Culturi celulare

1. Definiție: Culturile de celule, reprezintă o metodă de laborator prin care celule izolate
sau fragmente din țesut (animal sau vegetal) sunt transferate într-un mediu artificial,
controlat, dar în care acestea își păstrează viabilitatea și funcțiile specifice.

2. Aplicații: - Cercetări fundamentale în biologie și medicină;

- Obținerea vaccinurilor;
- Testarea medicamentelor;
- Terapie celulară, etc.

3. Tipuri de culturi celulare:

a) Culturi primare – le extragi dintr-un țesut și lucrezi imediat nu poți repeta un
experiment;
b) Culturi continue – le poți multiplica nelimitat, pot fi criogenate (înghețate).

4. Condiții de cultivare și creștere:

- Culturile de celule se prepară într-un spațiu de lucru steril (hotă cu flux laminar, radiații
UV);
- Păstrarea temperaturii optime (370 C) și a pH-ului optim; Principalul compus care
modifică valoarea pH-ului în cultura de celule este 𝐶𝑂2, produs ca urmare a metabolismului
celular condiții de incubare cu atmosfera 5% 𝐶𝑂2;
- Utilizarea instrumentelor și sticlăriei fine.

5. Dezghețarea și cultivarea celulelor

 Criotubul cu celulele se introduce rapid în baia de apă, la 370 C, timp de 1-2 minute;
 Într-un tub corning de 15 mL, se neutralizează dimetilsulfoxid-ul (DMSO) în care au
fost înghețate celulele cu mediu de cultură DMEM (Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium) –
4mL;
 Se centrifugează timp de 5 minute la 1500 rpm (rotații pe minut);
 Supernatantul este înlăturat iar peste celule se adaugă 1 mL DMEM pentru a putea fi
resuspendate;
 Tot conținutul este pus într-un flask de 25 cm2 și incubat la 37°C, 5% CO2 și condiții de
umiditate.
 Exemplu de morfologie celulară în cultură:

Linica celulară pancreatică, canceroasă, Panc-1 (stânga) și linia celulară HEK/M8 (dreapta)

6. Menținerea liniilor celulare

 Multiplicarea celulelor in cultura duce la epuizarea substantelor nutritive din mediu de
cultura si acidifierea acestuia și la epuizarea suprafeței de creștere întreținerea liniilor
celulare în cultură are loc prin schimbarea perioadică a mediului de cultură;
 Mediul de cultură ce conține nutrienți, aminoacizi, ioni și foarte multă apă, este
suplimentat cu factori de creștere (FBS) și antibiotice;
 FBS = ser fetal de bovine – reprezintă sursa de proteine care să asigure procesele de
diviziune celulară, diferențiere, adeziune de substrat dar și altele;
 Frecvența de schimbare a mediului depinde de tipul celulelor (viteza lor de
multiplicare).

7. Pasajul culturilor celulare (tripsinizare)

 Poate fi realizat doar după ce celulele au ajuns la o confluență de 70 %. Este indicat să
nu se depăsească acest stadiu de confluență;
 Numarul de pasaje = numarul subculturilor celulare realizate;
 Celulele se pot ține în suspensie (exemplu: celulele din sistemul sanguin) dar,
majoritatea celulelor sunt aderente pentru a rupe joncțiunile de aderență utilizăm tripsină-
EDTA (enzimă secretată de pancreas);
 Pentru realizarea experimentelor, celulele trebuie pasate de minim trei ori deoarece abia
după al trei-lea pasaj cultura devine stabilă, fiind formată din celule tipizate, proliferative.

