Lucrri practice 8 Genetic MUTAGENEZA CU BROMURA DE ETIDIU LA SACCHAROMYCES CEREVISIAE n marea lor majoritate, caracterele ereditare sunt determinate

e de gene localizate n nucleu. Comportamentul acestor gene se supune legilor formulate de Mendel i Morgan. n unele cazuri ns, s a constatat c unele caractere ereditare se transmit preferen!ial pe linia unui genitor, de regul a genitorului matern, indiferent de structura genetic nuclear a acestuia sau a genitorului patern "#omozigot dominant $$, #eterozigot $a sau #omozigot recesi% aa&, ceea ce nseamn c aceste caractere nu se supun legil r men!eliene ale ere!it"ii# $semenea caractere, nu sunt determinate de gene localizate n nucleu ci de gene e'tranucleare localizate, n principal, n organitele citoplasmei celulei eucariote. (rincipalele gene e'tranucleare sunt localizate n mit c n!rii $i cl r plaste% organite caracteristice celulelor eucariote. Genomurile organitelor celulare caracterizate p)n n prezent sunt reprezentate de c)te o molecul circular de $*+, care a primit nota!ia de ADNmt pentru mitocondrii sau de ADNcp pentru cloroplaste. Mit c n!riile sunt organite celulare comple'e specializate n respira!ia celular i fosforilarea o'idati%, care prezint un sistem genetic propriu i implicit mecanisme specifice de sintez proteic. Mitocondriile au rolul de a stoca energia su, form c#imic sintetiz)nd molecule de adenozin trifosfat "$-(& care particip la majoritatea proceselor meta,olice. n cadrul acestor reac!ii, $-( este degradat eli,er)nd astfel energia stocat. $u o form sferic sau elipsoidal, cu un diametru de .,/ .,0 1 i o lungime de 2 0 1. Genele mit c n!riale se transmit ere!itar !e la genera"ie la alta n n&men!elian. (rocesul de transmitere a mitocondriilor de la o genera!ie la alta a fost studiat n special la Saccharomyces cerevisiae utiliz)ndu se mai multe modalit!i de e'perimentare cum ar fi analiza genetic a mutantelor mitocondriale i fuziunea celular. Ca i n cazul analizei genetice pentru genele nucleare, pentru studierea genelor mitocondriale sunt utilizate diferite tipuri de celule mutante. 3 astfel de categorie de celule mutante sunt mutantele petite, denumite astfel datorit dimensiunii reduse a coloniilor. 4enotipul respecti% este transmis genera!iilor urmtoare ntr o manier non mendelian.

n genomul mitocondrial de la drojdii, au fost indentificate di%erse tipuri de restructurri, mai ales dele!ii, prin care apar tulpinile petite. -oate mutantele de acest tip, se caracterizeaz prin pierderea func!iilor mitocondriilor, astfel c tulpinile de acest tip supra%ie!uiesc numai datorit capacit!ii alternati%e a drojdiilor de a tri n mediu aero, sau anaero,. Mutantele petite pot aprea spontan "cu o frec%en! a muta!iei de 2. 5 per genera!ie& sau pot fi induse prin tratarea celulelor cu ,romur de etidiu. 6'aminarea microscopic a mutantelor petite a e%iden!iat faptul c dimensiunea celulelor este normal dar, deoarece ele cresc mult mai ncet din cauza unor modificri respiratorii, dimensiunea coloniilor este mai mic dec)t cea a celulelor normale. Genomurile celulelor mutante de tip petite sunt modificate fie prin pierderea unor segmente de $*+ mitocondrial, fie prin a,sen!a total a acestuia, ceea ce permite supra%ie!uirea organismelor afectate doar n condi!ii anaero,e "proces ce nu necesit o'igen&. $naliza genetic a mutantelor petite a permis e%iden!ierea a / clase de mutante7 mutante petite nucleare "de segregare&8 mutante petite neutre " 9+& i mutante petite supresi%e " 9 -- & Mutantele petite nucleare "de segregare& se datoreaz afectrii unor gene cu localizare nuclear. 6le prezint o segregare de tip mendelian7 prin ncruciarea lor cu celule #aploide normale se formeaz celule diploide normale, care n urma procesului de meioz, formeaz asce n care raportul de segregare este de 272 "2:; dintre coloniile #aploide ce se formeaz prin germinarea sporilor %or fi normale, iar < %or fi mutante&. Mutantele petite neutre ' (+) prin ncruciarea lor cu celule #aploide normale se formeaz celule diploide, din care dup meioz, se formeaz spori #aploizi ce %or genera e'clusi% colonii normale "raport de segregare = 7 .&. Mutantele petite supresi*e ' ( -- ) + se datoreaz unor dele!ii e'tinse ale $*+mt. ncrucirile dintre aceste mutante i celulele normaledetermin formarea de diploizi petite i apoi de ascospori mutan!i ce formeaz e'clusi% colonii petite "raport de segregare . 7 =&.

