele au fost tratate cu metanol 100% timp de 2 minute fost efectuată cu Omniscript (QIAGEN Inc.) și PCR a fost
la -20°C și apoi blocate 3% cu ser normal de măgar timp efectuată folosind ADN polimerază recombinată (Takara
de 10 minute la temperatura camerei. Probele au fost apoi Shuzo Co., Ltd., Shiga, Japonia). Primerii și dimensiunea
incubate la 4°C peste noapte cu ser nonimun, un antiser produsului PCR au fost după cum urmează: insulina I (înainte,
de cobai crescut împotriva insulinei (Linco Research Inc., 5′-TAGTGACCAGCTATAATCAGAG-3′;invers, 5′-
St. Charles, Missouri, SUA) la o diluție de 1:1.000, iepure ACGCCAGGTCTGAAGGTCC-3′;288 bp), insulina II (înainte, 5′-
anti-IPF-1 (1 :500) (41), sau iepure anti-HNF3β (1:2.000) CCCTGCTGGCCCTGCTCTT-3′;invers, 5′-
(furnizat de T. Jessel, Universitatea Columbia, New York, AGGTCTGAAGGTCACCTGCT-3′;212 bp), IPF-1 (înainte,
New 5′-TTAGGGCAGTACGGGTCCTC-3′;invers, 5′-
York, SUA; și A. Ruiz i Altaba, Universitatea din New York CCACCCCAGTTTACAAGCTC-3′;325 bp), HNF3β
School of Medicine). După clătire cu PBS, alunecă (înainte, 5′-ACCTGAGTCCGAGTCTGACC-3′;invers, 5′-
au fost blocate din nou cu ser de măgar 3% timp de 10 GGCACCTTGAGAAAGCAGTC-3′;345 bp), HNF1α (pentru-
minute la temperatura camerei și apoi localizate cu anti- secție, 5′-TCACAGACACCAACCTCAGC-3′;invers, 5′-GAG-
GACACTGTGGGACTGGT-3′;202 bp), HNF1β (înainte,
cobai de măgar sau anti-iepure de măgar cu rodamină X
5′-CCTAGGCTCCAACTTGGTCA-3′;invers, 5′-TGTAG-
conjugată (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.,
CGCACTCCCTGACATC-3′;203 bp), PAX6 (înainte, 5′-
West Grove, Pennsylvania, SUA) (1:500) ) timp de 30 de
minute la temperatura camerei. Diapozitive AAGAGTGGCGACTCCAGAAGTTG-3′;invers, 5′-ACCA-
au fost montate în mediu de montare fluorescent CACCTGTATCCTTGCTTCAGG-3′;545 bp), CD45
(Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, (C57BL/6) (înainte, 5′-AACTGGAACACTGCCTGCTT-3′;
SUA) și depozitate în întuneric. Pentru secțiunile invers, 5′-GACCACCTCACTGTCACGTTT-3′;198 bp),
congelate, o proteină fluorescentă anti-verde de iepure oct-4 (înainte, 5′-GGCGTTCTCTTTGGAAAAGGTGTTC-3′;
IgG conjugată cu Alexa Fluor 488 (Molecular Probes Inc., invers, 5′-CTCGAACCACATCCTTCTCT-3′;293 bp),
Eugene, Oregon, SUA) la o diluție de 1: 2000 a fost utilizată ciclofilină (înainte, 5′-CAGACGCCACTGTCGCTTT-3′;
pentru a detecta prezența celulelor pozitive EGFP. După invers, 5′-TGTCTTTGGAACTTTGTCTGCAA-3′;132 bp).
capturarea imaginii, aceleași probe au fost analizate O plasmidă de control oct-3/4 a fost un cadou generos de la L.
pentru prezența cromozomului Y de șoarece cu FISH Dailey (Școala de Medicină a Universității din New York).

Jurnalul de investigații clinice | martie 2003 | Volumul 111 | Numărul 6 845

 Figura 2
Imunofluorescență și FISH pentru cromozomul Y al
pancreaticului 5- până la 7-µm secțiuni congelate de la
șoarecii primitori ai experimentelor 1 și 2 (vezi Figura 1).
(Așib) Imagini de fază în câmp luminos. (c șid) Imagine
compozită de suprapunere a imunofluorescenței pentru
insulină (roșu) și EGFP (verde) și FISH pentru
cromozomul Y (galben) și colorarea DAPI a nucleelor
(albastru). Celulele pozitive ale cromozomului Y (săgeți)
sunt prezente în insulă (i) și în porțiunile exocrine ale
pancreasului (e). EGFP este prezent numai în celulele
insulino-pozitive din insulă. Bară de scară, 10µm;×400.
