-Protocoale de laborator-

Evaluarea expresiei unei gene de interes prin Real-time PCR (qPCR)

Lector Dr. Sorina Dinescu

Departamentul de Biochimie si Biologie Moleculara
LP BM

Flux de lucru pentru analiza expresiei genice prin Real Time PCR (qPCR)

Protocol izolare de ARN din culturi de celule prin metoda clasica

1. Celulele sunt indepartate de pe suprafata de crestere prin scrapare si reluate intr-un volum
de TriReagent/TRIzol (guanidin izotiocianat). Pentru o suprafata de 25cm2, se foloseste un
volum de 500 µL de TriReagent/TRIzol.
2. Suspensia celulara se transfera intr-un tub Eppi unde se lasa pt 5 min la temperatura
camerei
3. Continuare protocol (pt 1 mL volum initial TriReagent/TRIzol; pt volume mai mari se
calculeaza proportional):
4. Se adauga 200 µL cloroform, vortex, incubare temaperatura camerei 2 min
5. Centrifugare 15 min, 14000 rpm, 4ºC
6. Supernatantul rezultat in urma centrifugarii se transfera intr-un Eppi curat
7. Se adauga 500 µL izopropanol, vortex, incubare la temperatura camerei 2 min
8. Centrifugare 10 min, 14000 rpm, 4ºC
9. Supernatantul rezultat in urma centrifugarii se indeparteaza, iar sedimentul (peletul se
ARN) se spala de 2x cu 500 µL etanol 70%
10. Centrifugare 5 min, 14000 rpm, 4ºC
11. Supernatantul se indeparteaza (etanolul), iar sedimentul se usuca pe fluxul hotei de lucru
pana la evaporarea etanolului.
12. Peletul uscat de ARN se hidrateaza in 20-30 µL apa RNase-free
13. Se citesc concentratia si puritatea ARN obtinut la spectrofotometru

NanoDrop
 EVALUAREA INTEGRITĂŢII ARNtotal EXTRAS
1. Se decontamineaza electrozii BioAnalizorului cu 350μl soluţie RNaseZAP in vederea indepartarii
RNazelor.
2. Se vortexează soluţia de colorare concentrata RNA 6000 Nano Dye (Albastru) 10 secunde.
3. Se adaugă 1 μl de soluţie concentrată de colorare RNA 6000 Nano Dye la aliquoturile de 65 µl de gel
filtrat. [echivalent bromura de etidiu]
4. Se ia un nou RNA Nano cip.
5. Se plasează cip-ul în staţia de primare.

Primarea
6. Se pipetează 9.0 µl din mixul preparat anterior in godeul
marcat cu G.
7. Se setează timer-ul la 30 de secunde şi asiguraţi-vă că
pistonul este poziţionat la 1 mL si apoi închideţi staţia de
primare. Încuietoarea dipozitivului de blocare va face
’click’ când staţia va fi închisă corect.
8. Se apasă pistonul seringii până când acesta este ţinut de clip.
9. Se aşteaptă exact 30 de secunde şi apoi se eliberează pistonul cu ajutorul mecanismului de eliberare.
10. Se inspectează vizual ca pistonul să se deplaseze înapoi măcar până la semnul de 0.3 mL.
11. Se aşteaptă 5 secunde, şi apoi, încet se ridică pistonul până la poziţia de 1 mL.
12. Se deschide staţia de primare.

13. Se pipetează 9.0 µL din mixul gel-colorant în fiecare din godeurile superioare marcate cu G.
14. Se încarcă 5 µL din markerul RNA 6000 Nano Marker în godeul marcat specific(ladder) şi în toate
celelalte 12 godeuri.[echivalent albastru de bromfenol]
15. Se încarca 1 µL din ladder-ul ARN în godeul marcat cu simbolul pentru ladder. Înainte de utilizare, se
dezgheaţă ladder-ul aliquotat şi se păstrează pe gheaţă [echivalent marker de masa moleculara].
16. Pentru a minimiza apariţia structurilor secundare, se denaturează prin
încălzire (70°C, 2 minute) probele, înainte de încarcare în cip.
17. Se pipetează 1µL din fiecare probă denaturata în fiecare din godeurile
destinate probelor.
18. Se setează timerul la 60 secunde.
19. Se plasează cip-ul orizontal în adaptorul vortexului IKA. Se vortexează 60 secunde la 2400 rpm.
20. Cipul este plasat in bioanalizor si analizat in vedera obtinerii valorilor RIN (RNA Integrity Number).
Electroforegrama ladder-ului

Rezultate obtinute
 REACŢIA DE REVERS-TRANSCRIERE
Reacţia de ReversTranscriere presupune convertirea ARNtotal extras anterior în ADNcomplementar
(ADNc) monocatenar.

