TRANSFORMAREA

GENETICĂ A CELULELOR
DE DROJDII
❑ pentru a introduce gene în celulele de drojdii, sunt necesari vectori de
clonare adecvați
❑ aceștia sunt de mai multe tipuri, în funcție de elementele genetice ce au
servit la ”construirea” lor
❑ majoritatea vectorilor de clonare sunt de tip ”navetă” (”shuttle”) – capabili de
replicare și exprimare atât în E. coli cât și în celule de drojdii

❑ în aceste experimente se utilizează vectorul episomal notat YEp24 (7.769

kb)
❑ el conține ca gene marker:
- gena de rezistență la ampicilină (funcțională în E. coli)
- gena ura3 (ce funcționează și în drojdii)

❑ pentru obținerea vectorului de clonare s-a utilizat o tulpină de E. coli ce

conține respectiva plasmidă, metoda de izolare fiind cea a lizei alcaline
❑ pentru a putea selecta celulele de drojdii transformate cu vectorul YEp24
este necesar ca tulpinile acceptor să fie auxotrofe (ura-)

❑ în experimente se poate utiliza:

- tulpina Saccharomyces cerevisiae Ts5 (a ura3 leu2) sau
- tulpina Saccharomyces cerevisiae 589 (a ura3 his3 leu2 ade2)
 MOD DE LUCRU

✓ drojdiile sunt cultivate în mediul YPG timp de 18 ore, la 32oC

✓ din această suspensie se fac diluții seriale și se însămânțează trei plăci cu mediu
YPG agarizat (câte 0,1 ml/placă), ele reprezentând martorul inițial
✓ sedimentul celular rezultat prin centrifugarea a 1,5 ml suspensie 10 min. la 4000
rpm este reluat în 0,4 ml tampon TELI (pH 8,0) și se incubează timp de 30 min.
la 30oC
- ionii de Li din soluția TELI se presupune că favorizează pătrunderea ADN transformant în
celulă, prin formarea unor micro-pori; mecanismul fin de acțiune nu este pe deplin cunoscut
✓ după incubare, din suspensia formată se iau volume egale (0,2 ml) și se
repartizează în două tuburi Eppendorf
✓ în fiecare tub se adaugă câte 20 µl soluție de ADN ”cărăuș” (”carrier DNA”)
(soluție stoc)
- această soluție favorizează pătrunderea ADN transformant în celulă, fără a se cunoaște
mecanismul
✓ în unul dintre tuburi = cel care va reprezenta proba, se adaugă 40 µl soluție ce
conține vectorul YEp24, iar în celălalt = martorul de transformare, se adaugă
40 µl tampon TE steril
✓ amestecul de transformare se incubează 30 min. la 30oC
✓ în fiecare tub se adaugă 0,2 ml soluție tampon TELI-PEG și se incubează, mai
întâi 20 min. la 30oC și apoi 10 min. la 42oC
- șocul termic facilitează pătrunderea ADN transformant în celulele de drojdii
- componenta PEG din soluția TELI-PEG facilitează adsorbția ADN transformant la receptorii
de membrană și pătrunderea acestuia în celulă
✓ din fiecare tub se însămânțează câte trei plăci ce conține mediu selectiv (câte 0,1
ml suspensie diluată/placă)
✓ după incubare timp de 24 – 48 ore la 30oC se apreciază eficiența transformării
prin raportarea numărului de colonii apărute pe mediul minimal fie la martorul
inițial, fie la µg ADN transformant utilizat
Soluții și medii utilizate:

❑ Tampon TELI, pH 8,0

- Tris HCl 10 mM, pH 8,0
- EDTA 1mM
- LiCl 50 mM

❑ Tampon TELI-PEG
- se obține prin adăugarea PEG 6000 la 25 ml tampon TELI, pentru a se
ajunge la o concentrație finală de 40%

❑ Soluția stoc de ADN carrier: 10 mg ADN din timus de vițel/ml apă distilată
sterilă

❑ Mediu minimal
- yeast nitrogen base 0,67%
- MgSO4 0,5%
- glucoză 2%
- leucină 3 mg/l (în cazul utilizării drept gazdă a tulpinii S. cerevisiae Ts5)
- agar 2%
 Întrebări la care trebuie să
răspundem la finalul
experimentului

❑ Drojdia a primit vectorul?

❑ Daca DA, cum verific acest lucru?

❑ Ce caracteristici are drojdia transformată?

Observarea plăcilor, după perioada de incubare, va oferi

răspunsuri la aceste întrebări și putem decide dacă scopul
experimentelor a fost atins.
✓ Celulele gazdă sunt auxotrofe, adică.......
✓ Vectorul utilizat pentru transformare conferă celulelor
acceptoare capacitatea de ......
✓ Mediul selectiv conține doar....... pentru că........
Bye-bye!