ERITROPOIEZA

DR. CRISTINA MAMBET

 ERITROPOIEZA
Formarea de eritrocite în măduva osoasă

Fiziologic: 2 - 4 X 109 eritrocite/kg/zi

STADII

• Angajarea CSH în diferențierea eritroidă

(factori de transcripție, micro-ARN-uri)

• Faza precoce EPO-independentă

• Faza tardivă EPO-dependentă

MODELUL “ARBORELUI BIFURCAT” AL HEMATOPOIEZEI
 PMP ȘI PMC
PMP- Progenitorii multipotenți

Lin- Sca-1+ Kit+ CD90 (Thy1)- Flk2+ CD150- CD105- CD229-

Primii progenitori angajați – fără capacitate de autoreînnoire

Pe medii semisolide formează colonii ale unor linii hematopoietice

multiple

PMC- Progenitorii mieloizi comuni

Lin- Sca-1- Kit+ FcγRint CD34+

Generează toate liniile mieloide

DIFERENȚIEREA CELULELOR ERITROIDE
 PME ȘI PROGENITORII ERITROIZI

PME - Progenitorii megakariocitari și eritroizi

IL-7Rα− Lin− Kit+ Sca-1− CD34− FcγR-

Progenitori bipotenți

Progenitorii eritroizi angajați

- Generează prin proliferare și diferențiere eritroblaștii

- Au capacitatea de a forma colonii eritroide (eritroblaști

hemoglobinizați) pe medii semisolide sub influența EPO

- 2 tipuri: BFU-E și CFU-E

 BFU-E
▪ Unități formatoare de colonii eritroide de tip “burst”

▪ Proliferează lent – după 14 zile în cultură → clustere de

colonii cu 500-40 000 eritroblasti hemoglobinizați →
diferențiere în CFU-E

▪ Factori care controlează proliferarea BFU-E

+ EPO IL-3 IL-6 SCF GM-CSF glucocorticoizi

- TGF-beta, TNF-alfa, interferon gama

▪ Stadiile precoce de proliferare BFU-E sunt EPO-

independente (depind de IL-3!)
 CFU-E

▪ Se divid mult mai repede vs BFU-E → după 5-8 zile

colonii cu 5-32 celule hemoglobinizate

▪ Nivelul de EPO circulant determină mărimea

compartimentului CFU-E (expresie ↑ de EPOR)

▪ În absența EPO → apoptoza CFU-E

▪ Exprimă c-kit, receptori pentru transferină (CD71) și

CD24
 PRECURSORII ERITROIZI
▪ Cea mai imatură celulă este proeritroblastul

▪ În cursul maturării ↓ treptat dimensiunile celulei și expresia

EPOR

▪ Maturarea citoplasmei → modificări de culoare la colorațiile de

tip Giemsa: de la albastru intens (eritroblast bazofil cu un
conținut ↑ de ARN) la culoarea roșie dată de Hb

▪ Maturarea nucleului → dispariția nucleolului și condensarea

cromatinei → expulzia nucleului

▪ Din stadiu de proeritroblast → câteva diviziuni celulare → ↑

expresia BCL-xL (genă antiapoptotică) → ↑ acumularea de Fe și
sinteza de Hb (proces dependent de GATA-1)
 PROERITROBLAST
▪ Celulă de talie medie-mare (14-19 µm)

▪ Nucleu ≈ 80% din celulă

▪ Nucleoli proeminenți

▪ Citoplasmă mai omogenă vs mieloblast și limfoblast, uneori cu

aspect granular

▪ Zonă mică palidă în citoplasmă perinuclear → aparat Golgi

▪ Cantitate ↓↓ de Hb (nu se vizualizează la microscop)

▪ Exprimă EPOR, CD71, Ter119 (Ly-76) recunoaște o moleculă

asociată cu glicoforina A
 ERITROBLAST BAZOFIL

▪ Similar cu proeritroblastul dar de talie

mai mică (12-17 µm)

