DIAGNOSTICUL DE LABORATOR

ÎN NEOPLASMELE MIELOPROLIFERATIVE

BCR-ABL1 NEGATIVE

DR. CRISTINA MAMBET

NEOPLAZII MIELOIDE – CLASIFICARE OMS 2016
1. Neoplasme mieloproliferative (NMP)
- clasice: LMC, NMP BCR-ABL1 negative
- non-clasice: NMP neclasificabile, leucemia cronică cu neutrofile,
leucemia cronica cu eozinofile

2. Mastocitoza

3. Neoplazii mieloide/limfoide asociate cu eozinofilie și anomalii genetice

precizate

4. NMP/sindroame mielodisplazice (SMD)

5. SMD

6. Leucemii acute mieloide (LAM)

 FENOTIPURI CLASICE NMP
■ PV - eritrocitoză asociată frecvent cu trombocitoză și/sau leucocitoză

Criterii OMS 2016: Hb >16 g/dL (femei), Hb>16.5 (bărbați)

Ht > 48% (femei) Ht >49% (bărbați)

MUTAȚII DRIVER
JAK2 V617F – prevalență 95-97%
JAK2 exon 12

Biochimic: EPO serică ↓ - > 85% din cazuri

- debut: asimptomatic/ semne de afectare a microcirculației/disconfort

abdominal/episoade trombotice

BMO: panmieloză (hiperplazie trilineală)

- evaluarea gradului de fibroză

Evoluție: progresie către MF secundară (10-30%)

conversie în LAMs (2-5%)
PV – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC

Eritrocitoză
PV – BIOPSIE DE MĂDUVĂ OSOASĂ

Panmieloză
 FENOTIPURI CLASICE NMP
■ TE – trombocitoză PLT > 450 000/µL

- Excluderea trombocitozei reactive (infecții, inflamații, tumori solide, anemia

feriprivă)

MUTAȚII DRIVER
JAK2 V617F
CALR exon 9
MPL exon 10
TE “triplu negativă” (absența mutațiilor în cele 3 gene driver)

- Debut frecvent asimptomatic

- Risc mai scăzut de complicații trombotice comparativ cu PV
- Trombocitoza marcată – risc ↑ de boală von Willebrand dobândită

BMO: hiperplazie megakariocitară

- fibroză de obicei absentă

Evoluție: progresie către MF secundară (5-20%)

conversie în LAMs (1%)
TE – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC

Trombocitoză
TE – BIOPSIE DE MĂDUVĂ OSOASĂ

Hiperplazie megakariocitară fără atipii

 FENOTIPURI CLASICE NMP
■ MFP – fenotipul NMP cel mai sever

- afecțiune heterogenă: mieloproliferare clonală, expresie anormală de

citokine, fibroză a măduvei osoase, anemie, splenomegalie, hematopoieză
extramedulară, simptome constituționale și o durată de supraviețuire mai
mică comparativ cu TE și PV

MUTAȚII DRIVER
JAK2 V617F
CALR exon 9
MPL exon 10
MFP “triplu negativă”

- Debut frecvent simptomatic

- Progresie către grade avansate de MF și osteoscleroză
- Conversie în LAMs (10%)
 FENOTIPURI MFP

■ pre- MFP – MFP în stadiu prefibrotic

- Se confundă adesea cu TE!
- Prognostic mai puțin favorabil comparativ cu TE

BMO: - proliferare și atipie megakariocitară

- celularitate MO ↑
- proliferare granulocitară ↑
- adesea, eritropoieză ↓
- fibroză MF-0 sau MF-1

■ MFP în stadiu fibrotic - tablou leucoeritroblastic, LDH ↑

- pancitopenie

BMO: - proliferare și atipie megakariocitară

- fibroză MF ≥ 2
 MFP ÎN STADIU FIBROTIC – FROTIU DE
SÂNGE PERIFERIC
Tablou leucoeritroblastic pe frotiul de sânge periferic
(deviere la stga a formulei leucocitare până la
mieloblast + eritroblaști)

Bazofilie – frecventă; atunci când este accentuată –

element de prognostic nefavorabil

Poikilocitoză cu dacriocite

Anizocitoză trombocitară marcată –

macrotrombocite, megalotrombocite, nuclei de
megakariocit
MFP – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC

Dacriocit
MFP – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC

Nucleu de megakariocit
MFP – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC

Megalotrombocit
MFP – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC

Mieloblast, eritroblast
MFP – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC

Mieloblast
MFP – BIOPSIE DE MĂDUVĂ OSOASĂ

Megakariocite atipice
MFP – BIOPSIE DE MĂDUVĂ OSOASĂ

Impregnare argentică (Gomori) – fibroză reticulinică

PROGRESIA CĂTRE MIELOFIBROZĂ (MF) SECUNDARĂ
■ MF post TE - risc cumulativ de 0.7-3% la 10 ani, 4-11% la 15 ani și
19.9% la 20 ani

- fibroză MF ≥ 2
- ↓ cu ≥ 2 g/dL din valoarea inițială a Hb
- tablou leucoeritroblastic în sângele periferic
- splenomegalie de novo sau o ↑ a dimensiunilor splinei cu ≥ 5 cm
- ↑ LDH
- semne constituționale

