Material biologic = cultura bacteriana / tesut vegetal tanar, proaspat

Spargere perete celular = chimic – lizozim + fizic - șoc termic / fizic - mojarare

Rupere membrană celulară = soluție tampon cu SDS / soluție tampon cu CTAB

Deproteinizare = amestec cloroform : alcool izoamilic 24:1 v/v

Precipitare ADN = alcool etilic absolut / alcool izopropilic

VECTORI DE CLONARE

IZOLARE ADN PLASMIDIAL

Plasmida = ?
 Caracteristicile unui vector de clonare

➢să fie capabil de replicare autonomă în celula gazdă (secvența ori)

➢să prezinte markeri genetici selectabili (ex. gene de rezistenţă la antibiotice)
➢să aibă mai multe situsuri unice de clivare cu enzime de restricţie, la nivelul
unor regiuni neesenţiale ale vectorului/să conţină un număr crescut de situsuri
unice de restricţie grupate la nivelul unei regiuni specifice numită situs
multiplu de clonare ("multiple cloning site")
➢să aibă o greutate moleculară mică şi să prezinte cât mai multe copii per
celulă (eventual să fie amplificabil prin tratament cu cloramfenicol);
➢să fie uşor de purificat, să permită obţinerea unor cantităţi mari de ADN,
suficiente pentru experimentele de clonare
➢să conţină secvenţe specifice de ADN ce permit selecţia rapidă a clonelor
recombinate (selecţie directă pe medii specifice sau selecţie prin teste
histochimice)
 Alte însușiri pentru vectorii moderni

• să fie cunoscută secvenţa de nucleotide a vectorului

• să prezinte siguranţă în folosire (să aibă o transmisibilitate redusă în prezenţa
unor plasmide conjugative, iar replicarea să fie sensibilă la temperatura
corpului mamiferelor)
• să prezinte dimensiuni din ce în ce mai reduse dar să permită clonarea unor
fragmente mari de ADN heterolog
• să prezinte secvenţe care să asigure generarea de molecule monocatenare
necesare tehnicilor de secvenţiere sau pentru construirea de sonde de ADN
• să conţină secvenţe specifice de tip promotori, terminatori, activatori
(enhanceri) ce asigură transcrierea "in vitro" a ADN clonat (vectori de
exprimare)
❑ majoritatea genelor codificate de plasmide conferă caractere adaptative,
avantajoase gazdelor purtătoare
❑ printre genele localizate pe plasmidele bacteriene pot fi menţionate
următoarele exemple:
- gene de rezistenţă la antibiotice;
- gene ce asigură toleranţa la metale grele
- gene ce codifică factori de patogenitate şi de virulenţă
- gene ce codifică sinteza unor bacteriocine
- gene ce codifică capacităţi metabolice deosebite (sinteza unor
enzime, degradarea unor substanţe xenobiotice etc.)
- gene fixatoare de azot
- gene ce asigură propria replicare, stabilitate şi partiţie
- gene ce asigură transferul prin procesul de conjugare (genele tra) etc.
 CLASIFICAREA VECTORILOR DE CLONARE

1. După structură şi mod de funcţionare pot fi:

• vectori plasmidiali
• vectori virali
• vectori hibrizi de tip fagimide (cu structură hibridă, de plasmidă şi de fag
filamentos) sau cosmide (cu structură hibridă, de genom de fag şi de
plasmidă).

2. In funcţie de posibilitatea replicării şi menţinerii stabile a vectorului în

diferite gazde, vectorii de clonare pot fi:
• vectori congenerici - ce pot fi folosiţi doar la organisme
aparţinând aceluiaşi gen taxonomic
• vectori de tip "shuttle" (navetă) - care se replică şi se menţin
stabil în două gazde diferite, dintre
care una este Escherichia coli.
3. In funcţie de posibilitatea studierii exprimării fragmentelor de ADN
clonate vectorii pot fi:
vectori de clonare care permit doar clonarea unei anumite secvenţe de
ADN, nu şi analiza exprimării sale, deoarece nu conţin secvenţe promotor la
nivelul situsului de inserţie
vectori de exprimare care au în structura lor secvenţe ce permit exprimarea
fragmentului de ADN clonat şi determină, în anumite situaţii, obţinerea de
proteine de fuziune.
❑ unii dintre cei mai utilizați vectori plasmidiali în experimentele de inginerie
genetică sunt:
- pBR322;
- pUC18/pUC19
- pGEX
- pBluescript SK+/-
- pYEp
- pGFP-C1
- pBI121
Plasmida pBR322
Vectorii de tip pUC
pBluescript
 Metode de izolare a ADN plasmidial
❑ pentru purificarea ADN plasmidial au fost elaborate numeroase metode,
utilizarea uneia sau a alteia depinzând de scopul urmărit:
- evidenţierea prezenţei plasmidelor în celulele bacteriene (screening
plasmidial) sau
- purificarea plasmidelor pentru utilizarea lor în diferite experimente
(transformare genetică, clivare cu enzime de restricţie, clonare de gene etc.)