In!ucerea mutantel r petite cu ,r mura !e eti!iu la Saccharomyces cerevisiae M ! !e lucru (entru acest e'periment se folosete tulpina de S. cerevisiae >5 5$, din care se realizeaz o cultur de 28 ore la /.oC pe mediu solid ?(G$. @e prepar o solu!ie de ,romur de etidiu 2. mg:l n ap distilat, din care se plaseaz un %olum de 2. 1l n centrul unei plci (etri cu mediu agarizat. @e nsm)n!eaz cu ansa ,iomasa micro,ian "reprezentat de cultura de S. cerevisiae& n striuri ur)nd ; diametre perpendiculare ale plcii. (lcile se incu,eaz =8 ore la /.oC. *up incu,are, urmeaz analiza plcilor i o,ser%area apari!iei unei zone de in#i,i!ie a creterii, n jurul picturii de ,romur de etidiu. @e ia cu ansa ,iomasa de la marginea zonei de in#i,i!ie i se nsm)n!eaz n spot pe alte plci cu mediu ?(G$, plci ce %or fi folosite ca matri!. (lcile se incu,eaz =8 ore la /.oC. *up incu,are, se realizeaz o replic plating pe plci cu mediu cu glicerol, care se incu,eaz =8 ore la /.oC. @e analizeaz plcile identific)ndu se mutantele petite. Me!ii $i s lu"ii Mediu ?(G$ @olu!ie de ,romur de etidiu 2. mg:l n ap distilat Mediu cu glicerol 2 A e'tract de drojdie, 2 A pepton, .,2 A glucoz, ; A glicerol.

Lucrri practice B Genetic METODE DE INDUCERE A -OLI-LOIDIEI CU AGEN.I MUTAGENI C/IMICI METODA COLC/ICINIZ0RII Cezultate ,une n inducerea poliploidiei "mrirea setului complet de cromosomi& la plante, s au o,!inut prin tratarea semin!elor sau a plantelor aflate n diferite faze de %egeta!ie cu o gam %ariat de su,stan!e c#imice. Dnii autori "M. @imonet i M. Guinoc#et, 2B/B&, au mpr!it su,stan!ele c#imice, dup tipul lor de ac!iune, n dou mari grupe7 a) @u,stan"e !e tipul c lc1icinei care ac!ioneaz asupra fusului celular a crui acti%itate este in#i,at. Colc#icina poate in#i,a formarea fi,relor fusului de di%iziune sau poate ,loca migrarea cromosomilor ataa!i la fi,rele fusului n cursul mitozei sau meiozei. Cromosomii sunt ,loca!i n metafaz, astfel c ei nu mai pot migra la poli. Ca urmare, celulele nu se mai di%id dar numrul de cromosomi crete "se du,leaz&, rezult)nd astfel celule poliploide. ,) 2u,stan"e cu ac"iune !e tipul p&!icl r ,en3enului , care nu ,loc#eaz cromosomii n metafaz, ci produc o pertur,are n procesul de formare a mem,ranei nucleare, astfel c apar celule cu ;, /, = nuclei, din care, prin fuzionare pot apare celule poliploide. METODA COLC/ICINIZ0RII Cele mai ,une rezultate n inducerea artificial a poliploidiei, au fost o,!inute cu ajutorul colc#icinei un alcaloid e'tras din ,r)ndua de toamn "Colchicum autumnale&. *in punct de %edere c#imic, colc#icina este un metil eter de colc#icin, su,stan! care e'ist n ; forme tautomere7

(rin metilarea gruprii 3E de la inelul C al colc#icinei, rezult ; forme izomere de metil eter7 colc#icina i izocolc#icina.

@tudiul efectului acestor izomeri asupra plantelor de Allium cepa, a artat c izocolc#icina are o ac!iune de 2.. de ori mai redus dec)t colc#icina n inducerea C mitozelor. (rin nlocuirea grupului acetil amid cu un grup metil amino rezult un compus numit colcemid, care este la fel de acti% dar mai pu!in to'ic pentru celulele animale. @u, influen!a colc#icinei, di%iziunea celular mitotic se modific, ea mai fiind denumit C mitoz sau colc#imitoz "-a,el 2, 4igura 2&. La plante C mitoza se desfoar astfel7 su, influen!a colc#icinei, fusul celular este inacti%at i are loc o nt)rziere a di%iziunii centromerului. n acelai timp, se constat c replicarea cromosomilor i separarea lor n cromatide nu este afectat de colc#icin. Ta,el 4# De se,irea ntre mit 3a n rmal $i C& mit 3a MITOZA NORMAL0 4# -RO5AZA nucleul prezint un aspect difuz, granulat8 forma unor filamente su,!iri, %izi,ile n nucleu8 de%in mai scur!i i mai groi ca urmare a spiralizrii lor. n profaza t)rzie, au loc urmtoarele trei fenomene7 dispar nucleolii8 mem,rana nuclear de dezintegreaz8 apare fusul de di%iziune, n urma migrrii spre poli a centriolilor i formrii fi,relor. :# META5AZA Cromozomii ,icromatidici se ataeaz la fi,rele fusului de di%iziune cu centromerului8 :# C& META5AZA Cromosomii apar rsp)ndi!i n ntreaga Cromatidele surori sunt rsucite numai n C& MITOZA 4# C& -RO5AZA +u sunt deose,iri fundamentale fa! de E6cep"ie 7 n 8urul cr m s mil r nu se 3 n clar caracteristic#