8. Criogenarea
Dacă dezghețarea celulelor trebuie realizată cât mai rapid, criogenarea acestora este
necesar să se efectueze treptat:
 Mediul de cultură din flasc este îndepărtat iar peste celule se adaugă 1mL de tripsină
după care se incubează timp de 5-10 minute;
 După ce s-au desprins celulele se adaugă o cantitate dublă de mediu față de cantitatea
de tripsină pentru neutralizarea acesteia;
 Resuspendăm și adăugăm totul într-un tub Corning pentru centrifugare timp de 5
minute la 1500 rpm;
 Supernatantul se îndepărtează iar peletul de celule se resuspendă în FBS;
 La final, adăugăm 10 % agent de criogenare (DMSO) iar suspensia celulară se împarte
în criule și se păstrează la -70°C.

9. Numărarea celulelor și cultivarea pe Petriuri

 Se lucrează doar cu celule ce au minim 3 pasaje celulare;
 Celulele sunt tripsinizate cu 1 mL de tripsină și ținute în incubator 5 minute la 37°C și
5 % CO2;
 După desprinderea celulelor de substrat, inactivăm tripsina cu o cantitate duplă de
DMEM;
 Adăugăm tot conținutul din flask într-un tub Corning de 15 mL și centrifugăm timp de
5 minute la 1500 rpm;
  Îndepărtăm supernatantul iar peste peletul de celule adăugăm 1 mL de mediu de cultură
steril;
 După resuspendare, utilizăm 20 µL pentru camera de numărat (Burker-Turk).

Aria1 = 0,04 mm2

Aria2 = 0,0025 mm2

Adâncime = 0,1 mm

Volum = Adâncime X Aria1 = 0,004 𝑚𝑚3 = 0,004 µl

 Pentru a afla numarul de celule/1mL vom efectua următoarele calcule:

# număr celule.......................0,004 µl X celule/1µl =
𝑛𝑢𝑚ă𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑒 𝑋 1µ𝑙
0,004
? celule................................... 1 µl
Y celule/1mL= x celule/1µl X 1000

 Deoarece este necesar ca celulele să ajungă la confluența de 100% în cât mai scurt timp,
am ales să cultivăm celulele pe vase Petri de 33 mm, la densitatea 3x105 celule/mL efectuând
calculele și diluțiile necesare în prealabil, sintetizate mai jos:

X celule/1 mL
= Y (factorul de diluție)
densitatea dorită
Numărul de vase Petri × 1,5 ml mediu = Z mL (volumul final)
Z
× 103 = volumul de celule (în µL)
Y

Formule de calcul necesare pentru cultivarea celulelor pe vase Petri

 Din cei 1mL de celule vom lua volumul de celule în µl aflat și il adăugăm în volumul
final însă mai întâi trebuie să optimizăm volumul final;
 Cultivăm celulele pe Petri-uri punând câte 1,5 mL din volumul final în fiecare vas.

10. Teste de viabilitate celulară

Una dintre cele mai vechi și cele mai comune metode de măsurare a viabilității celualare
este testul de excludere cu trypan blue.
 Trypan blue = o moleculă de aproximativ 960 Daltoni, care prezintă o membrană
celulară impermeabilă și, prin urmare pătrunde numai în celule cu membrană compromisă sau
moarte;
  La intrarea în celulă, trypan blue se leagă la proteinele intracelualre colorând astfel
celulele în albastru;
 Testul de excludere cu trypan blue permite identificarea directă și numărul celulelor vii
(necolorate) și moarte (albastre) într-o anumită populație de celule;

Mod de lucru:
Tripsinizez celulele și pun totul într-un tub Corning de 15 mL;

Centrifughez 5 minute, 2000 rpm

Scot supernatantul și adaug 3 mL DMEM pentru a spăla bine celulele;

Centrifughez 5 minute, 2000 rpm

Arunc supernatantul și adaug 1 mL mediu steril;

Resuspend foarte bine

Iau volumul de celule necesar (120 µl în cazul nostru) și îl adaug în tuburi eppendorf cu câte
40 µl trypan blue o,2 % (factorul de diluție = 0,3);

Din acest amestec folosim câte 20 µl ce îi adăugăm în kitul de numărare;

Analiza statistică a valorilor obținute.