GAVRIL RADU SEBASTIAN STUDENT DOCTORAND ANUL I

TE H N O LO G IA PC R Definire. Generaliti. Reactia de polimerizare in lant PCR (polimerase chain reaction) are la baza o tehnologie in vitro care imita capacitatea naturala de replicare a ADN si care consta in generarea rapida a unor copii multiple a unei secvente nucleotidice tinta (ADN sau ARN) dintr-o gena de interes sau un patogen specific; produsul amplificat PCR este apoi detectat prin diverse metode. Numarul de copii ale secventei tinta creste exponential cu fiecare ciclu de amplificare, deoarece fiecare secventa nucleotidica nou sintetizata constituie o matrita pentru o noua copie. Produsul PCR care reprezinta o copie a ADN/ARN tinta original este denumit amplicon. Aceasta metoda permite detectarea cu specificitate foarte mare a unor concentratii foarte scazute ale secventei tinta. Amplificarea se realizeaza intr-un analizor special (thermal cycler), iar amestecul de reactie trebuie sa contina urmatoarele elemente: - ADN sau ARN tinta: extras din proba in cursul etapei de prelucrare; - enzima care faciliteaza sinteza lantului complementar de acid nucleic: ADN polimeraza Taq (izolata din Thermophilus aquaticus) pentru o tinta ADN sau RTth ADN polimeraza pentru o tinta ARN - care are activitate atat de revers-transcriptaza, cat si de ADN polimeraza (permite realizarea in acelasi amestec de reactie, atat a transcrierii inverse a ARN tinta in ADN complementar - ADNc- cat si amplificarea ADNc); - cofactori enzimatici: Mg2+ si/sau Mn2+; - primeri (P1 si P2): secvente scurte, monocatenare, cu lungimea maxima 20-30 nucleotide, care se leaga de o matrita monocatenara prin imperecherea complementara a bazelor; servesc ca punct de plecare pentru sinteza lantului complementar cu ajutorul ADN polimerazei, marcand inceputul si sfarsitul regiunii care trebuie sa fie amplificata; - deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP si dUTP): folosite pentru sinteza noii catene ADN prin atasarea lor la capatul primerilor, complementar cu matrita (observatie: ampliconul va contine deoxiuridina in loc de o deoxitimidina, deosebindu-l de ADN nativ); - amperaza: enzima care promoveaza amplificarea selectiva a tintei si distrugerea produsilor de contaminare din cursul reactiilor de amplificare anterioare; catalizeaza clivarea ADN-ului care contine deoxiuridina la inceputul primului ciclu de amplificare si nu degradeaza ADN-ul sau ARN-ul tinta.

Reactia PCR se desfasoara in 3 etape: 1. Denaturarea: in urma incalzirii amestecului de reactie la 94C, ADN-ul tinta este separat (denaturat) in 2 catene; 2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scaderii temperaturii la 55-70C, primerii se vor atasa complementar la capetele 3 ale celor 2 catene; 3. Elongatia: la temperatura de 72C, ADN polimeraza termostabila in prezenta Mn2+ si a excesului de deoxinucleotid-trifosfati (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina si deoxiuridina) va extinde primerii atasati in lungul matritei tinta si va produce un amplicon ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pentru un numar stabilit de cicluri (de obicei 30-35), la fiecare ciclu dublandu-se cantitatea de amplicon ADN. Componentele reaciei a) Matria ADN. De cele mai multe ori, ntr-o reacie PCR se introduc molecule de ADN d.c. linear/circular ce include secvena de amplificat. Puritatea ADN introdus ca matri reprezint un parametru important pentru succesul unei reacii PCR. De exemplu, cantiti mari de ARN dintrun extract ADN pot chelata ionii de Mg++, determinnd astfel o activitate sczut a ADN polimerazei. Pe de alt parte, o serie de contaminani din extractul ADN pot inhiba aciunea ADN polimerazei. Cantitatea de matri ADN introdus ntr-o reacie PCR influeneaz puternic performana reaciei. Cantitile recomandate pentru o reac ie PCR standard sunt: maximum 500 ng pentru ADN genomic uman, 1-10 ng ADN bacterian, 0.1-1 ng ADN plasmidial. Cantitatea ADN trebuie ns corelat cu numrul de copii de secven matri, aceasta depinznd de complexitatea moleculelor de ADN. Astfel, pentru un plasmid de 4 kbp din care trebuie amplificat o secven de 1 kbp, secvena matri reprezinta 25% din ADN introdus n reacie. In timp ce, o secven tot de 1 kbp, dar dintr-un ADN genomic uman (specia uman avnd un genom de aproximativ 3.3 x 109 bp), reprezint doar 0.00003% din ADN introdus n reacie. Ca urmare, pentru a avea acelai numr de secvene matri, trebuie introdus o cantitate de aproximativ 1 milion de ori mai mare n cazul ADN genomic uman. Ca recomandare general, se porne te cu un minimum de 104 copii de secven matri pentru a obtine un semnal ntr-o reacie PCR de 25-30 cicluri, avnd ns grij ca, concentraia final de ADN n amestecul de reacie s fie mai mic sau egal cu 10 ng/l.

