Citogenetica:

-analiza cromozomilor metafazici

/nuclei interfazici.
Citogenetica

• Studiul cromozomilor si a anomaliilor

cromozomiale:
- in metafaza /interfază (FISH)
- Normal 46 cromozomi: 22 perechi
cromozomi somatici +2 cromozomi sexuali XX
sau XY
Citogenetica
1/3 din sarcini sunt avortate spontan
• Până la 50% din avorturile de trim I au ca etiologie
o anomalie cromozomială
0,6% din n.n. vii sunt purtători ai unei aberaţii
cromozomiale
Retard mental/ prezenţa de malformaţii congenitale
multiple
Anumite tipuri de cancere
• Prezenţa a 3 sau mai multe avorturi spontane →
analiza cromozomilor la genitori
Cariotip – ordonarea
cromozomilor metafazici în
funcţie de mărime, poziţia
centromerului , prezenţa
constricţiilor secundare şi a
sateliţilor şi a altor caracteristici
morfologice
Scala micrometrică pt. măsurarea lungimii
cromozomilor
Morfologia cromozomului
ADN
Secventa
repetata telomer
(TTAGGG)n (p-) braţ scurt
Secvente
repetate centromer
(ADN
satelit)
(q-) braţ lung
cromatida
Secvente repetate in
fiecare telomer de
800-1600ori
ttagggttagggttaggg
Secvente ||||||||||||||||||
repetate telomer
aatcccaatcccaatccc
(TTAGGG)n
…
 Telomere
 Extremitățile cromoz.
 Mențin integritatea
cromozomilor 8000

 Acțiunea unei enzime -

telomeraza Telomere
3000
 Scăderea lungimii Length
In base pairs
telomerelor și a
numărului de repetiții
1500
sunt importante în Human
îmbătrânirea și Blood Cell
moartea celulară. 0 35 65
Metode de cariotipare
• Tipuri de ţesuturi utilizate
– făt/embrion: amniocenteză
biopsia de vilozităţi coriale

10ml lichid amniotic obţinut prin amniocenteză.

– Adult : sânge periferic (limfocite)

celule din mucoasa bucală
fibroblaste
celule din măduva osoasă
 Metode de cariotipare
• 5 ml of sânge recoltat pe heparină.
/10ml lichid amniotic obţinut prin amniocenteză.
• Etapă de centrifugare în vederea obţinerii unui
sediment celular
• Cultivarea celulelor pe medii de cultură speciale în
prezenţa antibioticelor şi a unor stimulente mitotice
care stimulează intrarea celulelor în diviziune
(fitohemaglutinina).
• Oprirea diviziunilor celulare în metafaza prin
adăugarea colchicinei (distruge fusul de diviziune).
• Tratarea celulelor cu sol hipotone şi sol. fixator;
• Suspensia celulară este întinsă pe o lamă;
• Colorarea preparatelor metafazice cu sol Giemsa şi
vizualizarea lor la microscopul optic.
 METODĂ
Pregătirea mediului de cultură RPMI 1640
• Colectare pe heparină a 10ml sânge
• Introducera în cultură
8 ml mediu de cultură
0.1 ml PHA-M
0.5 ml sânge
2 ml of ser autolog sau ser fetal de viţel
• Cultivarea celulelor prin introducerea la incubator
la 37C pentru 72 ore

Oprirea diviziunilor in metafază cu colchicină (1-2h)

;
METODĂ…
Introducerea în cultură
• Inhibitorul fusului – Colchicină/colcemid
(0.1g/ml)
• Soluţii hipotone – 0.075M KCl
• Fixare (3:1 methanol : acetic acid)
• Prepararea lamelor
• Colorare lame cu sol. 4% Giemsa pentru
20-25min
• Selectarea preparatelor metafazice în vederea
analizei
• Obţinerea cariotipului
Clasificarea cromozomilor
• Cromozomii metafazici sunt numerotaţi de la 1-22 în
ordinea descrescătoare a taliei
• cromozomi mari: 1-5
• cromozomi mijlocii: 6-18, X .
• cromozomi mici: 19-22, Y

Braţul scurt
p

Centromer q
(braţul lung)
Clasificarea cromozomilor în funcţie de
poziţia centromerului
I.C = (p/p+q)x 100 - indice centromeric

r = q/p -Cz. Metacentrici: 1,3,6,16,19,20;

