Aplicaţie practică

Modul de lucru cu centrifuga

1. Se branşează centrifuga la sursa de curent.
2. Se deschide capacul centrifugii şi se verifică rotorul şi suporturile (acestea
trebuie să fie goale).
3. Se verifică dacă tuburile sau eprubetele de centrifugă pot fi introduse uşor în
suport.
4. Se verifică balanţa de echilibrare, după care se trece la echilibrarea fiecărei
eprubete conţinând suspensie de centrifugat faţă de o altă eprubetă, de acelaşi
fel, în care se adaugă apă. Eprubetele nu trebuie să fie mai încărcate decât 3/4
din capacitatea lor.
5. Se introduc eprubetele de centrifugă echilibrate perechi în suporturile rotorului
aflate în poziţii diametral opuse.
6. Se închide capacul centrifugii şi se porneşte centrifuga mărind treptat turaţia
acesteia până se atinge valoarea dorită. În cazul unor centrifugi moderne, se
face programarea turaţiei şi timpului de centrifugare, după care centrifugarea se
face în regim automat.
7. După terminarea timpului de centrifugare se opreşte centrifuga. Capacul
centrifugii nu se deschide decât la oprirea completă a rotorului.
8. Se scot atât eprubetele cu probele centrifugate cât şi cele care au servit la
echilibrare.

A. Separarea organitelor celulare

Pentru studiul diferitelor organite celulare cel mai potrivit organ este ficatul, iar
modul de obţinere a acestora este centrifugarea fracţionată (Figura 15).

Tehnică
1. Obţinerea omogenatului celular:
- se anesteziază animalul de laborator (şoarece, şobolan, etc.) şi se prelevă
ficatul;
- se cântăreşte ficatul pe o balanţă;
- ficatul respectiv se introduce în mediul de omogenizare (conţinând 0,25M
zaharoză, 5mM Tris-HCl, pH 7,4) rece (0-4°C) şi se mărunţeşte cu foarfeca.
- Dacă se doreşte preparare de nuclei, mediul va fi: 0,25M zaharoză, 50mM Tris-
HCl, pH 7,5, 25mM KCl, 5mM MgCl2;
- pentru mitocondrii: 200mM manitol, 50mM zaharoză, 10mM HEPES-NaOH, 1mM
EDTA;
- se schimbă de trei ori mediul, pentru a îndepărta sângele, ultima resuspendare
făcându-se într-un volum fix de mediu astfel încât să se obţină 0,25 g ficat/ml;
- se omogenizează într-un omogenizator cu pistil Potter-Elvehjem, realizând 4-5
treceri la 500 rpm.
2. Centrifugarea fracţionată:
- La prima centrifugare (C1) se folosesc eprubete din plastic conice şi o centrifugă
cu rotor orizontal de joasă viteză cu răcire: 10 minute la 1000 g. Sedimentul P 1
va conţine: nuclei, mitocondrii grele, membrane plasmatice, celule întregi.
- La a doua centrifugare (C2) se folosesc eprubete de policarbonat şi o centrifugă
cu rotor unghiular de înaltă viteză cu răcire: 10 minute la 3000 g. Sedimentul P 2
va conţine: mitocondrii grele, fragmente de membrane plasmatice.
- La a treia centrifugare (C3) eprubetele şi centrifuga sunt similare, dar se
centrifughează 20 minute la 10000 g. Sedimentul P3 va conţine mitocondrii,
lizozomi, peroxizomi, membrane Golgi, unii reticuli endoplasmatici rugoşi.
- La a patra centrifugare (C4) se folosesc tuburi din policarbonat şi o
ultracentrifugă: 40 minute la 100000 g. Sedimentul P 4 va conţine microzomi
(vezicule membranare ale reticulului endoplasmatic neted şi rugos), membrane
Golgi şi membrane plasmatice. Supernatantul S 4 va conţine toate componentele
solubile ale citoplasmei.
- Supernatanţii S1 , S2 şi S3 se colectează prin aspirare cu o seringă cu ac.
- Utilizând mediile mai sus amintite, din P 2 se pot obţine mitocondrii relativ pure,
din P4 microzomi relativ puri, iar din P 1 membrane plasmatice (necesită şi un
mediu de 1mM NaHCO3).
 Figura 15. Schema centrifugării fracţionate a omogenatului celular