▪ Fără nucleoli vizibili

▪ Începe condensarea cromatinei

▪ Citoplasmă intens bazofilă (ribozomi în nr. maxim)

▪ Cantitate ↓↓ de Hb (nu se vizualizează la microscop)

▪ Expresie ↑CD71, Ter119

 ERITROBLAST POLICROMATOFIL

▪ 12-15 µm

▪ Nucleu mai mic

▪ Cromatină mai condensată, cu mase neregulate, fără nucleoli

▪ Încărcare cu Hb acidofilă, ↓ nr. ribozomi

▪ Expresie medie CD71, expresie ↑ Ter119

 ERITROBLAST OXIFIL

▪ 8-12 µm

▪ Degenerescență picnotică a nucleului

▪ Cromatină intens condensată

▪ Încărcare cu Hb aproape completă

▪ Expresie ↓ CD71, expresie ↑ Ter119

 RETICULOCIT
▪ Rezultă după expulzarea nucleului

▪ Aprox. cu 20% mai mare decât

eritrocitul matur

▪ Se maturizează în circulație 1-2 zile

după ce părăsește măduva osoasă

▪ Conține ribozomi reziduali,

mitocondrii și aparat Golgi

▪ Frotiu Giemsa: macrocite

policromatofile

▪ Frotiu cu colorații supravitale

(albastru de crezil briliant sau
albastru de metilen) – material reticular albastru (poliribozomi)
 ERITROCIT MATUR

▪ Rezultă în urma maturării reticulocitului: dispar mitocondriile

și ribozomii, se produc modificări ale membranei cu pierderea
a 10 - 20% din suprafața celulară → eritrocit biconcav

▪ 6-8 µm

▪ Durată de viață 120 zile

▪ Frotiu Giemsa: celule rotunde de

culoare roșie-portocalie, cu o paloare centrală ce
ocupă ≈ 1/3 din diamterul celulei
 ERITROPOIETINA (EPO)

▪ Hormon glicoproteic produs de rinichi

▪ Hipoxia tisulară = stimul fundamental pentru eritropoieză

▪ Receptorii tisulari pentru O2 (sensori O2) localizați în rinichi

▪ Producția de EPO este indusă de vasoconstricția arterei renale

▪ Producția EPO este reglată de HIF (hypoxia-inducible factor)

 RECEPTORUL EPO (EPOR)
▪ EPOR - împreună cu ligandul său EPO - este responsabil pentru
supraviețuirea, proliferarea și diferențierea progenitorilor eritroizi.

▪ Receptorul este localizat la suprafața celulei și are o structură

dimerică preformată ce suferă modificări conformaționale specifice în
urma atașării ligandului

▪ Anumite reziduuri de aminoacizi din domeniul transmembranar

mențin într-o stare inactivă dimerul ce nu are ligandul atașat.

▪ Dimerizarea receptorul nu este suficientă pentru activarea EPOR, în

schimb orientarea impusă dimerilor EPOR prin atașarea ligandului
are un rol esențial.

▪ EPOR este asociat cu tirozinkinaza JAK2 în porțiunea citoplasmatică

EPOR
MECANISMUL DE SEMNALIZARE EPOR
▪ Atașarea EPO de EPOR declanșează în mod caracteristic cascade de
semnalizare ce includ atât calea JAK-STAT cât și căile
fosfatidilinozitol-3-kinazei (engl., phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)
și protein-kinazei activate de mitogeni (engl., mitogen-activated
protein kinase, MAPK) ce sunt dependente, de asemenea, de activarea
kinazelor JAK.