Inserări încșidsunt zone mărite ale EGFP și celule dublu
pozitive pentru insulină care conțin un cromozom Y.

Caracterizarea funcțională a celulelor insulare: secreția de
insulină. După sortarea FACS și/sau alegerea manuală, celulele
insulare EGFP-pozitive (1.000 de celule per godeu de microtitrare)
au fost cultivate timp de 24 de ore înainte de analiză ulterioară.
Celulele au fost apoi schimbate pe mediu care conține fie 5,5 mM,
fie 11,1 mM glucoză pentru încă 10 ore. Unele celule au fost, de
asemenea, stimulate cu exendin-4 analog al peptidei-1 glucagon
(Sigma-Aldrich; 10 nM) în ultimele 4 ore de incubare în glucoză
11,1 mM. Ca celule de control, celulele insulare izolate de la
șoarecele INS2*EGFP au fost luate pentru un test paralel.
Supernatantul celulelor insulare a fost recoltat, filat ușor și analizat
pentru insulină prin ELISA (Kit ELISA de insulină ultrasensibil;
Crystal Chem Inc., Chicago, Illinois, SUA).
Rezultate
Raportăm experimentele 1 și 2 (Figura 1),
desfășurate în paralel de trei ori fiecare cu coerente
rezultate. Un total de 48 de animale au fost iradiate și
injectate cu celule de măduvă osoasă. Am observat o rată
de mortalitate de aproximativ 30% în prima săptămână
după iradiere. Sunt prezentate rezultatele a 21 de animale
din experimentul 1 și 10 animale din experimentul 2. S-a
constatat că grefarea este de 70-90% atunci când celulele
nucleate din sângele periferic au fost examinate pentru
prezența unui cromozom Y.
La examenul histologic, nu am detectat nicio modificare
care să sugereze o leziune prin radiații. Când animalele
primitoare de tip sălbatic au fost transplantate cu celule
de măduvă osoasă de la șoareci masculi INS2 * EGFP,
celulele EGFP pozitive au fost detectate în insulele
șoarecilor primitori (Figura 2) la 4-6 săptămâni după
transplant. Pe secțiunile congelate (Figura 2), precum și în
preparatele unicelulare (Figura 3, a–d), aceste celule EGFP-
pozitive au exprimat insulina, așa cum este determinat de

Figura 3
Imunofluorescența și FISH ale celulelor izolate, dispersate ale insulelor pancreatice din experimentul 1 (vezi Figura 1). Imaginile câmpurilor identice
sunt afișate în panourile respective: (A–d) insulina, (e–h) IPF-1 și (i–l) Imunodetecția HNF3β. (A,e, șii) Faza de câmp luminos; (b,f, șij) EGFP (observați
o ușoară autofluorescență a celulelor insulare izolate de control); (c,g, șik) Imunocolorarea cu anticorp secundar marcat cu rodamină X pentru
panouri. (c) Insulină, (g) IPF-1, (k) HNF3β și (dh, șil) FISH pentru cromozomul Y (în galben) și colorarea nucleului cu DAPI (albastru). Cromozomul Y
este prezent numai în celulele EGFP-pozitive. Bara de scară, 5µm;×630.

846 Jurnalul de investigații clinice | martie 2003 | Volumul 111 | Numărul 6

Figura 4
Sortarea celulelor și analiza fluorescenței. (A–d) Celule nucleate din sângele periferic; (e–h) celulele măduvei osoase; (i–l) celule insulare izolate și dispersate. (A
,e, șii) Graficul de dispersie reprezentativ al laturii (Xaxă) și înainte (yaxa) împrăștierea celulelor respective. (b–d,f–h, șij–l) Scanări cu fluorescență (Xaxa, EGFP;y
axa, filtru de ficoeritrină [roșu]) celulelor respective. (b,f, șij) Celule de la șoareci donatori INS*EGFP (experimentul 1). (c,g, șik) Celule de la șoareci de tip
sălbatic iradiați transplantați cu măduvă osoasă de la șoareci INS*EGFP (experimentul 1). (d,h, șil) Celule de la șoareci iradiați ROSA-stoplox-EGFP transplantați
cu măduvă osoasă de la șoareci INS2-CRE (experimentul 2). Nicio fluorescență nu este detectabilă în celulele nucleate din sângele periferic al donatorului sau
al primitorului sau în celulele măduvei osoase. EGFP este detectabil în insulițele animalelor donatoare din experimentul 1 și la destinatarii experimentului 1. În
b–d,f–h, șij–l, celulele din linia echidistante de ambele axe prezintă o oarecare autofluorescență, iar celulele din cadranul din dreapta jos au semnal EGFP.
