Protocolul de extractie al ADN-ului genomic

Kitul este destinat izolarii ADN-ului din sange (GA), tesuturi, bacterii etc.
Procesul de extractie are la baza 4 etape:
1. Primul pas consta in liza celulelor si a nucleilor pentru obtinerea ADN-ului. In cazul in
care este sange, se lizeaza mai intai celulele rosii cu solutie de liza si apoi celulele albe
2. si nucleii lor cu solutia de liza pentru nuclei. Digestia RN-azelor in acest moment este
un pas optional inclus pentru cateva aplicatii.
3. proteinele celulare vor fi indepartate prin precipitare cu o sare, dar trebuie sa avem in
vedere ca sunt precipitate doar proteinele cu masa moleculara mare.
4. ADN-ul genomic va fi apoi concentrat, iar sarea indepartata din sistem, prin
precipitare cu izopropanol.
ADN-ul purificat pe aceasta cale va putea fi utilizat pt o serie de aplicatii ca: amplificare,
digestie cu endonucleaze de restrictie si hibridizari pe membrane (Southern and dot/slot
blots).
Kitul contine reactivi pentru 100 de izolari pentru 300L sange periferic/proba
100mL Solutie de liza celulara
50mL Solutie de liza pt nuclei
25mL Sol. De precipitare proteica
50mL Sol. De rehidratare ADN
250L Sol. RN-aza
Materiale necesare:
Tuburi sterile de 1,5mL, pentru microcetrifuga, pentru probe de 300L sange periferic;
Tuburi sterile de 15mL, pentru cetrifuga, pentru probe de 3mL sange periferic;
Baie de apa la 37C;
Izopropanol la temperatura camerei;
Etanol 70% la temperatura camerei;
Baie de apa la 65C (optional, pentru rehidratarea rapida a ADN-ului);
IMPORTANT: sangele trebuie sa fie prelevat in tuburi pe anticoagulant cu EDTA, heparina
sau citrat.
Mod de lucru:
1. Pentru volume de 300L sange: se adauga 900L Solutie de liza celulara, in tuburi
sterile de 1,5mL, pentru microcetrifuga. Pentru volume de 3mL sange: se adauga 9mL
Solutie de liza celulara in tuburi sterile de 15mL, pentru cetrifuga.
2. Se mixeaza cu grija de 5-6 ori cu micropipeta.
3. Amestecul se incubeaza pentru 10 minute la temperatura camerei, apoi se
centrifugheaza 20 secunde la temperatura camerei, la 13,000-16,000xg (pentru probe
de 3mL, centrifugarea se face 10minute la 12,000xg si temperatura camerei)
4. Se arunca cat mai mult din supernatant, dar fara a se atinge supernatantul (pellet-ul)
alb vizibil. Astfel ca in tub sa mai ramana aproximativ 10-20L de supernatant (pentru
proba cu 3mL sange lichidul rezidual va fi de 50-100L). Daca sangele a fost congelat
etapele 1-4 se repeta pana cand se obtine un pelet alb. Prin inghetare exista riscul de a
se pierde o parte din ADN.
5. tubul va fi vortexat 10-15 secunde pentru resuspendarea GA.
1

6. Solutia de liza a nucleilor se adauga in cantit de 300L pentru o proba de 300Lsange

(si 3mL pentru 3 mL proba) in tubul cu GA resuspensionate si se mixeaza cu pipeta de
5-6 ori. Amestecul trebuie sa devina foarte vascos. Daca acest lucru nu se intampla,
atunci se incubeaza amestecul la 37C timp de o ora si daca nici atunci nu se intampla
nimic, se mai adauga 100L solutie de liza pentru nuclei.
7. Optional se adauga 1,5L solutie RN-aza pentru o proba de 300L(15L solutie RNaza pentru o proba de 3mL) si se amesteca de 2-5 ori cu pipeta, dupa care se incubeaza
15 minute la 37C.
8. Se adauga 100L (130L) solutie de precipitare a proteinelor pentru o proba de 300L
(1mL (eventual 1,3mLsolutie de precipitare) solutie pentru 3 mL proba). Lizatul
nuclear este vortexat 10-20sec, precipitatul proteic putand fi vizibil dupa vortexare.
9. La temperatura camerei se centrifugheaza timp de 3 minute la 13,000-16,000xg.
Supernatantul (pelet-ul) contine proteinele precipitate si 10 minute la 2,000xg pentru
3mL proba.
10. Intr-un nou tub steril de 1,5mL in care avem 300L izopropanol la temperatura
camerei se adauga supernatantul care a fost centrifugat anterior (3mL proba va fi
transferata intr-un tub de 15mL). Dar, pentru a nu contamina supernatantul cu
proteinele care au fost precipitate se mai lasa foarte putin lichid in tub (nu se ia tot
supernatantul).
11. Cu miscari usoare si atente se intoarce cu grija tubul, masa de ADN devenind vizibila.
12. La temperatura camerei se centrifugheaza pentru 1 minut, la 13,000-16,000xg, ADNul fiind vizibil ca un mic pelet alb (1 minut la 2,000xg pt 3mL proba la temperatura
camerei).
13. Supernatantul se indeparteaza, iar peletul de ADN va fi spalat cu 300uL alcool 70% la
temperatura camerei, prin rasucirea de cateva ori, cu grija a tubului, dupa care se
centrifugheaza ca la pasul 12.
14. Cu o micropipeta, se aspira cu foarte mare grija etanolul pentru a nu pierde peletul de
ADN spalat cu alcool etilic.Apoi tubul este intors cu mare grija cu capacul in jos pe o
hartie de filtru curata pentru a se scurge tot alcoolul. Aerul va usca peletul de ADN
timp de 10-15 minute.
15. Se adauga 100L solutie de rehidratare ADN in tub si se incubeaza 1 ora la 65C si
periodic se agita foarte usor tubul (250L solutie rehidratare pentru o proba de 3mL).
Alternativ, ADN-ul poate fi rehidratat prin incubarea solutiei la temperatura camerei
sau 4C timp de o noapte.
16. ADN-ul genomic astfel obtinut se pastreaza la 2-8C.
Probleme care pot sa apara in extractia ADN:
1. Impuritati in proba de sange- Cauze posibile: stocarea incorecta a tuburilor,
sangele nu a fost omogenizat corect sau tuburile au mai fost utilizate si au urme de
sange uscat.
2. O cantitate redusa de ADN- Cauze posibile: sangele contine o cantitate redusa de
GA (si atunci se corecteaza prin prelevarea unei noi probe de sange), peletul de
celule albe nu a fost resuspendat corespunzator la etapa 5 (trebuie vortexat foarte
bine), proba de sange a fost prea veche (probele trebuie sa fie proaspete sau stocate
la 2-5C daca sunt tinute mai mult de 5 zile) sau peletul de ADN a fost pierdut la
precipitarea cu izopropanol (trebuie sa avem foarte mare grija atunci cand este
mutat peletul de ADN in izopropanol).
3. ADN degradat (<50kb)- Cauze posibile: obtinerea probei in conditii improprii.