-Cz.submetacentrici: 2,4,5,7-12,17,18, X;
-Cz.acrocentrici: 13-15, 21,22,Y
 Cromozomii sunt identificați în funcție de mărime,
poziția centromerului și pattern-ul de bandare
Clasificarea cromozomilor în 7 grupe
Mari, metacentrici

Mici,metacentrici

Mijlocii,
acrocentrici

Mici, acrocentrici

Restul-
submetacentrici
 Metode de bandare
Clasificarea cromozomilor în
funcţie de:
• 1. talie
• 2. pattern de bandare
• 3. poziţia centromerului

Pe braţele cromozomilor se
evidenţiază o succesiune de
benzi clare în alternanţă cu
benzi net colorate a căror
succesiune şi tip sunt
caracteristice unei specii.
 Examinarea citogenetică clasică
• Celule în interfază
– Corpuscul Barr (cromatina
sexuală)
• Cromozomi metafazici
- tehnica iniţială
- Bandarea G
- Bandarea R
- Bandarea C
– Bandarea Q
– Bandarea NOR
(azotat de Ag)
 Eucromatină şi Heterochromatină
• Cromozomii pot fi identificati pe baza modelului de
benzi obţinut în urma tratării preparatelor
cromozomiale prin metode fizico-chimice , enzimatice
şi colorării cu coloranţi specifici ADN-ului;
• Modelele de benzi sunt caracteristice unei perechi şi
identice la cei 2 omologi; .
• Se pot folosi diferite metode de bandare în funcţie de
regiunea pe care dorim să o evidenţiem;
• Benzile întunecate se găsesc de obicei în regiunea
centromerică şi telomerică sau în alte regiuni şi
reprezintă zone unde fibra de cromatină este
puternic condensată (heterocromatină).
• Benzile slab colorate reprezintă zone cu eucromatină.
 Cromozomi metafazici
Benzile clare
Short arm Replicare precoce în faza S
p (petit)
Cromatina mai puțin condensată
Gene active transcripțional
Densitate genică crescută si bogate în GC

Benzile (G) întunecate

Replicare tardivă în S
Fibra de cromatină este condensată
Bogate în AT

Centromer
Centromerul conţine o secvenţa de 171pb repetată
de 100000 ori denumită secvenţă alpha satelit
Long arm
q
q
Telomere
Telomere
 Metode de bandare
Se folosesc preparatele cromozomiale obţinute prin tehnica clasică
•Cromozomii sun supuşi unor tratamente termice, cu
acizi/baze/tratamente enzimatice şi coloraţi cu diferiţi coloranţi.

Metode citogenetice clasice

• Metoda de bandare G – Soluţie Giemsa; evidenţiază

heterocromatina, regiunile de ADN bogate în A-T
• Bandarea Q – substanţe fluorescente (Fluoresceina); benzile Q ~
benzilor G;
• Bandarea R – benzi de reversie benzilor G; evidenţiază telomerele şi
eucromatina; bogate in G-C
•Bandarea C-pt zona centromerică
•Bandarea NOR pt regiunile organizator nucleolar de la nivelul
constricţiilor secundare ale cromozomilor acrocentrici.

Cariotipare moleculară
Factori care influenţează apariţia
benzilor
• Gradul de condensare a fibrei de
cromotină;
• Bogăţia în perechi de baze A-T (în
bandarea G /Q) şi respectiv G-C (în
bandarea R);
• Distribuţia proteinelor de-a lungul
cromozomilor.
Definiţii:
• Banda = segmentul cromozomial bine
diferenţiat de segmentele învecinate prin
intensitatea coloraţiei,
• Regiunea = segmentul de cz. cuprins între
2 puncte de reper adiacente;
• Reper = trăsătură morfologică constantă a
cz: centromerul, telomerele sau unele
benzi net colorate.
Bandarea Q
Bandarea G
 Microscopia tradiţională
METAPHASE

x100 x1000
Aranjarea cromozomilor in cariotip
Bandarea R
Bandarea C
Metaphase chromosomes
Karyotyped chromosomes
Tehnica citogenetică clasică
Mărire (1000x) .
Identificarea fiecărui
cromozom pe baza mărimii/
modelului de benzi.