Consultați Figura 1 pentru descrierea experimentelor 1 și 2.

imunohistochimie. Mai mult, la analiza FISH, aceste celule
au dezvăluit un cromozom Y în nucleele lor, ceea ce indică
faptul că aceste celule au fost derivate din măduva osoasă
a șoarecelui donator mascul (Figurile 2 și 3). Celulele
derivate din măduva osoasă din insulițe au exprimat nu
numai insulina, ci și factori de transcripție specifici pentru
celulele β (IPF-1; Figura 3, e–h) și endoderm (HNF3β;
Figura 3, i–l). În schimb, atunci când șoarecii femele ROSA-
stoplox-EGFP au primit transplant de măduvă osoasă de la
șoareci donatori masculi INS2-CRE (experimentul 2),
niciuna dintre celulele din insulițe sau restul pancreasului
nu au fost fluorescente (Figura 2, b și d). Cu toate acestea,
celulele pozitive pentru cromozomul Y au fost detectabile
în insulițe, ceea ce indică faptul că, în experimentul 2,
grefarea celulelor derivate din măduva osoasă a avut loc
în insuliță; nu au fost detectate evenimente de
recombinare la situsurile LoxP ale șoarecilor primitori,
după cum sa evaluat prin imunocolorare absentă pentru
EGFP (Figura 2d). În schimb, după ce am forțat fuziunea in
vitro (42) între celulele de măduvă osoasă INS2-CRE și celulele
insulare ROSA-stoplox-EGFP, am detectat fluorescența (datele
nu sunt prezentate). Aceste rezultate indică faptul că fuziunea
celulară in vivo este puțin probabil să stea la baza
„transdiferențierii” aparente a celulelor derivate din măduva
osoasă într-un fenotip de celule β.
Analiza celulelor activate de fluorescență (104celulele
numărate pe preparat de celule insulare) (Figura 4) și/sau
numărarea manuală (300 de celule numărate) au arătat
că, la 4-6 săptămâni după transplantul de măduvă osoasă,
proporția de celule care exprimă EGFP în insulă a variat
între 1,7% și 3% a tuturor celulelor dintr-o insuliță, în
comparație cu 80% până la 85% în insulele de la șoarecii
martor INS2*EGFP. Nici celulele nucleate din sângele
periferic (Figura 4, a–d) și nici măduva osoasă (Figura 4, e–
h) de la șoarecii donatori sau primitori nu au dezvăluit
EGFP detectabil în niciunul dintre experimente.

Figura 5
RT-PCR a celulelor izolate și sortate FACS din experimentul
1. (ACelulele nucleate din sângele periferic (PBNC) ale
șoarecilor primitori exprimă ciclofilina (banda 1), precum
și CD45 (banda 2), iar celulele care exprimă EGFP derivate
din insulele pancreatice exprimă ciclofilina (banda 3),
lipsește CD45 (banda 4) și exprimă insulina (banda 5). (b)
Celulele care exprimă EGFP izolate din insulele
pancreatice nu exprimă markerul de celule stem oct-3/4.
Banda 1: Plasmidă oct-3/4 de control pozitiv. Celulele
măduvei osoase exprimă ciclofilina (banda 2) și oct-3/4
(banda 3), iar celulele care exprimă EGFP din insulele
pancreatice exprimă ciclofilina (banda 4), dar nu oct-3/4
(banda 5). (c) Celulele care exprimă EGFP izolate din
insulele pancreatice exprimă ciclofilina (banda 1), insulina
I (banda 2), IPF-1 (banda 4) și HNF3β (banda 5). Banda 3
este goală. (d) Celulele care exprimă EGFP derivate din
insulele pancreatice exprimă ciclofilina (banda 1), insulina
II (banda 2), insulina I (banda 3), GLUT2 (banda 4), HNF1α
(banda 5), HNF1β (banda 6) și PAX6 (banda 7).