b) primerii oligonucleotidici. In general, dimensiunea primerilor folosi i n reaciile PCR este cuprins ntre 15 i 30 bp i, de obicei, sunt complementari cu capetele 5 i, respectiv, 3 ale regiunii ce urmeaz a fi amplificat . Se recomand ca primerii s aib un procent molar de guanin + citozin (% mol GC) cuprins ntre 40 60% i s aib o distribuie echilibrat a domeniilor bogate n A/T i G/C. Este recomandabil ca cei 2 primeri s aib valori Tm care s permit temperaturi de ataare ntre 55 i 65oC (pentru specificitate maxim s e folosesc temperaturi de 62-65oC). Pe de alt parte, este ideal ca cei 2 primeri s aib valori Tm identice sau foarte apropiate i s nu prezinte secvene cu complementaritate intracatenar (i care, deci, s determine structuri secundare interne). Totodat, pentru a se evita dimerizarea primerilor, este necesar ca primerii s nu fie complementari unul cu celalalt. In general, concentraiile optime ale primerilor ntr-o reacie PCR sunt cuprinse ntre 0.1 i 0.6 M. Intr-o reacie PCR, un parametru important l repezint temperatura de ataare a primerilor la matria ADN (primer annealing temperature). Astfel, n cazul primerilor cu valori ridicate de Tm poate fi crescut temperatura de ataare a primerilor. Acest lucru conduce la minimizarea atarilor nespecifice, la reducerea cantitii de dimeri de primeri, precum i la creterea cantitii de produs PCR corect.

c)

ADN polimeraza termostabil In prezent n toate reaciile de tip PCR se introduc ADN polimeraze

termostabile. Variantele naturale ale unor asemnea enzime au fost izolate din microorganisme termofile, care posed echipamente enzimatice cu temperaturi optime ridicate (mai mari de 70oC) i care sunt capabile s desfoare activitile specifice i dup treceri peste temperaturi extreme (n jur de 100oC). In marea majoritate a cazurilor, pornind de la asemenea variante naturale, ADN polimeraze termostabile au fost manipulate genetic (cu obinerea unor variante ameliorate) i clonate n tulpini de E.coli (microorganism ce este mult mai uor de crescut i manipulat dect bacteriile termofile).

In majoritatea experimentelor, cantitatea optim de ADN polimeraz termostabil (sau de amestec de ADN polimeraze) este cuprin ntre 0.5 i 0.25 U / 50 l volum de reacie. Tipuri de ADN polimeraze ADN dependente termostabile a) ADN polimeraze ADN dependente termostabile din clasa Taq 1) ADN polimeraza Taq Dezvoltarea foarte mare a tehnologiei PCR, precum i a aplicaiilor sale se datoreaz n bun masur, nlocuirii n asemenea tehnici, a fragmentului Klenow-ADN pol I izolat din E.coli cu o ADN polimeraz termostabil izolat din Thermus aquaticus i denumit Taq pol.

Prima specie molecular de Taq pol izolat (n anii 1976-1980) avea o greutate molecular de aproximativ 70 KDa i o activitate specific de 2000 uniti/mg. Ulterior (n 1989), a fost izolat o alt specie molecular de Taq pol, cu o greutate molecular de 94 KDa i cu o activitate specific de 20.000 unit i/mg. Aceast enzim are temperatura optim de 75-78 oC, iar la temperaturi de peste 90oC activitatea sa scade semnificativ. La temperatura optim, o molecul din aceast enzim polimerizeaz aproximativ 150 nucleotide/sec. In afar de activitatea de polimerizare (n direcia 5-3), aceast specie molecular de ADN polimeraz, mai are i activitate exonucleazic n aceeai direc ie cu cea de polimerizare (5-3). Nu are ns activitate exonucleazic n direcie invers polimerizarii (3-5 activitate enzimatic ce asigur funcia de citire i incorporare corect a nucleotidtrifosfailor - proofreading), astfel nct fidelitatea incorporrii depinde strict de concentraia dNTP n amestecul de reacie. Analizele moleculare au demonstrat ca Taq pol prezint similaritate de secven a aminoacizilor cu ADN polimeraza I din E.coli, mai ales n treimea dinspre captul amino-terminal, domeniu care la E.coli ADN pol I este responsabil de activitatea exonucleazic 5-3. Taq pol permite realizarea de reacii PCR n 3 trepte de temperatur (Fig3.31), n care denaturarea moleculelor de ADN d.c. se realizeaz la 90-