~800- 1000 benzi /set

diploid.
 Metode de bandare
Fiecare braţ este Fiecare
Numerotarea împărţit în regiune este
cromozomilor regiuni a căror împărţită în
de la 1-22+X/Y benzi a căror
numerotare se
face de la numerotare se
centromer către face de la
extremităţi centromer
către
extremităţile
• Examplu-1q24. regiunii

cromozomul 1, braţul q, regiunea 2,

banda 4
 Nr. total de gene situate pe cromozomul 17: 723
373 gene situate în regiunea 17q21; sunt indicate 20 dintre acestea

FZD2
AKAP10
ITGB4
KRTHA8
WD1
SOST
MPP3

MLLT6

STAT3
BRCA1 breast cancer 1, early onset
GFAP
NRXN4
NSF
NGFR
CACNB1
HOXB9
HTLVR
ABCA5
CDC6
ITGB3
Chromosome 17
source: Human Genome Project
Heterocromatină vs
Eucromatină
Cromozomi în metafază, prometafază și profază
tardivă
 High Resolution G banding

High
Resolution

400-500 bands 550-600 bands

800-580 bands
per haploid set per haploid set
per haploid set

• Fiecare bandă conține aproximativ 5000-10000 kb

Diferite tipuri de rezoluţii în analiza citogenetică

18
7
 Avantaje şi dezavantaje ale tehnicii
clasice de cariotipare

• Avantaje
1- permite vizualizarea tuturor cromozomilor;
2- Adecvată când se suspectează o anumită
anomalie cromozomială ( ex. Cromozomul
Philadelphia în CML ).
• Dezavantaje
1- Depistează anomalii cromozomiale majore
( o bandă = 6Mpb ~ 150 genes ).
2- Tehnică laborioasă care necesită un personal
cu multă experienţă
FISH
 Fluorescence in situ
hybridization (FISH)
• Metodă moleculară de
analiză a cz. cu
sensibilitate şi
specificitate crescută.
• Probă de ADN marcată
fluorscent ~40 kb. Utilă
pt. a depista deleţii
genice sau anomalii
cromozomiale de mici
dimensiuni care sunt
dificil/imposibil de
identificat prin analiza
citogenetică clasică.
47, XXY
• FISH pe cromozomii
metafazici
• FISH folosind nuclei
FISH (fluorescent in situ hybridization)
Probe locus specifice

Probe Centromerice

ADN ţintă
denaturare

hibridizare

probe

painting probes M-FISH

Proba locus-specifică hibridizează cu o secvenţă unică de pe un
anumit cromozom. Proba este marcată prin încorporarea în
structura unui anumit nucleotid (Ex: timina) a unei substanţe
flurescente (fluoresceină, Texas-red, rodamină etc.).
Numărul punctelor fluorescente dintr-o metafază indică
numărul punctelor de hibridizare.
Fluorocromi:

• DAPI (4',6-diamidino-2-fenillindol)

• PI (iodura de propidium )

• Quinacrina

• Bromură de etidiu
Etapa 1: denaturarea dublului helix al ADN-ului probei şi al
cromozomilor metafazici /interfazici în vederea obţinerii de
monocatene prin încălzire la temperaturi ridicate într-o
soluţie de formamidă.
Etapa 2- se adugă proba peste lama cu cromozomii metafazici
obţinuţi prin tehnica clasică. Lama se acoperă cu o lamelă
pentru a împiedica evaporarea şi se introduce la incubator la
37C în vederea obţinerii unei reacţii de hibridizare probă-
secvenţă monocatenară cromozomială; numărul punctelor
fluorescente obţinute indică locul hibridizării.
.
Microscopul cu
fluorescenţă

Principal of
fluorescence:

excitation of electron
Tipuri de probe utilizate în metoda
FISH

telomere

centromere

whole chromosome paint

locus
FISH

Cromozomii metafazici
sunt coloraţi cu DAPI, o
substanţă fluorescentă ce
se leagă de ambele catene
de ADN
Probe locus specifice – depistarea
deleţiilor în regiunea SRY
Sindroame de
Microdeleţie: probe
locus Specifice
-diagnosticul
microduplicaţiilor/
translocaţiilor
Sdr. Williams: deletia 7q11.23
Citogenetică moleculară pentru
diagnosticul microdeleţiei pe 7q11.23
180 kb