Jurnalul de investigații clinice | martie 2003 | Volumul 111 | Numărul 6 847


Figura 6
Secreția de insulină a celulelor EGFP-pozitive izolate din insulițe este similară
cu secreția de insulină a celulelor de control. Secreția de insulină după
stimularea cu glucoză sau glucoză și exendin-4 a celulelor izolate pozitive
pentru EGFP din experimentul 1 este prezentată ca bare gri închis. Celulele
de control au fost izolate de la un șoarece INS*EGFP și tratate identic (bare
gri deschis). O mie de celule insulare dispersate au fost colectate pentru
exprimarea EGFP prin FACS și/sau culegere manuală, cultivate timp de 24 de
ore la 5,5 mM glucoză sau 11,1 mM glucoză timp de 10 ore. Celulele
suplimentare au fost incubate în 11,1 mM glucoză timp de 10 ore și apoi cu
10 nM exendin-4 timp de încă 4 ore. Supernatantul a fost colectat pentru
măsurători de insulină (ELISA). Rezultatele a trei teste separate efectuate
fiecare în duplicat sunt prezentate ca medie ± SD.
După sortare și cultură timp de 24 de ore, celulele EGFP-
pozitive din experimentul 1 au fost caracterizate în continuare
prin RT-PCR pentru a exprima insulina I, insulina II, GLUT2,
IPF-1, HNF1α, HNF1β, HNF3β și PAX6 și pentru a lipsi de cele
comune. markerul hematopoietic/leucocitar CD45 și celula
stem embrionară și markerul celulelor stem mezenchimale ale
măduvei osoase oct-3/4 (34) (Figura 5). Acest lucru sugerează
că celulele derivate din măduva osoasă care au grefat insulele
și care au exprimat EGFP nu au exprimat un marker de celule
non-β prezent în celulele nucleate circulante sau în măduva
osoasă.
Celulele pozitive pentru EGFP au răspuns la glucoză, precum
și la exendin-4 analog sintetic al peptidei-1 glucagon (vezi
Metode) cu un răspuns secretor de insulină similar cu cel al
celulelor de insulă de șoarece de control care au fost analizate
în paralel (Figura 6). Aceste rezultate indică faptul că celulele
studiate au mecanismul de a detecta glucoza și hormonul
incretinic peptida-1 asemănător glucagonului în mod similar
cu celulele β de șoarece de tip sălbatic.
Discuţie
Această lucrare demonstrează că măduva osoasă a
șoarecilor adulți găzduiește celule care se pot diferenția
către un fenotip de celule β endocrine pancreatice la
șoarecii primitori in vivo. Aceste celule derivate din
măduva osoasă, odată grefate în insulele pancreatice ale
gazdei lor (Figura 2), prezintă markeri și comportament
fiziologic caracteristic celulelor β pancreatice. Celulele
exprimă insulina, GLUT2 și factorii de transcripție găsiți în
mod obișnuit în celulele β (Figurile 3 și 5) și secretă
insulina atunci când sunt stimulate cu glucoză sau
exendin-4 (Figura 6). Mai mult, aceste celule prezintă
fluctuații dependente de glucoză ale calciului intracelular,
caracteristice celulelor p (datele nu sunt prezentate).
848 Jurnalul de investigații clinice | martie 2003 | Volumul 111 | Numărul 6
Mai multe rapoarte anterioare au demonstrat prezența
celulelor în insulele pancreatice (5, 11, 12), țesutul ductului
pancreatic (3, 9, 13) și ficatul (15) care au potențialul de a se
diferenția în celule cu un fenotip endocrin pancreatic. .
Prezentul raport indică o sursă suplimentară de celule care
sunt capabile să se diferențieze în celule endocrine
pancreatice. Se poate presupune că, în ceea ce privește
celulele insulelor pancreatice, celulele derivate din măduva
osoasă au capacitatea de a se diferenția direct în celule
producătoare de insulină. Alternativ, aceste celule pot intra
într-un grup intermediar de unul (43) sau mai multe fenotip(i)
de celule multipotente în compartimentele endocrine sau
nonendocrine ale pancreasului sau ca celule ovale în ficat (15).