95oC, ataarea primerilor la 55-60oC, iar polimerizarea la 72-75oC. 2) ADN polimeraza Ampli-Taq. Aceast enzim este o ADN polimeraz

recombinant obinut prin exprimarea unei forme mo dificate a genei pentru Taq pol n E.coli. Activitatea optim a acestei enzime se desfoar n rangeul de temperatura la care are loc i ataarea stringent a primerilor (5575oC, cu maximumul la 60oC). Ca urmare, folosirea acestei enzime simplific reacia PCR de la 3 trepte de temperatur la 2 trepte (Fig 3.32): 95 oC temperatura la care se realizeaz denaturarea ADN d.c., 60oC ataarea primerilor i polimerizarea. Pe de alta parte, Ampli-Taq pol are o stabilitate mult mai mare la temperaturi de peste 90oC, fa de Taq pol, a crui activitate enzimatic scade semnificativ cu fiecare trecere peste 90 oC. In plus, Ampli-Taq pol are i activitate exonucleazic n direcie 3-5, ceea ce determin ca aceast enzim s prezinte o mult mai mare specificitate de citire i de incorporare. 3) ADN polimeraza Ampli-Taq fragmentul Stoffel este reprezentat de Ampli-Taq din care a fost scos un fragment de 290 aminoacizi de la capul N-terminal. Fragmentul excizat este responsabil de activitatea exonucleazica n directie 5 3, i deci, Stoffel-AmpliTaq nu prezint acest tip de activitate, ceea ce, pe de o parte, crete mult viteza de polimerizare, iar pe de alt parte permite o amplificare mai eficient a matrielor circulare (de ex. ADN plasmidial). Este de 2 ori mai termostabil decat Ampli-Taq i i pstreaz activitatea optim ntr-un range mult mai larg de concentraii de Mg++. b) ADN polimeraze ADN dependente termostabile din clasa VENT 1) ADN polimeraza VENT pol este o ADN polimeraz ADN dependent termostabil izolat din Thermococcus litoralis. Aceast bacterie triete n izvoare marine calde, cunoscute n literatura de specialitate sub denumirea de vent-uri. VENT pol desfoar ambele tipuri de activiti exonucleazice(n direie 3-5 i, respectiv, n direcie 5-3). 2) ADN polimeraza VENT pol (exo-) este similar cu VENT pol, dar nu are activitate exonucleazic 5 3. c) ADN polimeraze ADN dependente termostabile din clasa DEEP VENT 1) ADN polimeraza DEEP VENT pol este o enzim izolat dintr-o tulpin de

Pyrococcus (microorganism ce triete n izvoare marine calde de mare adncime). Aceast enzim desfoar ambele tipuri de activiti exonucleazice, dar este mai rezistent dect VENT pol, i dect AmpliTaq pol la temperaturi de 100oC - temperaturi necesare denaturrii matrielor (n mod special la matriele circulare, lungi sau cu % mol GC ridicat). 2) DEEP VENT (exo-) pol este similar cu DEEP VENT pol, dar nu are activitate exonucleazic 5 3. d) ADN polimeraze ambivalente termostabile 1) ADN polimeraza rTth pol este o ADN polimeraz recombinat obinut prin exprimarea unei forme modificate a genei din Thermus thermophilus, n E.coli. Caracterul ambivalent al acestei enzime const n faptul c poate fi folosit ca ADN polimeraz ARN dependent (revers-transcriptaz), n prezena MnCl2, dup care, prin chelatarea ionilor de Mn i adugare de MgCl2, poate aciona ca ADN polimeraz ADN dependent, desfurnd o reacie PCR. In afar de asemenea enzime tipic ambivalente, este de menionat faptul c i alte ADN polimeraze (Taq, Ampli-Taq, Stoffel) prezint i activitate revers-transcriptazic, dar foarte slab. In ceea ce privete concentraia de enzima polimerizatoare, aceasta depinde de tipul de enzim folosita. Pentru ADN polimeraza Taq pol sunt suficiente 1.25 U ntr-un volum de reacie de 50 l (pentru multe aplicaii va fi chiar ntr-un oarecare exces). Cantiti crescute de enzim sau timpi prelungiI de polimerizare nu vor crete semnificativ produsul de reacie, ci vor genera artefacte datorate activitii exonucleazice 5 3 a ADN polimerazei Taq pol (n gelul de verificare vor aprea ca nite benzi mnjite). Un alt parametru important al reaciei PCR este temperatura la care are loc reac ia de polimerizare (extension temperature). Aceast temperatur este determinat de tipul de ADN polimeraz folosit, n general recomandndu-se meninerea timpului de 1 minut pentru fiecare kbp de amplificat.