ELN LIMK1 D7S613

CENTROMER TELOMERE
E

 LOCUS SPECIFIC PROBE FOR

THE CRITICAL REGION
ELN/LIMK/D7S613
– (labeled with the Spectrum
Orange, red signal)
 CONTROL PROBE D7S522
– (labeled with the Spectrum
Green, green signal)
Fluorescence in situ hybridization (FISH)
I. Sdr de microdeleţie
Cri-du-chat (5p-).
Miller-Dieker syndrome (7q11.23).
Smith-Magenis syndrome (17p13.3).
Steroid Sulfatase Deficiency (Xp22.3).
DiGeorge/Velo-cardio-facial/CATCH-22/ Shprintzen
Syndrome (22q11.2).
Kallman Syndrome (Xp22.3).
Williams Syndrome (7q11.23).
Wolf-Hirsch horn (4p-).
Prader-Willi/Angelman Syndrome (15q11.2-13).
X-Linked Icthyosis (xp22.3).
Retinoblastoma (13q14).
Centromere for X chromosome 48,XXXX
 Probă pentru zona centromerică a
cromozomului X: identificarea
cromozomilor marker supranumerari

X
Test FISH

Cariotip probabil:
47,XX,der(X)
mar
FISH: Fluorescent
in situ hybridization Verde =proba pt zona
telomerica a cz. 4

rosu = proba control pentru

zona centromerica a cz.X &
alta proba pentru Xp22.3
Probe locus specifice pentru diagnosticul
sdr. de microdeleţie (22q11.2)

HIRA region on 22q11.2

Verde = probe control în
regiunea subtelemerică a
22q

Se poate confirma diagnosticul de

microdeleţie?
 der 5
9
9
5

der 5

Painting
probes 9
• Translocatii

Figure 8.23Bx
 Metoda FISH pe nuclei interfazici
Se folosesc probe oligonucleodidice marcate fluorecent pt.
diagnosticul aneuploidiilor cromozomilor 13, 18, 21, X, si Y

Nuclei de la
acelasi
produs de
conceptie

verde = cromozomul 13 bleu = cromozomul 18

rosu= cromozomul 21 verde = X
rosu = Y
Probe X şi Y-centromerice

X
Y

Determinaţi formula genetică. 46,XY

 FISH cu probe marcate
corespunzătoare cromozomului Y
Cromozomi metafazici şi
interfazici

FISH pe nuclei interfazici cu probe

pt X marcate cu verde şi pt Y
marcate cu roşu.
Prezenţa de mozaicisme

Mozaicisme gonosomale 47,XYY/46XY/47,XXY

Combinarea utilizării probelor locus-
specifice cu probe centromerice

Verde = probe pt. reg.

centromerică a cz. X
SRY

♂ normal - 46,XY;
Formula genetică?
SRY nu este deletată.
Probe locus- specifice – microdeleția
22q11.2

Semnal roșu = regiunea

HIRA pe 22q11.2
Semnal verde = probă
control pentru regiunea
ARSA (partea
subtelomerică a 22q)

Se confirmă microdeleția?
 Caz: sindromul DiGeorge

Fante
antimongoloide Hipertelorism

Inserția joasă a
Micrognație
urechilor

Defecte cardiaca congenitale (ex. Tetralogia

Fallot), hipoplazia/aplazia timusului
"Painting probes" –examinarea
cromozomilor 1, 4 şi 8

4
1

4
8 1
8

Fără modificări
M-FISH
(SKY)
SKY-cont.
Advantaje:
• Depistarea translocaţiilor.
• Identificarea cromozomilor marker.
• Caracterizarea rearanjamentelor cromozomiale
complexe.
Dezavantaje:
• Echipament costisitor.
• Tehnică laborioasă.
• Nu detectează rearanjamentele structurale ce
interesează un singur cromozom.
• Rezoluţie scăzută ( 15 Mpb ).
• Nu ca metodă de screening; de utilizat doar în situaţii
speciale.
Cromozomul"Philadelphia "
Translocatie 9:22
 Analiza citogenetică în cancer
În cercetarea oncologică un aspect important îl reprezintă
evidențierea modificărilor citogenetice asociate unui tip particular
de cancer și relația între punctele de ruptură implicate într-un
rearanjament cromozomial și poziția unor oncogene

 Celulele neoplazice sunt caracterizate de rearanjamente

cromozomiale multiple, unele dintre ele fiind frecvent identificate
într-un tip particular de cancer.