4. Absenta peletului proteic- Cauze posibile: proba nu a fost la temperatura camerei

inainte de precipitarea cu solutie de precipitare a proteinelor (in aceasta situatie
proba la temperatura camerei este vortexata timp de 20 secunde si centrifugata
pentru 3 minute la 13,000-16,000xg (10 minute la 2,000xg pentru 3mL proba)
continuand protocolul). Alta cauza ar fi aceea ca solutia de precipitare proteica nu
a fost suficient de puternic omogenizata cu lizatul nuclear (se face intotdeuna
complet acest lucru).
5. Dificultatea dizolvarii peletului de ADN- Cauze: proba este uscata (se rehidrateaza
ADN-ul incubandu-l o 1h la 65C sau la temperatura camerei sau o noapte). Alta
cauza ar fi ca nu a fost proba suficient de omogenizata dupa etapa de rehidratre
(se va face acest lucru corespunzator).
Compozitia solutiei de rehidratare a ADN-ului : 10mM Tris-HCl (pH 7,4)
1mM EDTA (pH 8,0)
PROTOCOL
Cantitatea de
proba (sange)
300L
1mL
3mL
10mL

Solutia de
Celule
900L
3mL
9mL
30mL

liza
Nuclei
300L
1mL
3mL
10mL

Sol
de Izopropanol
precipitare a
proteinelor

Sol de
rehidratare
ADN

100L
330L
1mL
3,3mL

100L
150L
250L
800L

300L
1mL
3mL
10mL

Liza GR din proba de sange

1. Se utilizeaza tuburi adecvate pentru volumul de sange si solutia de liza, conform
tabelului. Omogenizarea se face prin inversarea pozitiei tubului.
2. Se incubeaza 10 minute la temperatura camerei.
3. Se centrifugheaza la 13,000-16,000xg, 20 secunde pentru o proba 300L proba si 10
minute la 2,000xg pentru o proba de 1-10mL sange.
4. Se arunca supernatantul si se vortexeaza peletul.
Liza nucleilor si precipitarea proteinelor
5. Se utilizeaza volumul de solutie de liza a nucleilor conform tabelului si se
omogenizeaza prin inversarea tubului.
6. Se adauga sol utie de precipitare si se vortexeaza 20 secunde.
7. Se centrifugheaza la 13,000-16,000xg, 3minute pentru o proba 300L proba si 10
minute la 2,000xg pentru o proba de 1-10mL sange.
Precipitarea ADN si rehidratarea ADN-ului
8. Supernatantul este transferat intr-un nou tub care contine izopropanol in volum
corespunzator tabelului. Se amesteca.
9. Se centrifugheaza la 13,000-16,000xg, 1minut pentru o proba 300L proba si 1
minut la 2,000xg pentru o proba de 1-10mL sange.
10. Se arunca supernatantul si se adauga etanol 70% in acelasi volum ca si izopropanolul
11. Se centrifugheaza la 13,000-16,000xg, 1minut pentru o proba 300L proba si 1
minut la 2,000xg pentru o proba de 1-10mL sange (ca la etapa 9).
12. Se aspira etanolul si se lasa pell\etul sa se usuce in aer 10-15minute.
13. Se rehidrateaza ADN-ul cu volum corespunzator de solutie de rehidratare timp de 1ora
la 65C sau o noapte la 4C. ( Plesca Simona-Elena )
3