Ca numr de cicluri, pentru marea majoritate a reaciilor PCR sunt suficiente 25-40 de cicluri. Un alt aspect important n manipulrile genetice ulterioare ale unui produs de reacie PCR l reprezint tipul de capete pe care l genereaz ADN polimeraza respectiv. Astfel, ADN polimeraza Taq pol genereaz capete coezive cu prelungiri 3-A. In timp ce majoritatea enzimelor ce prezint activitateexonucleazic 35 genereaz capete netede.

Marele avantaj al tehnicilor PCR l reprezint faptul c permite obinerea unei cantiti mari dintr-o anumit secven ADN, fr a necesita clonarea acesteia n prealabil ntr-o molecul de tip vector. Pe de alt parte, tehnologia PCR a revoluionat i implicarea geneticii moleculare n domenii n care se apeleaz la cantiti foarte mici de ADN. Asemenea situaii se ntlnesc n : - diagnosticul unor boli monogenice, precum i detectarea de noi tipuri de mutaii n gene importante n anumite boli; - diagnosticul unor infecii umane: permite detectarea particulelor infecioase bacteriene i virale chiar aflate ntr-o proporie mic, chiar pentru specii ce se cultiv dificil in vitro, chiar pentru patogeni cu variabilitate antigenic mare, i chiar pentru patogeni ce au perioad mare de laten; astfel, pot fi identificai indivizii umani pozitivi nainte de seroconversie; - studii privind mecanismele genetice ce acompaniaz procesele maligne (detectarea secvenei i esutului n care se exprim anumite oncogene n diverse procese maligne); - studii de taxonomie, sistematic i filogenie molecular: obinerea rapid a unei cantiti mari din secvene ADN cu valoare taxonomic i/sau filogenetic; - biologia populaiilor, inclusiv la organisme mici: tehnologia PCR permite secvenierea rapid a unor molecule de ADN de la foarte muli indivizi, fr a necesita n prealabil clonarea acestora; - studii de antropologie: tehnica PCR permite n prezent recuperarea i analiza unor secvene

ADN din fosile; - medicin legal: cu ajutorul reaciilor PCR pot fi n prezent analizate la nivel molecular o serie ntreag de probe biologice. In afar de toate aceste aplicaii directe ale tehnologiei PCR, pornind de la reacia iniial de amplificare, au fost imaginate o serie ntreag de variante tehnice ce permit abordarea unor manipulri ct mai acurate a moleculelor de acizi nucleici.

BIBLIOGRAFIE 1. PAUL, William E. Fundamental Immunology. New York, Raven Press, 1989, p. 519. 2. POPESCU, LM, RADU, DL, URSACIUC, C. Imunologie medical: dicionar. Bucureti, Editura Universitar Carol Davila, 2002, pp.4-5. 3. DAVIES, NWS, BROWN, LJ, GONDE, J, et al. Factors influencing PCR detection of viruses in cerebrospinal fluid of patients with suspected CNS infections. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2005;76:82-87. 4. VON HOLST, C, BOIX, A, MARIEN, A, et al. Factors influencing the accuracy of measurements with real-time PCR: The example of the determination of processed animal proteins. Food Control. 2012;24:142-147. 5. WEIDNER, J, CASSENS, U, GHDE, W, et al. An improved PCR method for detection of HIV-1 proviral DNA of a wide range of subtypes and recombinant forms circulating globally. Journal of Virological Methods. 2011;172:22-26.

Gavril Radu Student doctorand anul