Numararea celulelor

Determinarea exacta a numarului de celule sau a densitatii celulare se

poate face fie manual folosind o camera de numarat (Hemocitometru), fie
automat folosind un aparat special de numarat celule.
A) Numararea celulelor folosind Hemocitometru
Materiale si aparatura necesare:
-

Mediu de cultura DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin, Lglutamina si Penicilina/Streptomicina (100U/ml / 100g/ml)
Solutie tampon fosfat salin (PBS)
Hemocitometru si lamela de sticla
Solutie Trypan Blue 0.4%
Etanol 70%
microscop optic

Fig. 1 Hemocitometru
1) Se curata bine lamela de sticla cu etanol apoi se umezeste usor si se
fixeaza pe hemocitometru
2) Celulele, dupa ce au fost desprinse cu tripsina, se resuspenda in 10 ml
PBS
3) Intr-un tub eppendorf (1.5 ml) se amesteca 100 l suspensie celulara cu
100 l Trypan Blue (pentru a colora celulele moarte in albastru)

4) O parte din amestecul de celule cu Trypan Blue se incarca in

Hemocitometru prin capilaritate (se aseaza varful pipetei Gilson pe
marginea camerei de citire).
Important!!!
Nu incarcati in exces camera de citire cu suspensie celulara!
5) Se numara celulele din toate cele 4 patrate mari (numerotate de la 1 la
4) format din cate 16 patrate mai mici. Rezultatul se imparte la 4 pentru a
afla numarul mediu de celule din fiecare patrat mare. Media se inmulteste
cu 2 pentru a tine cont de dilutia 1:2 cu Trypan Blue. Numarul obtinut
reprezinta numarul de celule/0.1 mm3 (patratul mare are latura de 1mm iar
adancimea camerei de citere este de 0.1mm) sau nr. de celule/0.1x10 -3cm3
sau nr de celule x 10 4/ml. Aceasta reprezinta concentratia de celule in
suspensia initiala de 10 ml (punctul 2).
Important!!!
Celulele colorate in albastru (celule moarte) se numara separat pentru a
calcula viabilitatea celulara!
Exemplu:
Careul 1: 180 celule, careul 2: 190 celule, careul 3: 220 celule, careul 4:
210 celule
Media = (180+190+220+210)/4=200 celule
200/2 = 100 celule (dilutie 1:2 cu Trypan Blue)
In suspensia initiala avem 100x104celule/ml=106celule/ml
Daca in urma unui calcul asemanator se gasesc 10 5 celule calorate in
albastru/ml rezulta ca viabilitatea celulara este de 90% .

B) Numararea automata a celulelor

Materiale si aparatura necesare:
-

Mediu de cultura DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin, Lglutamina si Penicilina/Streptomicina (100U/ml / 100g/ml)
Solutie tampon fosfat salin (PBS)
Aparat automat de numarat (ex: Countess, Invitrogen)
lamele speciale (Invitrogen)
Solutie Trypan Blue 0.4%

Suspensia celulara se pregateste la fel ca la A) (punctele 2. si 3.)

1) 10 l din suspensia celulara cu Trypan blue se incarca in lamela de

numarat celule (in slide A)
2) Se introduce lamela (cu capatul A inainte) in aparatul de numarat celule
3) Cu ajutorul butonului de Zoom si a celui de Focus se ajusteaza
imaginea de pe ecran pentru a vedea cat mai clar celulele (celulele viabile
au un centru luminos si margini inchise la culoare iar celulele moarte sunt
colorate uniform in albastru)
4) Dupa ce se obtine o imagine clara a celulelor se apasa butonul Count
cells. Dureaza aproximativ 30 de secunde pentru ca aparatul sa numere
celulele iar rezultatele vor fi afisate pe ecren.
Important!!!
Nu este necesara ajustarea claritatii imaginii pentru fiecare numaratoare
in parte daca se numara acelasi tip de celule de acelasi dimensiuni!