HIBRIDIZAREA FLUORESCENTĂ ÎN SITU(FISH)

TEULEA TUDOR-CONSTANTIN
MG II GR.8
Hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) este o tehnică de citogenetică moleculară utilizată în
scopul identificării anomaliilor cromozomiale, numerice și structurale (care nu pot fi detectate
prin cariotipare). Principiul acestei metode constã în atașarea la secvența-țintã a unei sonde de
ADN monocatenar, marcatã fluorescent, pe baza complementaritãții, de o secvențã-țintã a
unui cromozom. Hibridizarea sondei cu ADN-ul celular este vizualizatã la microscopul cu
fluorescență echipat cu filtre de excitație și emisie, ceea ce permite citirea semnalelor
specifice zonei-țintã. Se numãrã și se analizeazã semnalele prezente în o sutã de celule (de
ex., trei semnale fluorescente specifice pentru cromozomul 21 indicã sindromul Down). Mai
multe sindroame dismorfice (sindromul Williams, Prader Willi, Angelman, Di George)
produse de microdeleții sau microduplicații, suspectate clinic, imposibil de observat prin
tehnicile citogenetice convenționale, pot fi evidențiate prin FISH metafazic. Întrucât aceastã
metodã presupune ca primã etapã de lucru obținerea unor culturi celulare (limfocite din sânge
periferic sau amniocite recoltate prin amniocentezã în sãptãmânile 15-17 de sarcinã),
rezultatul investigației este obþinut în două-trei sãptãmâni. FISH-ul interfazic permite punerea
în evidențã a anomaliilor numerice, detecția sexului genetic într-un timp scurt (48-72 h). Se
realizeazã pe nuclei interfazici fãrã sã fie nevoie de efectuarea de culturi celulare. Se folosesc
sonde de ADN corespunzãtoare regiunilor centromerice ale cromozomilor 18, X, Y (CEP18,
CEPX, CEPY), respectiv sonde locus specifice pentru cromozomii 13 si 21 (LSI13, LSI21).
Metoda este mai puțin informativã în cazul contaminãrii cu celule materne (comparativ cu alte
tehnici).
Analiza FISH este o metodã specificã, performantã, dar laborioasã, care necesitã celule
intacte; nu se substituie celorlalte metode de analizã cromozomialã și are indicații foarte
precise. FISH-ul interfazic este indicat a fi folosit ca test de screening rapid atunci când existã
semne de alertã ecograficã sau biochimicã (dublu test, triplu test), iar ulterior se recomandã o
evaluare citogeneticã completã.(1)
Utilizarea sondelor cromozomiale pentru vizualizarea unor cromozomi specifici a aparut încă
din anii 1980. Acum este posibilă scanarea tuturor cromozomilor în culori specifice simultan.
Prin folosirea etichetării combinatorii a cinci culori , se pot atribui combinații specifice de
fluor fiecărui cromozom uman pentru propria semnatura spectrală. Speicher a folosit cinci
fluorofori, o serie de filtre florocrome de înalt contrast, și un program computerizat pentru
detectarea simultană a tuturor celor 24 de cromozomi umani în culori specifice. Eils au propus
strategii pentru optimizarea etichetării sondelor, filtrelor,si analizei imagistice. Această
tehnică a fost numită FISH multicolor, sau FISH multiplex (M-FISH).
Schrock și colaboratorii au introdus scanarea întregului genom uman la emisie spectrală
definită pentru fiecare cromozom, la care s-au referit sub denumiea de cariotipizare spectrală
multicoloră sau SKY. SKY folosește, de asemenea, etichetarea combinatorie, dar în loc de
filtre folosește spectroscopie Fourier și imagini cu dispozitive cuplate (CCD) pentru a măsura
spectrele de emisie. Semnătura spectrală a fiecărui cromozom este tradusă în culori vii cu