Apoi, într-o etapă ulterioară, aceste celule pot răspunde la
semnale locale (9, 12, 44) sau circulante (45) - și se pot
diferenția în celule producătoare de insulină. În intervalul de
timp al prezentului studiu (4-6 săptămâni), 1,7-3% din celulele
EGFP-pozitive derivate din măduva osoasă au fost detectate
prin sortarea celulelor în insulele pancreatice. Bonner-Weir și
colegii lor estimează că într-o insuliță de șobolan adult se
formează 3% din celulele β noi pe zi (46-48). Dacă rata de
rotație a celulelor din insulele de șoarece este similară cu cea
a insulelor de șobolan și dacă toate celulele β nou formate
sunt derivate direct din celulele provenite din măduva osoasă
transplantată (ceea ce pare puțin probabil), atunci ar fi de
așteptat mai multe celule pozitive pentru EGFP. 4-6 săptămâni
după transplantul de măduvă osoasă. Cu toate acestea,
rezultatele studiului de față nu permit ca această problemă să
fie abordată în mod concludent. Sunt necesare studii
suplimentare pentru a elucida contribuțiile relative ale
celulelor stem pancreatice rezidente față de celulele derivate
din măduva osoasă la formarea de noi celule β. Expresia
insulinei și a EGFP, așa cum a fost evaluată prin
imunohistochimie, a fost detectată numai în insulele
pancreatice. Deși am detectat celule pozitive pentru
cromozomul Y în alte țesuturi, inclusiv în ficat (neprezentat) și
în compartimentele exocrine ale pancreasului șoarecilor
primitori (Figura 2), nu am putut detecta nicio expresie EGFP
în celulele din afara insulelor pancreatice. Aceste rezultate
indică faptul că celulele derivate din măduva osoasă nu
activează expresia genei insulinei decât dacă intră într-o insulă
pancreatică. Pancreatectomia parțială (49), infuzia cronică de
glucoză (7, 50) și peptida asemănătoare glucagonului-1 și
analogul său exendin-4 (3) stimulează expresia genei IPF-1 și a
hormonului endocrin în canalele pancreatice și
compartimentele exocrine. Ar fi interesant de văzut dacă
acești stimuli ar putea induce expresia EGFP în modelul
descris aici.
În modelul de față, folosind metoda CRE-LoxP, toate
celulele care exprimă insulina (și astfel activează CRE și
evenimentele de recombinare ulterioare) sunt marcate
permanent cu EGFP chiar dacă aceste celule încetează să
exprime insulina mai târziu. Nu am detectat celule EGFP-
pozitive în sângele circulant sau în măduva osoasă a
primitorilor de măduvă osoasă grefați cu succes. Astfel,
este rezonabil să presupunem că, în intervalul de timp al
experimentelor noastre, măduva osoasă
Este puțin probabil ca celulele derivate care exprimă
insulina în insulițele pancreatice să părăsească insulele
și să reintră în circulație, să revină posibil la un fenotip
„asemănător progenitorului” și să populeze apoi un alt
țesut și să dobândească un fenotip diferit într-un
mediu de țesut nou (51). Alternativ, ar trebui postulată
tăcere activă a locusului ROSA26-EGFP pentru a opri
semnalul verde fluorescent (52). În plus, faptul că nu
am fost capabili să detectăm celule EGFP-pozitive în
sângele periferic sau măduva osoasă colectate de la
animale donatoare sau primitoare sau în țesuturile
non-insulare ale animalelor primitoare sugerează (deși
nu dovedește) că activarea genei insulinei cu expresia
CRE și dezinhibarea ulterioară a expresiei EGFP nu au
loc înainte ca celulele derivate din măduva osoasă să
se afle în insulă.
Rapoarte recente sugerează că celulele stem par să
„transdiferențieze” prin evenimente de fuziune celulară care
pot duce la detectarea celulelor pozitive pentru cromozomul Y
în celulele altfel diferențiate ale unui anumit țesut (35, 36). Cu
sistemul CRE-LoxP, probabilitatea evenimentelor de fuziune
poate fi abordată. Am transplantat măduva osoasă de la
șoareci INS2-CRE în șoareci receptori ROSA-stoplox-EGFP
(Figura 1, experimentul 2). Dacă celulele derivate din măduva
osoasă ar fuziona cu celulele gazdă din insuliță și gena
insulinei II din transgena donorului ar fi activată și exprimă
CRE, atunci codonii stop floxați de la locusul ROSA26 din
receptor ar fi îndepărtați, astfel făcând celulele fluorescente.
Deși găsim activarea EGFP în condiții in vitro care facilitează
fuziunea între celulele de măduvă osoasă INS2-CRE și celulele
insulare ROSA-stoplox-EGFP (datele nu sunt prezentate), nu
am detectat nicio fluorescență în experimentele in vivo
corespunzătoare (Figurile 1 și 2). , experimentul 2 și Figura 3l).
Astfel, descoperirile noastre sugerează că fuziunea celulară,
dacă este deloc prezentă in vivo, este un eveniment rar în
paradigma „transdiferențierii” celulelor derivate din măduva
osoasă.
Raportul actual demonstrează potențialul pentru
tratamentul pe bază de celule al diabetului zaharat prin
generarea de celule producătoare de insulină din celule
stem derivate din măduva osoasă. Sugerăm că există
celule în măduva osoasă adultă care sunt capabile să se
diferențieze către un fenotip de celule β pancreatice.