 Asocierea analizei citogenomice și genomice cu tipul tumoral și

eficiența terapiei sunt actual etape importante în managementul
pacienților neoplazici.
 Translocații caracteristice în neoplasmele
umane
Neoplasm Traslocație Procent din Proto-oncogene
cazuri afectate
Limfomul Burkitt t(8;14)(q24;q32) 80%

t(8;22)(q24;q11) 15% MYC

t(2;8)(q11;q24) 5%

Leucemia mielocitară cronică (9;22)(q34;q11) 90%-95% BCR-ABL

Leucemia limfocitară cronică t(9;22)(q34;q11) 10%-15% BCR-ABL

Leucemia limfoblastică acută t(1;19)(q23;p13) 3%-6% TCF3-PBX1

Leucemia promielocitara acută t(15;17)(q22;q11) ~95% RARA-PML

Leucemia limfocitară cronică t(11;14)(q13;q32) 10%-30% BCL1

Limfomul folicular t(14;18)(q32;q21) ~100% BCL2

Indicaţii ale utilizării metodei FISH?
• Materialul celular nu conţine cromozomi
metafazici
– Insuccesul cultivării
– Imposibilitatea cultivării celulelor/ necesitatea unui dg.
rapid (dg. genetic de preimplantare, obţinerea unui
dg. prenatal rapid, examinarea tumorilor solide)
• Analiza rearanjamentelor cromozomiale
complexe
• Identificarea cromozomilor marker
• Diagnosticul rearanjamentelor cromozomiale
criptice (submicroscopice)
– Sindroame de microdeleţie/microduplicaţie etc
Comparative Genomic Hybridization
(CGH)

• Metodă de citogenetică moleculară ce permite a

depista doar modificări cantitative (aberaţii
cromozomiale neechilibrate, respectiv nr. de copii
ale unor secvenţe ADN) şi nu aberaţii
cromozomiale echilibrate (inversii, translocaţii);
• Permite a scana întregul genom ( genome wide
scanning);
• Metodă obiectivă comparativ cu bandarea clasică
Citogenetică moleculară: CGH
• ADN-ul pacientului şi ADN-ul control este marcat cu
fluorescenţi diferiţi (contrast de culoare)
• ADN-ul pacientului şi ADN-ul control sunt simultan
hibridizate pe un preparat metafazic normal;
• Predominenţa relativă a uneia sau altei culori
(intensitatea fluorescenţei) permite a face aprecieri
cantitative ale ADN-ului pacientului comparativ cu
cea a cazului control la nivelul cromozomilor.
• Analiza vizuală şi digitală a cromozomilor.
- FISH cantitativ în 2 culori -
Comparative Genomic Hypridization (CGH)
Metodă:
• Izolarea ADN-ului genomic
• Digestia ADN-ului
• Marcarea ADN-ului pacientului şi
ADN-ului control;
• Hibridizare
• Spălare posthibridizare;
• Scanarea reacţiilor şi analiza datelor.
Comparative Genomic Hybridization(CGH)
Folosit iniţial pt.
diagnosticul
cancerului
(Kallioniemi
1992)
Ulterior pentru
diagnosticul
aberaţiilor
cromozomiale
pre- şi postnatal
Screening-ul
întregului
genom
Design-ul metodei
• Rezoluţia metodei depinde de mărimea
secvenţei şi spaţiul dintre ele;
• Depistează doar aberaţii cromozomiale
neechilibrate
• Creează un “cariotip molecular ”;
 Indicaţii ale CGH
• Aberaţii congenitale multiple
• Deficitul creşterii/ retard mental de
etiologie necunoscută
• Cariotip normal dar există un sindrom
cromozomial suspectat
September 28, 2010

Colegiul American al Geneticienilor Clinicieni

recomandă înlocuirea cariotipului clasic cu
analiza Microaaray-CGH ca metodă de primă
linie în diagnosticul genetic postnatal
Septembrie 2010
 Indicaţii pentru analiza
cromozomilor postnatal
• Suspiciunea existenţei unei anumite anomalii
cromozomiale din cadrul unui sindrom;
• Anomalii congenitale multiple sau întârzierea
creşterii;
• Retard mental;
• Disgenezie gonadală
• Infertilitate. Avorturi spontane repetate
• Mortalitate perinatală;
• Anumite tipuri de cancere