Cultivarea celulelor HEK293T

Materiale si aparatura necesare:

-

Mediu de cultura DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin, Lglutamina si Penicilina/Streptomicina (100U/ml / 100g/ml)
Solutie tampon fosfat salin (PBS)
Pipete serologice sterile (2ml/5ml/10ml), recipienti de plastic, tuburi
de 15ml/50ml
Pipetor automat
Centrifuga cu rotor pentru tuburi de 15ml/50ml
Hota cu flux laminar
Incubator 37C si 5% C02
Baie de apa 37C
Tripsina/EDTA 0.05%

Important!!!
Inainte de utilizare mediul de cultura trebuie preincalzit la 37C!

Dezghetarea stocului de celule HEK293T de la azot lichid

1) Dupa ce au fost scoase din tancul de azot lichid, celulele se dezgheata
rapid pe baia de apa la 37C pentru 2 min.
2) Celule se transfera intr-un tub conic de 15ml ce contine 10ml mediu de
cultura
3) Se centrifugheaza 3 min. la 1500g pentru a depune celulele si se
indeparteaza supernatantul
4) Peletul celular se resuspenda in 2 ml de mediu si se transfera intr-un
recipient de plastic (flask) de 75cm 2 ce contin 8 ml de mediu de cultura
preincalzit la 37C.
5) Celulele se tin in incubator la 37C si 5% C02
6) A doua zi se schimba mediul de cultura cu 10ml de mediu proaspat.

Mentinerea in cultura a celulelor HEK293T

Mediu de cultura al celulelor trebuie schimbat la fiecare 3 zile sau mai des,
in functie de rata de crestere a acestora. In mod normal, celulele HEK293T
trebuie pasate cand gradul de confluenta depaseste 80%.

Important!!!
Manipularea celulelor HEK293T se face cu mare grija deoarece aceste
celule sunt semiaderente si se pot desprinde foarte usor de pe suportul de
plastic pe care sunt crescute.

1) Se aspira cu grija mediul de cultura de pe celule. Aceasta se face cel

mai bine prin inclinarea recipientului de plastic si indepartarea mediului cu
pipete serologice sterile fara a atinge suprafata celulelor.
2) Celulele se spala usor cu PBS (apoximativ 5 ml)
3) Se adauga 1ml Tripsina-EDTA si se lasa in incubator 2-3 min.
4) Celulele se resuspenda in 5 ml de mediu (pentru a inactiva tripsina) si
se transfera in tuburi de 15 ml
5) Se centrifugheaza 5 min la 1500g, se indeparteaza supernatantul iar
celulele se resuspenda in 3 ml de mediu.
6) Celulele se dilueaza 1/6 (0.5 ml) pentru a le mentine in cultura sau 1/3
(1 ml) pentru amplificare, in 10 ml de mediul proaspat
7) Celulele se transfera intr-un recipient de plastic nou si se cresc in
incubator la 37C si 5% C02.