cromozomii ncep s se condenseze, a%)nd profaza normal. n timp ce profaza a%anseaz, cromozomii 9 rmea3

ajutorul celul 8

 ei

migreaz

spre

centrul

celulei, regiunea @u,

centromerului, influen!a

forma!iuni acti%itatea

distri,uindu se n planul ecuatorial al fusului caracteristice literei F 8 mitotic, form)nd placa metafazic.8 colc#icinei, centromerului i a fusului este n#i,at, fapt pentru care di%iziunea regiunii centromerice este nt)rziat mai multe ore 8 Ca urmare, are loc o prelungire a perioadei dintre ruperea mem,ranei nucleare i cli%area centromerului, frec%en!ei ceea ce determin n mrirea metafaz. a$a&numit celulelor aflate

C lc1icina pr * ac ast9el ;# ANA5AZA @epararea cromatidelor surori prin cli%area spre polii opui ai fusului de di%iziune. Cromozomii de%in monocromatidici. acumulare de metafa e! ;# C& ANA5AZA

Caracteristic pentru aceast 9a3 este 9aptul c pr cesul !e cli*are nu are l c simultan ci ntr&un timp mai n!elungat# Ast9el !i*i3iunea cr m s mil r este nt<r3iat $i !esincr ni3at# C anafaza fundamental de pseudoanafaz&. =# C& TELO5AZA Cromosomii sunt str)ni la un loc fiind nc#ii ntr un nucleu de restitu!ie care con!ine o *ac influen!a colc#icinei se men!ine, este cea astfel normal deose,it "este o

longitudinal a centromerilor i deplasarea lor !ispunerea paralel a cr m s mil r 9ii $i

=# TELO5AZA Cromozomii monocromatidici ajung la polii opui ai fusului de di%iziune. fiecrui grup de cromozomi. reorganizeaz i cromozomii se despiralizeaz.

Mem,rana nuclear se reface n jurul cantitate du,l de material nuclear "= n&. 4usul de di%iziune dispare, nucleolii se celulele de%in 8 n, 2G n etc.

5ig# 4# Repre3entarea sc1ematic a !i*i3iunii celulare n rmale $i su, in9luen"a c lc1icinei '!up Raicu $i c la,#% 4>?;) @u, influen!a unui tratament prelungit are loc o mrire continu a gradului de ploidie a celulelor. *e e'emplu la ceap "Allium cepa& ";n H 2G&, s a constatat c, dup 0; de ore de tratament, celulele a%eau un numr de ;5G cromosomi, adic de 2G ori mai mult dec)t cel normal "Le%an, 2B/8&. n !esutul colc#icinizat se gsesc at)t celule cu grad mare de ploidie c)t i celule diploide normale care au nceput doar s intre n di%iziune. 6fectul colc#icinei este re%ersi,il, dup eliminarea colc#icinei are loc un fenomen de refacere a fusului celular re%enindu se la mitoze normale. Colc#icina afecteaz de asemenea di%iziunea reduc!ional. *atorit to'icit!ii reduse i a efectului su puternic asupra di%iziunii celulare, colc#icina este folosit pentru inducerea poliploidiei la plante i pentru ,locarea celulelor n metafaz la animale.

-r t c l !e lucru (entru inducerea poliploidiei la ceap se folosete zona meristematic a rdcinilor. Irfurile rdcinilor se imerseaz ntr o solu!ie de colc#icin de .,2 .,; A, timp de 2 sau ; zile. *up tratament se spal rdcinile tratate cu colc#icin i se o,ser% la microscop, prezen!a fenomenului de poliploidie "du,larea numrului de cromosomi n compara!ie cu cel normal&. -reparatele micr sc pice se fac prin etalarea materialului ,iologic ntr un strat su,!ire, format dintr un singur r)nd de celule, dup metoda sJuas#. n mijlocul unei lame se pune o pictur de carmin acetic i por!iunea colorat din %)rful rdcinii "2 ; ml&8 peste aceasta se pune o lamel "uns cu al,umin glicerinat i trecut repede prin flacr pentru coagularea al,uminei, care are rolul de a mpiedica dispersarea cromosomilor n celul&8 lamela se lo%ete cu un ,e!ior de lemn pentru etalarea materialului8 cu o #)rtie de filtru se a,soar,e e'cesul de carmin acetic.

5ig# 4# Repre3entarea sc1ematic a !i*i3iunii celulare n rmale $i su, in9luen"a c lc1icinei '!up Raicu $i c la,#% 4>?;