ajutorul unui software de calculator. Software-ul M-FISH a devenit disponibil comercial
pentru a fi incorporat în sistemele de captare a imaginilor existente pentru FISH. Un astfel de
sistem (SKY sau M-FISH) este extrem de valoros pentru analiza cromozomilor derivați, a
markerilor și a cariotipurilor complexe.
Unul dintre eforturile intense în citogenetica clinică este identificarea markerilor,
cromozomilor derivați și analiza cariotipurilor complexe, atât pentru tulburările congenitale,
cât și pentru cele hematologice. S-a estimat că recombinările structurale de novo apar cu o
frecvență de 0,70/1000 crescând la 2,411000 în rândul persoanelor cu retard mintal. Frecvența
prenatală a markerilor supernumerari de novo (care include markerul bisatelit 15) este plasată
la 1/2500. Pentru a evalua semnificația lor clinică, este important să se determine originea
markerilor sau a cromozomilor derivați. Eforturile recente pentru o astfel de identificare au
dat roade pentru o serie de markeri identificați prenatal sau postnatal atunci când analiza
cromozomului cu bandă a fost combinată cu sonde FISH specifice pentru centromeri sau
cromozomi specifici. Odată cu apariția SKY, markerii, cromozomii derivați și cariotipurile
complexe au fost analizate cu relativă uşurință. Limitarea este, desigur, incapacitatea de a
detecta inversia, inserția sau delețiile subtile intracromozomiale. Prin urmare, utilizarea
tehnicilor convenționale de bandare rămâne neprețuită, deoarece FISH și alte tehnologii
conexe sunt folosite pentru a le completa.
Rezoluția SKY (și M-FISH) pentru translocarea inserțională pare similară cu sondele de
pictură a cromozomilor întregi, aproximativ 1 megabază. M-FISH a fost introdus de Speicher
pe baza analizei cazurilor normale şi a unei serii de cazuri anormale. M-FISH nu a fost utilizat
pentru practica clinică de rutină, deoarece software-ul și reactivii au devenit disponibili
recent. Software-ul M-FISH este acum disponibil în rândul mai multor companii comerciale.
Timpul de captare și analiză a cariotipului variază între 10 și 20 de minute și nu apare nicio
problemă în procesarea specimenelor. În prezent, costul unui set de sonde M-FISH disponibil
comercial este semnificativ mai mare decât al sondelor de vopsea cromozomiale. M-FISH a
fost folosit și pentru a analiza un cariotip complex din măduva osoasă a unui pacient cu
tulburare hematologică. În acest caz, au fost identificați mai mulți markeri și cromozomi
derivați, inclusiv unul care provine din trei cromozomi. GTG secvențial și sonde individuale
de vopsea, utilizate una sau două la un moment dat, în loc de M-FISH sau SKY, ar fi greoaie
și foarte solicitantă pentru a rezolva astfel de markeri sau cromozomi derivați și cariotipuri
complexe.
M-FISH are însă limitări similare cu SKY. Atât în SKY, cât și în M-FISH, brațele scurte
acrocentrice și secvențele ADN foarte repetitive ale heterocromatinelor constitutive rămân
neetichetate. Cu toate acestea, fluoroforii acrocentrici adesea hibridizează încrucișat cu brațele
scurte acrocentrice în M-FISH. Probleme tehnice suplimentare sunt „grijirea” la punctele de
rupere sau de fuziune din cauza suprapunerii combinațiilor de tluorofori ale diferiților
cromozomi. Unele combinații cronozomale rare pot genera și probleme de interpretare. De
exemplu, la punctele de joncțiune ale cromozomilor 3 (aqua) și S (auriu și roșu îndepărtat),