▪ Se produce juxtapunerea și trans-fosforilarea (la nivelul reziduurilor

de tirozină Y1007/1008) a două tirozinkinaze JAK asociate →
fosforilarea reziduurile de tirozină (Y) din domeniului citoplasmatic al
receptorului → se formează situsuri de legare pentru proteinele
citoplasmatice: STAT (signal transducer and activator of transcription
→ fosforilare STAT, homodimerizare și translocare în nucleu →
transcripția genelor țintă implicate în supraviețuirea, proliferarea și
diferențierea celulelor eritroide (de exemplu, BCL-xL)
 TESTUL DE FORMARE A COLONIILOR
ERITROIDE

▪ Capacitatea de proliferare și diferențiere a progenitorilor

hematopoietici dintr-o probă, în prezența sau absența de
citokine

▪ Mediu de cultura semisolid Methocult H4100 (Stem Cell

Technology) ce contine 2.6% metilceluloza in mediu
Dulbecco modificat de Iscove (IMDM)

▪ Mediul va fi suplimentat cu ser bovin fetal (FBS),

albumina serica bovina, 1 ml L-glutamina si 200 µl β-
mercaptoetanol, distribuit in tuburi de 4 ml si mentinut la -
20°C pana in momentul utilizarii.
TESTUL DE FORMARE A COLONIILOR
ERITROIDE

Prepararea suspensiei de celule prin diluarea celulelor CD34+ cu

mediu IMDM +2% FBS la o concentrație 5 x 103/ml (10x)
 TESTUL DE FORMARE A COLONIILOR
ERITROIDE

Amestecarea celulelor CD34+ cu mediu, prin adaugarea a 0.4 ml

suspensie de celule într-un tub cu 4 ml mediu, vortexarea viguroasă
și menținerea acestuia la temperatura camerei 5 minute, pentru a
permite ridicarea la suprafață a bulelor de aer din tub
 TESTUL DE FORMARE A COLONIILOR
ERITROIDE

Distribuirea amestecului de celule și mediu Methocult în 2 plăci de

cultură cu diametrul de 35 mm (1.1 ml pentru fiecare placă,
asigurând însămânțarea a 500 celule CD34+/placă) cu ajutorul unei
seringi la care este atașat un ac 16G cu vârf bont
 TESTUL DE FORMARE A COLONIILOR
ERITROIDE

Distribuirea amestecului de celule și mediu Methocult

în 2 plăci de cultură cu diametrul de 35 mm (1.1 ml
pentru fiecare placă, asigurând însămânțarea a 500
celule CD34+/placă) cu ajutorul unei seringi la care este
atașat un ac 16G cu vârf bont

În placa nr. 1 nu s-au adaugat citokine si factori de

crestere
În placa nr. 2 s-au adaugat 50 µl interleukina-3 (IL-3,
adusă la o concentrație 50 ng/ml), 20 µl factor al celulei
stem (SCF, 20 ng/ml) și 10 µl eritropoietina (EPO, 10
ng/ml)
 TESTUL DE FORMARE A COLONIILOR
ERITROIDE
Plasarea plăcilor de cultură de 35 mm într-o placă Petri
de 100 mm și adăugarea a încă 2 plăci de 35 mm umplute
cu 3 ml apă distilată pentru asigurarea umiditatii

Acoperirea plăcii Petri cu capacul corespunzător și

incubarea acesteia la 37°C, în atmosferă de CO2 5% și
umiditate ≥ 95%, timp de 14 zile.

Numărarea coloniilor din fiecare placă și evaluarea

morfologiei acestora prin examinarea la microscopul
optic inversat cu obiectivul 20x

Colonii endogene – rezultă în absența citokinelor

(caracteristic policitemiei vera PV)
TESTUL DE FORMARE A COLONIILOR
ERITROIDE

Colonie endogenă BFU-E (obiectiv 20x)

TESTUL DE FORMARE A COLONIILOR
ERITROIDE

Colonie BFU-E după stimulare cu EPO (obiectiv 20x)

TESTUL DE FORMARE A COLONIILOR
ERITROIDE

Colonii CFU-E endogene (obiectiv 20x)

TESTUL DE FORMARE A COLONIILOR
ERITROIDE

Colonie CFU-E după stimulare cu EPO (obiectiv 20x)