Recent, Jiang et al. (34) și Reyes și colab. (32) au descris
pluripotența celulelor stem mezenchimale derivate din
măduva osoasă adultă care poate fi păstrată în cultură
pentru un număr mare de pasaje. Deși nu a fost raportat
(34), aceste celule pot – la fel ca și celulele stem
embrionare (16) – să aibă capacitatea de a se diferenția în
celule β competente pentru glucoză. Dacă da, această
strategie ar trebui să permită izolarea celulelor capabile să
se diferențieze in vivo sau ex vivo în celule funcționale
producătoare de insulină. În plus, aceste celule ar putea
oferi o sursă potențial nelimitată de celule insulare fără
problemele de respingere a țesuturilor, așa cum se
observă în transplantul alogen. Pe lângă implicația
terapeutică a acestor constatări, modelul descris aici
poate permite, de asemenea, examinarea
Jurnalul de investigații clinice |
mecanismele care stau la baza homing-ului celulelor,
precum și factorii care controlează reglarea expresiei
genelor, în mediul extramedular în care intră celulele
derivate din măduva osoasă.
Mulțumiri
Mulțumim D. Littman și G. Eberl pentru că au
furnizat șoareci ROSA-stoplox-EGFP, T. Jessel și A.
Ruiz i Altaba pentru anticorpul HNF3β și L. Dailey
pentru plasmida de control oct-3/4. Mulțumim lui J.
Hirst pentru ajutor și sfaturi valoroase cu analiza
celulelor fluorescente și D. Ron și H. Harding pentru
că au permis imagistica fluorescentă inițială.
Mulțumim lui G. Eberl, J. Osbeck și D. Ron pentru
discuțiile utile; JA Daly și KN Herman pentru ajutor
neprețuit; și M. McAllister, M. Blaser, R. Levin și H.
Samuels pentru sprijin. GG Holz a fost susținut de
NIH și Asociația Americană de Diabet (ADA), ND
Theise de NIH și MA Hussain de Fundația de
Cercetare a Diabetului Juvenil și ADA.
1. Rosenberg, L., Vinik, AI, Pittenger, GL, Rafaeloff, R. și Duguid, WP 1996.
Regenerarea celulelor insulare în pancreasul hamsterului diabetic cu
restabilirea normoglicemiei poate fi indusă de un(i) factor(i) de creștere
local(i) .Diabetologia.39:256–262.
2. Rafaeloff, R., Barlow, SW, Rosenberg, L. și Vinik, AI 1995. Exprimarea
genei Reg în modelul de regenerare a insulelor pancreatice de hamster
auriu sirian.Diabetologia.38:906–913.
3. Stoffers, DA, et al. 2000. Agoniştii peptidei 1 asemănătoare glucagonului insulinotropi
stimulează expresia proteinei IDX-1 din homeodomeniu şi măresc dimensiunea
insulelor în pancreasul de şoarece.Diabet.49:741–748.
4. Guz, Y., Nasir, I. și Teitelman, G. 2001. Regenerarea celulelor beta pancreatice
din celulele precursoare intra-insulă într-un model experimental de diabet.
Endocrinologie.142:4956–4968.
5. Fernandes, A., et al. 1997. Diferențierea de noi celule producătoare de insulină
este indusă de leziuni în insulele pancreatice adulte.Endocrinologie. 138:1750–
1762.
6. Teitelman, G. 1996. Inducerea neogenezei celulelor beta prin lezarea insulelor.
Diabet Metab. Rev.12:91–102.
7. Lipsett, M. și Finegood, DT 2002. Neogeneza celulelor beta în timpul
hiperglicemiei prelungite la șobolani.Diabet.51:1834–1841.
8. Shapiro, AM, et al. 2000. Transplantul de insuliță la șapte pacienți cu
diabet zaharat de tip 1 folosind un regim imunosupresor fără
glucocorticoizi.N. Engl. J. Med.343:230–238.
9. Bonner-Weir, S., şi colab. 2000. Cultivarea in vitro a insulelor umane din țesut ductal
expandat.Proc. Natl. Acad. Sci. STATELE UNITE ALE AMERICII97:7999–8004.
10. Halvorsen, T., și Levine, F. 2001. Abordări de transplant de celule cu
diabet zaharat și terapie genetică.Curr. Mol. Med.1:273–286.
