Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
CULTURILOR
Multiplicarea celulelor este unul din scopurile principale ale metodei culturilor celulare.
Prin multiplicare se obtine un numar de celule necesar scopurilor propuse, se asigura o rezerva
permanenta de celule (pastrate prin inghetare) si de asemenea, se obtine omogenitatea celulara
in culturile primare.
Ca urmare a multiplicarii continui, celulele, care initial au fost inseminate la o densitate
mica, in cateva zile vor ocupa intreaga suprafata de cultura, ceea ce in cazul celulelor normale
(netransformate) va duce la inhibarea cresterii, insotita si de diferentiere, in cazul celulelor de
tip nediferentiat. Pentru a mentine procesul de multiplicare continuu, la obtinerea unei densitati
optime, celulele sunt diluate, in raport de 1/4 - 1/8 (in functie de rata de multiplicare celulara).
Tehnica se numeste Subcultura celulara, iar fiecare procedeu de subcultivare este denumit
pasaj si este insotit de un numar, egal cu numarul proceselor de subcultivare celulara, prin
care a trecut cultura respectiva, din momentul initierii acesteia.
Pe baza datelor obtinute la fiecare pasaj celular, se realizeazacurba de crestere a celulelor,
dupa modelul prezentat in figura de mai jos.
Daca la fiecare pasaj celular, noua cultura va fi initiata cu acelasi numar de celule, dupa o
serie de pasaje celulare realizate, se obtin date, care permit determinarea exacta a numarului de
zile de cultura necesare pana la efectuarea unui nou pasaj, fara a fi necesara verificarea zilnica a
culturilor. In figura de mai jos, este data o reprezentare grafica a unei subculturi seriale si
semnificatia valorilor inscrise pe acesta.
5.Peste cultura spalata cu PBS se adaug 3,5 ml de amestec tripsin 0,25% i EDTA
0,02%, adusa la temperatura de +370C. Se fac cteva micri de antrenare a soluiei pe suprafaa
care conine cultura, apoi se lasa la incubator, la 37oC pentru maxim 1 min. Desprinderea
celulelor se verifica la microscop dupa fiecare 30 sec de incubare.
6. Dupa desprinderea vizibila a celulelor, se adauga o cantitate de 5 ml mediu de cretere
complet in flaconul cu celule, pentru inactivarea actiunii enzimatice a tripsinei. Se aspira repetat
cu pipeta serologica, pentru omogenizarea suspensiei, iar apoi intreaga cantitate de suspensie se
transfera intr-o eprubeta de centrifuga, de 15 ml.
7.Se centrifugeaza cu 350 G, timp de 5 min.
8.Se inlatura supernatantul, iar sedimentul cu celule se resuspenda in 10 ml de mediu
proaspat. Se omogenizeaza suspensia prin aspirarea repetata cu o pipeta serologica.
9.Se determina numarul celulelor si viabilitatea, prin metoda cu albastru tripan, descris
mai josa in continuare
Determinarea numrului de celule:
- ntr-un tub eppendorf, de 2 ml se iau 0,1 ml de suspensie celular, la care se adauga
un volum egal de Albastru de tripan 0,3% (colorant vital, care patrunde doar in
celulele moarte si nu poate trece prin membrana celulelor vii).
- Se omogenizeaza bine amestecul.
- Se incarca camera de numarat celule Neubauer cu amestecul obtinut.
- Cu ajutorul obiectivul 10x se numara celulele din patratele externe ale camerei,
fiecare compus din cate 16 patrate mai mici (vezi imaginea atasata). Se noteaza
separat celulele colorate (moarte) si cele necolorate (vii)