fluoroforii combinați sunt identici cu cromozomul 10 (aqua, auriu și roșu îndepărtat). Acest
lucru poate genera erori interpretative. Aceste probleme pot fi însă rezolvate, prin utilizarea
sondelor individuale de vopsea cu cromozon. Îmbunătățirile viitoare ale reactivilor și
software-ului pot aborda unele dintre aceste probleme mai eficient. Au fost întâlnite și alte
probleme tehnice: hibridizarea pentru M-FISH trebuie să fie optimă, deoarece distincția
specifică a semnăturii fluoroforului este dificilă atunci când este suboptimă. Unele culori de
clasificare sunt greu de discriminat, mai ales atunci când se dorește detectarea subtilă. De
exemplu, culoarea de clasificare a cromozomului 5 (implicat în translocarea în 3 căi) a fost
schimbată în alb pentru o detectare mai distinctă care implică translocarea la cromozomul 17.
(2)

O utilitate practică a acestei tehnici o reprezintă utilizarea analizei cromozomilor asupra

produselor de concepție din avorturi spontane în scopul indentificării unei etiologii genetice.
Cu toate acestea, 20% dintre produsele din culturile de concepție nu au succes din cauza
contaminării microbiene sau a lipsei de celule viabile de divizare. Un studiu condus de
Brandon M. Shearer, Erik C. Thorland, Austin W. Carlson, Syed M. Jalal, și Rhett P.
Ketterling a implementat un test de hibridizare in situ fluorescentă reflexă (FISH) pentru a
detecta anomalii cromozomiale numerice pentru culturile nereușite. Toate produsele din
probele de concepție au fost procesate simultan atât pentru analiza cromozomilor, cât și
pentru analiza FISH. Dacă analiza cromozomală nu a avut succes, interfaza FISH a fost
efectuată pentru cromozomii 13, 16, 18, 21, 22, X și Y. Pentru a evalua performanța testului
FISH, a fost efectuată o analiză comparativă retrospectivă de 3 ani a rezultatelor FISH față de
cromozomi. Din 5555 de exemplare totale, 4189 (75%) au reprezentat vilozități coriale/țesut
fetal și 1366 (25%) au reprezentat țesut de origine neidentificată. Din cele 1189 de țesuturi de
origine neidentificată cu rezultate cromozomiale sau FISH, 1096 (92%) au fost XX, ceea ce
indică faptul că majoritatea acestor țesuturi sunt probabil de origine maternă. Din cele 3361 de
studii cromozomiale de succes asupra specimenelor de vilozități coriale/țesut fetal, 1734
(52%) probe au avut o anomalie cromozomală. Din cele 762 de studii FISH de succes pe
specimene de vilozități coriale/țesut fetal care nu au avut succes prin studiile cromozomiale,
181 (25%) au avut un rezultat anormal cu panoul FISH vizat. În general, panoul FISH a
detectat aproximativ 70% din anomaliile cromozomiale în produsele de concepție detectabile
prin cariotip. Atunci când rezultatele panoului FISH au fost combinate cu analiza
cromozomilor pentru cele 4189 de exemplare de vilozități coriale/țesut fetal, rata generală a
anomaliilor a fost de 47%.
Acest test reflex FISH s-a dovedit util pentru detectarea aneuploidiilor cromozomiale comune
în produsele din probele de concepție care nu au putut fi identificate prin analiza
cromozomală convențională. Din cauza vizualizării sale limitate asupra genomului, este
necesară interpretarea cu prudență a rezultatelor FISH pentru toate probele, în special pentru
trisomia unui cromozom acrocentric, care poate reprezenta o translocare Robertsoniană. O
abordare algoritmică a evaluării genetice a produselor din specimenele de concepție, cu
potențialul de evaluare inițială de către un grup FISH, poate fi justificată.(3)
BIBLIOGRAFIE
(1) http://geneticlab.ro/images/pages_files/Testul%20FISH.pdf

(2) Jalal, S., Law, M. Utility of multicolor fluorescent in situ hybridization in clinical cytogenetics. Genet
Med 1, 181–186 (1999). https://doi.org/10.1097/00125817-199907000-00003

(3) Brandon M. Shearer, Erik C. Thorland, Austin W. Carlson, Syed M. Jalal, Rhett P. Ketterling,

Reflex fluorescent in situ hybridization testing for unsuccessful product of conception cultures: A retrospective
analysis of 5555 samples attempted by conventional cytogenetics and fluorescent in situ hybridization,Genetics
in Medicine,Volume 13, Issue 6,2011,Pages 545-552,ISSN
1098-3600,https://doi.org/10.1097/GIM.0b013e31820c685b.