❑ toate metodele elaborate până în prezent pentru izolarea plasmidelor bacteriene

implică trei etape de bază:
- cultivarea bacteriilor
- liza celulară
- purificarea ADN plasmidial
❑ posibilitatea de a izola selectiv ADN plasmidial şi de a îndepărta ADN
cromosomal se datorează unor diferenţe importante dintre cele două tipuri de
molecule
❑ ADN cromosomal:
- este reprezentat de molecule de dimensiuni mari, legate de membrana
plasmatică
- el rămâne fixat de resturile celulare rezultate după spargerea celulelor
- ADN cromosomal este linearizat şi fragmentat în cursul procesului de
extracţie

❑ ADN plasmidial:
- este obţinut în cea mai mare parte sub forma unor molecule circulare
închise covalent (CIC)
❑ cele două tipuri de molecule se comportă diferit în prezenţa unor detergenţi
(SDS) sau la concentraţii mari de săruri

❑ expunerea la temperaturi ridicate sau tratarea cu soluţii cu pH puternic alcalin

(12,0 - 12,4) determină ruperea legăturilor de hidrogen dintre cele două catene
ale moleculelor de ADN, ducând la denaturarea acestora
❑ datorită conformaţiei moleculare speciale (CIC), catenele de ADN plasmidial
denaturat se menţin alăturate, astfel că, după răcire, respectiv neutralizare,
aceste molecule redobândesc configuraţia iniţială, în timp ce ADN cromosomal
rămâne în stare denaturată
❑ el este eliminat, în cea mai mare parte, odată cu resturile celulare, după
centrifugare
 Metoda lizei alcaline

Principiul acestei metode constă în liza alcalină a

conținutului celular, după spargerea prealabilă a pereților; la pH =

12,5 moleculele de ADN denaturează, iar la refacerea pH-ului (4,8)
renaturează doar moleculele mici de ADN, molecule ce se vor regăsi
în supernatantul rezultat în urma centrifugării.
Materiale și echipamente necesare:
- eprubete
- tuburi Eppendorf
- micropipete
- vârfuri de micropipetă
- incubator (cu/fără agitare)
- centrifugă

Medii de cultură, reactivi, soluții necesare:

1. Mediu de cultură LB 4. Soluţia III
- triptonă 10 g/L - acetat de potasiu 5M - 6 volume
- extract de drojdie 5 g/L - acid acetic glacial - 1,15 volume
- NaCl 10 g/L - apă distilată - 2,85 volume
pH = 7,0±2 5. Alcool izopropilic
2. Soluţia I 6. Lizozim
- Tris HCl 25 mM, pH 8.0 7. Amestec fenol:cloroform:alcool
- EDTA 10 mM izoamilic (25:24:1 v/v)
- glucoză 50 mM 8. Tampon TE
3. Soluţia II - Tris HCl 10 mM
- NaOH 0,2 N - EDTA 1 mM, pH 8.0
- SDS 1%
 Mod de lucru:
1. Bacteriile se cultivă în bulion LB timp de 18 - 24 ore la 37oC, cu agitare.
2. Pentru obținerea sedimentului celular, se centrifughează 1,5 – 2 ml cultură
bacteriană (8 min. la 10.000 rpm).

IMPORTANT! Pentru a avea o cantitate suficientă de sediment, după

centrifugare se îndepărtează supernatantul și se repetă operația.

ATENȚIE! În funcție de cantitatea de sediment se stabilește volumul de soluție I

(TEG + lizozim 2 - 5 mg/ml) și, în funcție de soluția I, se stabilesc și volumele
celorlalte soluții, astfel încât să se respecte raportul sol. I : sol. II : sol. III =
1 : 2 : 1,5
3. Pentru distrugerea peretelui celular, sedimentul celular rezultat este reluat în
150 µl soluţie I, care conţine lizozim la o concentraţie ce variază în funcţie de
specia bacteriană utilizată (2 - 5 mg/ml) şi se incubează 10 - 15 min. la 37oC
4. Pentru realizarea lizei alcaline, se adaugă 300 µl soluţie II, preparată înainte de
utilizare, şi se incubează încă 10 – 15 min. la 37oC.

ATENȚIE! Este foarte important ca soluția II să aibă pH ≥ 12,5

5. Amestecul este neutralizat prin adăugarea a 225 µl soluţie III rece; se agită uşor
prin răsturnare şi se menţine pe gheaţă încă 10 min.
6. Resturile celulare şi ADN cromosomal se depun prin centrifugare la rece, la
12.000 rpm – 12 min.
7. La supernatantul obținut se adaugă 1 volum egal de amestec
fenol:cloroform:alcool izoamilic (25:24:1 v/v) și se agită energic 5 min.
8. Amestecul se centrifughează 8 min. la 8.000 rpm și se reia cu grijă faza apoasă.
9. ADN plasmidial se precipită cu 0,7 volume de alcool izopropilic și este depus
prin centrifugare, la 15.000 rpm - 20 min.

IMPORTANT! Opțional, se poate realiza spălarea ADN plasmidial cu etanol

70%.

10. În final, ADN plasmidial recuperat este reluat într-un volum mic de tampon
TE.