C. Separarea fracţiunilor lipoproteice

Lipoproteinele plasmatice se caracterizează prin densitatea lor mai mică decât a
proteinelor plasmatice (0,980-1,150 faţă de 1,060-1,380 g/cm 3). Datorită acestui fapt ele
pot fi separate prin ultracentrifugare analitică, obţinându-se diagrame de flotaţie. Din
aceste diagrame se pot deduce constantele de flotaţie Sf.
Ultracentrifugarea preparativă presupune sedimentarea în soluţii saline cu
densitate cunoscută. Se pot obţine trei clase de lipoproteine: lipoproteine cu densitate
mare (high density lipoproteins, HDL), >1,063 g/cm 3; lipoproteine cu densitate joasă
(low density lipoproteins, LDL) 1,006-1,063 g/cm3 şi lipoproteine cu densitate foarte
joasă (very low density lipoproteins, VLDL) 0,96-1,006 g/cm3.
Practic, se adaugă la fiecare mililitru de probă câte 0,32 g de bromură de sodiu
până la densitatea de 1,22 g/cm3 şi se supune ultracentrifugării la 95000 g timp de 120
minute şi la 4C.

D. Clarifierea urinii tulburi

 Principiu
În cazul unor concentraţii crescute de uraţi şi/sau fosfaţi în urină, aceştia vor forma
un sediment după 24 h. În cazul în care se efectuează determinarea unor analiţi din
urină prin metode spectrofotometrice este necesară clarifierea urinii, acest lucru
realizându-se prin centrifugarea acesteia.
Mod de lucru
Într-o eprubetă de centrifugă se introduc 10 ml urină proaspată şi se
centrifughează 10 minute la 1500 rpm. Sedimentul obţinut este constituit din uraţi şi/sau
fosfaţi, iar supernatantul este reprezentat de urina limpede.

E. Separarea prin centrifugare a precipitatului de sulfat de bariu

Principiu
Clorura de bariu, în prezenţa acidului sulfuric, formează sulfat de bariu insolubil
şi acid clorhidric, conform reacţiei:
BaCl2 + H2SO4 → BaSO4 + 2HCl

Sulfatul de bariu rezultat se va separa de restul soluţiei prin centrifugare sau

filtrare.
Reactivi
1. Soluţie BaCl2 6%: se cântăresc, la balanţa farmaceutică, 6 g BaCl 2, se
transvazează într-un pahar Berzelius şi se adaugă 94 ml apă distilată. Se agită
până la dizolvare.
2. Soluţie H2SO4 3%: 97 ml apă distilată se introduc într-un pahar Berzelius. Se
adaugă în picături, sub agitare, 1,7 ml (3,06 g) soluţie H 2SO4 concentrat (98%, cu
densitatea 1,84 g/ml).
Mod de lucru
Într-o eprubetă de centrifugă se introduc 3 ml BaCl 2 6% şi 3 ml H2SO4 3%. Se
centrifughează 5 minute la 1500 rpm. Sedimentul obţinut este constituit din BaSO 4.

Aplicaţie practică:
1. Vizualizarea vacuteinerelor cu sânge de la pacienţi (fără deschiderea
dopurilor)!
2. Deproteinizarea plasmei cu TCA (acid tricloracetic 1%):
Scopul: determinarea aminoacizilor pentru diagnosticarea bolilor metabolice
congenitale:
Tehnica de lucru:
- într-o eprubetă de centrifugare se pipetează: 3mL plasmă + 0.5mL TCA
1%;
- se omogenizează;
- apoi se echilibrează la balanţă cu o altă eprubetă de centrifugare cu apă;
- se centrifugează 10 min la 2000 rpm în echilibru;
- se obţine: sediment (lipoproteinele şi proteinele plasmatice precipitate) +
supernatant = plasma deproteinizată care va fi folosită în
diagnosticarea unor boli metabolice congenitale.