■ MF post-PV – risc cumulativ de MF post-PV 4.9-6% la 10 ani, 6-14%

la 15 ani și 26% la 20 ani

- fibroză MF ≥ 2
- ↓ cu ≥ 2 g/dL din valoarea inițială a Hb
- tablou leucoeritroblastic în sângele periferic
- splenomegalie de novo sau o ↑ a dimensiunilor splinei cu ≥ 5 cm
- ↑ LDH
- semne constituționale
 PROGRESIA CĂTRE LAMs

■ LAM post-TE - risc 1% la 10 ani

■ LAM post-PV – risc cumulativ de 2.3% la 10 ani și

5.5% la 15 ani

■ LAM post-MFP – risc 10%

PROFILUL MOLECULAR AL NMP BCR-ABL1 NEGATIVE

■ MUTAȚII „NMP-driver” → mieloproliferarea clonală

MUTAȚII JAK2 - exonul 14: JAK2 V617F; exonul 12

MUTAȚII MPL - exonul 10

MUTAȚII CALR - exonul 9

■ MUTAȚII „non-NMP-driver” → modificarea evoluției bolii

- în principal, mutații ale factorilor de control epigenetic

- întâlnite și în alte neoplazii mieloide (SMD, LAM)
ELEMENT PATOGENIC CENTRAL ÎN NMP:
ACTIVAREA CONSTITUTIVĂ JAK-STAT
 MUTAȚIILE JAK2
MUTAȚIA JAK2 V617F

→ mutație somatică de tip „activator” întâlnită în toate cele 3 fenotipuri NMP :

>95% din PV și 50 - 60% din TE și MFP

→ se mai poate asocia cu ARSI-T și rar cu LMMC și LAM

→ a mai fost identificată în pacienți cu tromboză de vv splahnice și sindromul Budd-Chiari,

precum și la cei cu tromboze de vv cerebrale, în absența unui NMP clinic manifest

→ a fost descrisă și în populația generală (0.1-0.2%)

→ întâlnită și în CHIP (hematopoieza clonală cu potențial nedeterminat)

→ frecvența alelei mutante variază în funcție de subtipul NMP: scăzută în TE (în jur de
25%), mai mare în PV (frecvent >50%, status homozigot) și apropiată de 100% în MF
secundară TE și PV

MUTAȚIILE JAK2 exon 12

→ inserții, deleții mici, de obicei heterozigote, asociate cu majoritatea cazurilor de PV JAK2

V617F negative
 MUTAȚIILE MPL

- Mutații de tip activator întâlnite exclusiv în TE (2-3%) și MFP (3-5%)

- 2 categorii de mutații:
● W515 L/K/R/A – predominante, de obicei heterozigote
● S505N – poate fi și ereditară
 MUTAȚIILE CALR

- Responsabile de cele mai multe cazuri de TE și MFP negative pentru mutațiile

JAK2 și MPL
- Conferă o funcție neomorfică proteinei CALR mutante →rezultat activarea MPL
- Decalează cu 1 pb cadrul de citire
- Peste 50 mutații diferite
- 2 variante predominante: del52 (tip 1) și ins5 (tip2)
- Restul sunt variante „tip 1-like” și „tip 2-like”
DETECȚIA JAK2 V617F PRIN ARMS-PCR
 CUANTFICAREA ALELEI MUTANTE JAK2 V617F
- Un amestec de primeri specifici și o sondă oligonucleotidică dublu marcată pentru
fiecare alelă JAK2 → 2 reacții PCR separate
- Cuantificare: 4 standarde, sub forma unor plasmide în diluții succesive (50, 500,
5000, 50 000 copii alelice/μL), pentru fiecare tip de alelă JAK2
- 2 curbe standard: se calculeaza nr. copii pentru alelă
- V617F% = nr. copii alelă mutantă /nr. total copii JAK2 (alela mutantă + alelă WT)
 DETECȚIA MUTAȚIILOR MPL W515K/L PRIN REAL-TIME PCR

- Se utilizează 2 sonde dublu marcate R, Q – pentru alela mutantă și alela WT

- Fiecare sondă este marcată cu un fluorocrom diferit – FAM și VIC
- Se va calcula raportul semnalelor fluorescente emise de fluorocromii FAM și VIC
- Valoarea raportului va fi comparată cu cea a standardului de 1.5% alelă mutantă
- Valorile > valoarea standardului sunt considerate pozitive
- Grafic de discriminare alelică
 DETECȚIE MUTAȚII CALR PRIN SECVENȚIERE SANGER

Cromatogramă cu secvență CALR del52 (I) aliniată la secvența de referință (II)

Cromatogramă cu secvențe CALR ins5 (II, III) aliniate la secvența de referință (I)
 LEUCEMIA CRONICĂ CU NEUTROFILE

- NMP BCR-ABL1 negativ rar

- Leucocitoza peste 25 000/µl

- Proliferare persistentă a neutrofilelor mature – nesegmentate și segmentate

(>80%)

- Precursori neutrofilici < 10%, blaști f rari

- Absența bazofiliei, monocitozei

- BMO: hiperplazie granulocitară

- Splenomegalie

- Mutații oncogenice ale genei CSF3R (predominant CSF3R T618I)