1. Probele se prelucreaza conform tabelului astfel incat reactia de reverstranscriere sa fie initiata cu
~1000ng/reactie ARNtotal extras. Probele de ARN astfel prelucrate sunt pastrate pe gheata pe toata durata
experimentului.

conc Vol ARN Vol H2O

Proba 1000/conc
(ng/μL) (μL) (μL)

2. Se realizează mixul de reacţie după cum urmează:

Mix reacţie ReversTrancriere Cantităţi x numar probe (ex.20)

5x iScript Reaction Mix (buffer,

primeri, dNTP) 4 μL
iScrip ReversTranscriptaza enzima 1 μL
ARN matrita+H2O 10 μL
H2O liberă de nucleaze 5 μL
Volum total 20 μL

3. Se pipetează 10 μL mix în tuburile cu probe.

4. Se vortexează şi se centrifughează scurt la 13 400 rpm.

5. Se pun probele pe aparatul de PCR şi se porneşte programul de ReversTranscriere.

6. Probele se ruleaza dupa urmatorul protocol:

5 min la 25°C
30 min la 42°C
5 min la 85°C
păstrare la 4°C (optional)
7. Determinare spectrofotometrica a concentratiei ADNc rezultat in urma reactiei de reverstranscriere.
 Reactia PCR in gradient de temperatura pentru optimizarea temperaturii de hibridizare
(anelare) a primerilor

Reactivi necesari:
- Probe de ADN
- Reactivi PCR:
o Amestec dNTP (10 mM)
o MgCl2 (25 mM)
o Buffer 5x (contine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8.3)
o ADN polimeraza GoTaq 5U/µl
o Apa ultrapura Nuclease-free
o Primeri sens/antisens (20 µM) pentru gena de interes (=selectie)

Mod de lucru:

Pentru o singura proba de ADN, realizati 6 reactii PCR in paralel:

1. Realizati dilutia probei ADN pana la o concentratie de 100 ng/µl (astfel incat sa aveti un
volum suficient de ADN diluat pentru numarul de reactii de pipetat)
2. Din dilutia realizata, pipetati cate 1 µl in fiecare din cele 6 tuburi destinate reactiilor PCR
finale.
3. Intr-un tub separat se realizeaza un mix din urmatoarele componente pentru cele 6 probe:

Componente Vol (µl) / reactie X 6 +1

Apa Nuclease free 14.3
Buffer 5x 5
MgCl2 1.5
dNTP 1
Primer F gena de int 1
Primer R gena de int 1
GoTaq polimeraza 0.2
Vf= 24 µl

Toate componentele (cu exceptia polimerazei!) se vortexeaza (vortex + spin) inainte de

utilizare.

4. Pipetati cate 24 µl din mixul PCR obtinut in fiecare din cele 6 tuburi finale (in care exista
deja ADN 100 ng/µl).
5. Se vortexeaza si se centrifugheaza usor (spin)
6. Tuburile se aseaza in aparatul PCR care permite realizarea unui gradient de temperatura
7. Se programeaza aparatul dupa urmatorul program:
 35 cicluri
Etapa initiala Denaturare Hibridizare Extindere Extensie Etapa
finala finala
95°C, 3 min 95°C 50-60 °C 72 °C 72 °C 4°C
(1 ciclu) 30 sec 30 sec 1 min 5 min ∞
1: °C
2: °C
3: °C
4: °C
5: °C
6: °C
 Electroforeza ADN in gel de electroforeza

Mod de lucru:

I. Prepararea gelului
1. Se prepara volumul necesar de tampon de electroforeza TAE 1x (din solutia stoc 50x)
2. Se cantareste cantitatea de agaroza necesara pentru obtinerea unui gel de agaroza 2%

2 g agaroza.........................100 ml TAE 1x
X .....................................35 ml TAE 1x
3. Se dizolva agaroza in tamponul de electroforeza prin incalzire pana la fierbere
4. Se aduce solutia de agaroza la o temperatura de ~50°C prin racirea vasului sub jet de
apa
5. Se adauga 2.7 µL bromura de etidiu (EtBr) si se omogenizeaza in solutia de agaroza
6. Se toarna agaroza intr-o tavita de gel si se lasa la solidificat min 30 min
7. Se adauga un pieptene pentru crearea godeurilor de incarcare a probelor in gel

II. Incarcarea probelor

1. Gelul solidificat se submerseaza in tancul de electroforeza in tampon TAE1x dupa
indepartarea pieptenelui
2. Probele de ADN se amesteca cu tamponul de incarcare (albastru de bromfenol)
3. Se incarca markerul de masa moleculara (MM, 100 pb, 5 µL)
4. Se incarca probele de ADN colorate cu albastru de bromfenol
5. Se completeaza volumul de tampon de electroforeza TAE1x astfel incat intreg sistemul
sa fie submersat in tampon

III. Migrarea electroforetica

1. Sistemul de electroforeza se conecteaza la o sursa de curent continuu
2. Se seteaza voltajul, amperajul si timpul de migrare in functie de dimensiunea
moleculelor si de grosimea si tipul gelului (80-85 V, 35-45 min)

IV. Vizualizarea produsilor PCR

1. Dupa migrare, gelul este scos din tamponul de electroforeza si expus la UV intr-un
transiluminator  achizitia de imagini