11. Zulewski, H., et al. 2001. Celulele stem multipotentiale nestin-pozitive
izolate din insulele pancreatice adulte se diferentiaza ex vivo in fenotipuri
endocrine, exocrine si hepatice pancreatice.Diabet.50:521–533.
12. Abraham, EJ, Leech, CA, Lin, JC, Zulewski, H. și Habener, JF 2002. Diferențierea
hormonului insulinotrop asemănător glucagonului-1 a celulelor progenitoare
derivate din insulițele pancreatice umane în celule producătoare de insulină.
Endocrinologie.143:3152–3161.
13. Ramiya, VK, et al. 2000. Inversarea diabetului insulino-dependent folosind
insulițe generate in vitro din celule stem pancreatice.Nat. Med.6:278–282.
14. Petersen, BE, et al. 1999. Măduva osoasă ca sursă potențială de celule ovale
hepatice.Ştiinţă.284:1168–1170.
15. Yang, L., et al. 2002. Trans-diferențierea in vitro a celulelor stem hepatice adulte în celule
producătoare de hormoni endocrini pancreatici.Proc. Natl. Acad. Sci. STATELE UNITE
ALE AMERICII99:8078–8083.
16. Lumelsky, N., et al. 2001. Diferențierea celulelor stem embrionare la
structurile secretoare de insulină similare cu insulițele pancreatice.
Ştiinţă. 292:1389–1394.
17. Soria, B., et al. 2000. Celulele secretoare de insulină derivate din celule stem
embrionare normalizează glicemia la șoarecii diabetici induși de
streptozotocină. Diabet.49:157–162.
18. Krause, DS, et al. 2001. Grefă multi-organă, multi-linee de către o singură celulă
stem derivată din măduva osoasă.Celulă.105:369–377.
19. Ferrari, G., et al. 1998. Regenerarea musculară prin progenitori miogeni derivați
din măduva osoasă.Ştiinţă.279:1528–1530.
20. Gussoni, E., et al. 1999. Expresia distrofinei la șoarecele mdx restaurată
prin transplant de celule stem.Natură.401:390–394.
martie 2003 | Volumul 111 | Numărul 6 849
 21. Orlic, D., şi colab. 2001. Celulele măduvei osoase regenerează miocardul infarct.
Natură.410:701–705.
22. Jackson, KA, şi colab. 2001. Regenerarea mușchiului cardiac ischemic și a
endoteliului vascular de către celulele stem adulte.J. Clin. Investi.107:1395–1402.
23. Lin, Y., Weisdorf, DJ, Solovey, A. și Hebbel, RP 2000. Origins of circulating
endotelial cells and endothelial outgrowth from blood.J. Clin. Investi.105
:71–77.
24. Asahara, T., et al. 1999. Originea măduvei osoase a celulelor
progenitoare endoteliale responsabile de vasculogeneza postnatală în
neovascularizarea fiziologică și patologică.Circ. Res.85:221–228.
25. Theise, ND, et al. 2000. Derivarea hepatocitelor din celulele măduvei
osoase la șoareci după mieloablația indusă de radiații.hepatologie. 31
:235–240.
26. Lagasse, E., şi colab. 2000. Celulele stem hematopoietice purificate se pot
diferenția în hepatocite in vivo.Nat. Med.6:1229–1234.
27. Brazelton, TR, Rossi, FM, Keshet, GI și Blau, HM 2000. De la măduvă
la creier: expresia fenotipurilor neuronale la șoarecii adulți. Ştiinţă.
290:1775–1779.
28. Mezey, E., Chandross, KJ, Harta, G., Maki, RA și McKercher, SR 2000.
Transformarea sângelui în creier: celule purtând antigene neuronale
generate in vivo din măduva osoasă.Ştiinţă.290:1779–1782.
29. Theise, ND, et al. 2000. Ficat din măduva osoasă la om.hepatologie. 32
:11–16.
30. Korbling, M., et al. 2002. Hepatocite și celule epiteliale de origine donator
la receptorii de celule stem din sângele periferic.N. Engl. J. Med. 346:738–
746.
31. Reyes, M., şi colab. 2001. Purificarea și expansiunea ex vivo a celulelor progenitoare
mezodermice ale măduvei umane postnatale.Sânge.98:2615–2625.
32. Reyes, M., et al. 2002. Originea progenitorilor endoteliali în măduva
osoasă postnatală umană.J. Clin. Investi.109:337–346. doi:10.1172/
JCI200214327.
33. Schwartz, RE, et al. 2002. Celulele progenitoare adulte multipotente din măduva osoasă
se diferențiază în celule funcționale asemănătoare hepatocitelor.J. Clin. Investi. 109
:1291–1302. doi:10.1172/JCI200215182.
34. Jiang, Y., et al. 2002. Pluripotența celulelor stem mezenchimale derivate
din măduva adultă.Natură.418:41–49.
35. Terada, N., et al. 2002. Celulele măduvei osoase adoptă fenotipul altor celule
prin fuziunea celulară spontană.Natură.416:542–545.
36. Ying, QL, Nichols, J., Evans, EP și Smith, AG 2002. Schimbarea
potenței prin fuziune spontană.Natură.416:545–548.
37. Sauer, B. și Henderson, N. 1988. Recombinarea ADN-ului specifică locului în celulele de
mamifere prin recombinaza Cre a bacteriofagului P1.Proc. Natl. Acad. Sci. STATELE
UNITE ALE AMERICII85:5166–5170.
38. Gannon, M., Shiota, C., Postic, C., Wright, CV și Magnuson, M.
850 Jurnalul de investigații clinice | martie 2003 | Volumul 111 | Numărul 6
2000. Analiza recombinării mediate de Cre condusă de promotorul de
insulină de șobolan în pancreasul de șoarece embrionar și adult.Geneză.
26:139–142.
39. Soriano, P. 1999. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre
reporter strain.Nat. Genet.21:70–71.
40. Mao, X., Fujiwara, Y., Chapdelaine, A., Yang, H. și Orkin, SH 2001.
Activarea expresiei EGFP prin excizia mediată de Cre într-o nouă tulpină
de șoarece reporter ROSA26.Sânge.97:324–326.
41. Hussain, MA, Lee, J., Miller, CP și Habener, JF 1997. Factorul de
transcripție al domeniului POU creierul 4 conferă expresia specifică
celulei alfa pancreatice a genei proglucagon prin interacțiunea cu un nou
element promotor G1 proximal.Mol. Celulă. Biol.17:7186–7194.
42. Yokoyama, WM 1991. Fuziunea celulară și selecția hibridoamelor. În
Protocoale actuale în imunologie.JE Coligan, AM Kruisbeek, DH
Margulies, EM Shevach și W. Strober, editori. John Wiley & Sons.
Hoboken, New Jersey, SUA. 2.5.4–2.5.9.
43. Gu, G., Dubauskaite, J. și Melton, DA 2002. Dovezi directe pentru linia
pancreatică: celulele NGN3+ sunt progenitoare de insuliță și sunt distincte de
progenitorii de conducte.Dezvoltare.129:2447–2457.
44. Czyz, J. și Wobus, A. 2001. Diferențierea celulelor stem embrionare: rolul
factorilor extracelulari.Diferenţiere.68:167–174.
45. Flier, SN, Kulkarni, RN și Kahn, CR 2001. Dovezi pentru un factor de creștere a celulelor
insulare circulante în stări rezistente la insulină.Proc. Natl. Acad. Sci. STATELE UNITE ALE
AMERICII98:7475–7480.
46. Finegood, DT, Scaglia, L. și Bonner-Weir, S. 1995. Dinamica masei
betacelule în pancreasul de șobolan în creștere. Estimare cu un model
matematic simplu.Diabet.44:249–256.
47. Scaglia, L., Cahill, CJ, Finegood, DT și Bonner-Weir, S. 1997.
Apoptoza participă la remodelarea pancreasului endocrin la
șobolanul neonatal.Endocrinologie.138:1736–1741.
48. Bonner-Weir, S. 2001. Turnover-ul celulelor beta: evaluarea și implicațiile sale.
Diabet.50(Supliment. 1): S20–S24.
49. Bonner-Weir, S., Trent, DF, and Weir, GC 1983. Pancreatectomie parțială
la șobolan și defect ulterior în eliberarea de insulină indusă de glucoză.
J. Clin. Investi.71:1544–1553.
50. Jonas, JC, şi colab. 1999. Hiperglicemia cronică declanșează pierderea
diferențierii celulelor beta pancreatice într-un model animal de diabet.J. Biol.
Chim. 274:14112–14121.
51. Theise, ND și Krause, DS 2002. Către o nouă paradigmă a plasticității
celulare.leucemie.16:542–548.
52. Trainor, PA, et al. 1999. Aplicarea șoarecilor transgenici lacZ la studiile de
descendență celulară. ÎnEmbriologie moleculară: metode și protocoale.Volumul
97. PT Sharpe și I. Mason, editori. Humana Press. Totowa, New Jersey, SUA. 183–
200.