!! Vizualizarea benzilor este posibila datorita EtBr incorporate in gel

!! Spectrul de absorbtie la EtBr este in UV, dar emisia este in spectrul VIS, benzile apar
perpendicular pe directia de migrare intr-o culoare roz-portocalie
 Evaluarea expresiei genice prin realtime PCR (qPCR)

Principiul metodei:
Real-time PCR este o tehnică superioară PCR deoarece permite vizualizarea produşilor de
amplificare în timp real, datorită înglobării unui fluorocrom a cărui concentraţie creşte pe măsura
ce reacţia de amplificare progresează. Această tehnică permite cuantificarea produşilor de reacţie
în timp real.
Cuantificarea produşilor poate fi absolută- în cazul QRT-PCR, prin care se determină
cantitatea de produşi de amplificare (ampliconi) acumulată la diferite momente ale reacţiei. Nivelul
exact al ampliconilor se determină pe baza unei curbe standard realizată prin diluţii seriale - sau
poate fi cuantificare relativă, care permite evaluarea nivelului de expresie genică în proba de
interes faţă de o probă de referinţă.
Aplicaţiile acestei tehnici de biologie moleculară, extrem de sensibilă, sunt numeroase: i)
evaluarea expresiei genice a transcriptului primar în diferite tipuri celulare ; ii) determinarea
nivelului de expresie a unei gene în ţesut normal comparativ cu un ţesut tumoral; iii) detecţia
expresiei unor markeri în celule/ţesuturi; iv) estimarea numărului de particule virale/bacteriene din
probele biologice, etc.
Metodele de vizualizare în Real-time PCR sunt multiple: utilizarea de sonde Molecular
Beacon, utilizarea unor molecule fluorescente intercalante (Sybr Green), utilizarea de oligosonde
nucleare Taqman sau vizualizare prin intermediul unor cupluri de oligosonde.
Principiul cuantificării expresiei genice prin marcare cu molecule fluorescente intercalante
numite Sybr Green. Acesta reprezintă un fluorocrom care are capacitatea de a se lega la fosa
minoră a ADN dublu-catenar, moment în care emite fluorescenţă. Astfel, în momentul amplificării
ADN corespunzator genei-ţintă (de interes), Sybr Green se leagă pe masura ce se obţine structura
dublu catenară şi emisia fluorescentă creşte. Intensitatea emisiei fluorescente creşte direct
proporţional cu creşterea numărului de ampliconi.

Tema: Evaluarea expresiei unei gene de interes (colagen

tip II) exprimata in fibroblaste umane inainte si dupa
initierea unui proces de regenerare.
Sistem: iCycler BioRad, sistem qPCR in placa (96 probe)
Reactivi necesari:
- Probele de ADNc obtinute in urma reverstranscrierii- aduse la o concentratie de ~100 ng

- Primeri specifici pentru gena de interes (stoc: 20 pmol/µL)

- Primeri pentru gena de referinta

 - Mix de reactie qPCR (iQ SYBR Green SuperMix) pe baza de SYBR Green- contine toate
componentele unei reactii PCR normale, cu exceptia primerilor si a matritei, si in plus,
compusul fluorescent intercalant SYBR Green.
- Apa nuclease free.

Mod de lucru:

1. Se realizeaza dilutia probelor de ADNc in care se doreste analiza expresiei genei de interes
pana la o concentratie de ~100 ng (in tuburi separate).

Proba Concentratia Dilutia Vol. ARN Vol apa

(ng/µL) nuclease-free

2. Se desemneaza un control negativ (mixul de reacţie, excluzând ADNc), un control pozitiv (un
ADNc obţinut din ţesutul în care se exprimă gena de interes) şi o genă de referinţă (GAPDH).
3. Se pipeteaza 1 µL din probele diluate la ~100 ng in fiecare godeu din placuta qPCR.
!!! Reactia se lucreaza in triplicat pentru fiecare proba!

4. Intr-un tub separat se realizeaza mixul de reactie pentru toate probele.

!!! Se realizeaza cate un mix de reactie pentru fiecare gena in parte (pereche de primeri).
!!! Mixul cu SYBR Green este sensibil la lumina  mixul de reactie se realizeaza la intuneric!

Component Vol (uL/reactie) Vol x nr. de reactii (+1)

+1 pt control negativ
iQ SYBR Green supermix (2x) 12.5
Primer F gena de interes 0.5
Primer R gena de interes 0.5
Apa nuclease free 10.5
Vf= 24 µL

Component Vol (uL/reactie) Vol x nr. de reactii (+1)

+1 pt control negativ
iQ SYBR Green supermix (2x) 12.5
Primer F GAPDH 0.5
Primer R GAPDH 0.5
Apa nuclease free 10.5
5. Se pipeteaza mixul de reactie in placa qPCR (24 µL) peste 1 µL ADNc diluat. (Vf= 25 µL)
6. Placa se sigileaza cu folie transparenta si se pune pe termobloc.
7. Programul dupa care ruleaza reactia de amplificare in timp real este urmatorul:

Placa qPCR:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12